Protokoll för SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivering med ultraljudsbehandling

Hielscher VialTweeter är en unik ultraljudsenhet för multiprovberedning, som används för att inaktivera coronaviruset SARS-COV-2. VialTweeter gör det möjligt att förbereda upp till 10 provflaskor samtidigt och är därmed den idealiska enheten för massprovbearbetning.

Inaktivering av SARS-CoV-2 Coronavirus med VialTweeter

Efter att ha tagit bort fixeringsmedlet tvättades monolager tre gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innan cellerna skrapades till 1 ml MEM/5% FBS och sonikerades (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder av vid 100 % effekt och amplitud) med hjälp av Hielscher ultraljudsprocessor UP200St med VialTweeter bifogad fil. Supernatanterna klarades genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter. 

Läs hela protokollet här för inaktiveringen av SARS-CoV-2 coronavirus av Welch et al. (2020) nedan:

Celler och virus

Vero E6-celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) odlades i modifierat Eagle's minimum essential medium (MEM) kompletterat med 10 % (v/v) fetalt kalvserum (FCS). Viruset som användes var SARS-CoV-2-stammen hCOV-19/England/2/2020, isolerad med PHE från det första patientklustret i Storbritannien den 29/01/2020. Detta virus erhölls vid passage 1 och användes för inaktiveringsstudier vid passage 2 eller 3.
För reagenser och kemikalier som används för SARS-CoV-2-inaktivering samt avlägsnande av reagenscytotoxicitet, se den vetenskapliga rapporten från Welch et al. (2020).

Inaktivering av virus med hjälp av rengöringsmedel – SARS-CoV-2 protokoll för inaktivering av coronavirus av Welch et al. 2020

Inaktivering av SARS-CoV-2

För kommersiella produkter ska viruspreparat (vävnadsodlingsvätska, titrar från 1 × 10⁶ till 1 × 10⁸ PFU/ml) behandlades i tre exemplar med reagenser i de koncentrationer och under de kontakttider som rekommenderas i tillverkarens bruksanvisningar, i förekommande fall, eller för koncentrationer och tider som specifikt begärts av provningslaboratorier. Om tillverkaren angav ett intervall för koncentrationer testades det lägsta förhållandet mellan produkten och provet (dvs. den lägsta rekommenderade koncentrationen av testprodukten). Reagenser för provtransportrör testades med ett förhållande mellan en volym vävnadsodlingsvätska och tio volymer reagens, såvida inte ett volymförhållande mellan provvätska och reagens specificerades av tillverkaren. Rengöringsmedel, fixeringsmedel och lösningsmedel testades vid de angivna koncentrationerna för de angivna tiderna. Alla inaktiveringssteg utfördes vid rumstemperatur (18 – 25 °C). För testning av alternativa provtyper spikades viruset in i den angivna provmatrisen i förhållandet 1:9 och behandlades sedan med testreagenser enligt ovan. Alla experiment inkluderade provexemplar behandlade med tre exemplar med motsvarande volym PBS i stället för testreagens. Omedelbart efter den erforderliga kontakttiden bearbetades 1 ml behandlat prov med hjälp av den lämpligt valda filtreringsmatrisen. Borttagning av reagens för inaktiveringstestning utfördes i ett större spinnkolonnformat med hjälp av Pierce 4 ml spinnkolonner för borttagning av rengöringsmedel (Thermo Fisher), eller genom att fylla tomma Pierce 10 ml centrifugkolonner (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20 för att ge 4 ml packade pärlor/harts. För rening med Amicon-filter renades 2 × 500 μl prover med hjälp av två centrifugalfilter med den metod som tidigare beskrivits och poolades sedan tillsammans. För formaldehyd och formaldehyd med borttagning av glutaraldehyd användes ett filter med 1× 500 μl provvolym, återsuspenderat efter bearbetning i 500 μl PBS och tillsatt till 400 ul MEM/5 % FBS. För inaktivering av infekterade enlager, 12.5 cm² kolvar med Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/kolv i 2,5 ml MEM/5 % FBS) infekterades vid MOI 0,001 och inkuberades vid 37 °C/5 % CO₂ i 24 timmar. Supernatanten avlägsnades och cellerna fixerades med hjälp av 5 ml formaldehyd, eller formaldehyd och glutaraldehyd vid rumstemperatur i 15 eller 60 minuter. Fixeringsmedlet togs bort och monolager tvättades tre gånger med PBS innan cellerna skrapades in i 1 ml MEM/5% FBS och sonikerades (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder av vid 100 % effekt och amplitud) med hjälp av en UP200St med VialTweeter-fäste (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanterna klarades genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter.

Detaljer om reagenset som används för inaktivering av SARS-CoV-2 coronavirus med ultraljudet VialTweeter enligt protokollet av Welch et al. 2020

Det fullständiga protokollet, inklusive användningen av Hielscher VialTweeter, finns här:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikerade ultraljudsdismembratorer och cellstörande ämnen

Multi-sample ultraljudsapparaten VialTweeter är bara en av många ultraljudslösningar för provberedning i biologiska, biokemiska och kliniska laboratorier. Hielscher Ultrasonics erbjuder den perfekta ultraljudsdismembrator för din applikation, t.ex. celllys, cellextraktion, vävnadshomogenisering, lysatlösning, upplösning, provavgasning etc.
Låt oss veta hur många prover du måste bearbeta per timme och dag, om du föredrar direkt eller indirekt ultraljudsbehandling och vad målet med ultraljudsprovbehandlingen är. Vi kommer att rekommendera dig den mest lämpliga ultraljudsenheten för din dagliga arbetsrutin!
Hielscher Ultrasonics digitala ultraljudsprocessorer är utrustade med smart programvara, automatisk dataregistrering, enkla förinställda alternativ för temperaturkontroll, ultraljudsbehandling varaktighet, cykel / pulsläge samt provbelysning och webbläsarens fjärrkontroll. Vi strävar efter att göra våra ultraljudsenheter så smarta som möjligt så att din forskning och arbetsrutin blir så bekväm och framgångsrik som möjligt.
Klicka här för att hitta fler tillämpningar, inklusive protokoll för ultraljudsprovberedning med VialTweeter!