Protokoll för SARS-CoV-2 Coronavirus inaktivering med ultraljudsbehandling

Hielscher VialTweeter är en unik ultraljud multi-provberedning enhet, som används för att inaktivera coronaviruset SARS-COV-2. Den VialTweeter tillåta att förbereda upp till 10 prov injektionsflaska samtidigt och är därigenom den idealiska enheten för massa prov bearbetning.

Inaktivering av SARS-CoV-2 Coronavirus med VialTweeteren

Efter att ha tagit bort fixativet, monolayers tvättades tre gånger med fosfat-buffrad saltlösning (PBS) innan skrapa celler i 1mL MEM/ 5% FBS och sonicated (3 × 10 andra på, 10 sekunder av vid 100% effekt och amplitud) med hjälp av Hielscher ultraljud processor UP200St med VialTweeter Bifogad fil. Supernatanter klargjordes genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter. 

Läs hela protokollet här för SARS-CoV-2 coronavirus inaktivering av Welch et al. (2020) nedan:

Celler och Virus

Vero E6-celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) var odlade i modifierade Eagles minsta väsentliga medium (MEM) kompletteras med 10% (v/v) fetala kalv serum (FCS). Virus som används var SARS-CoV-2 stam hCOV-19/England/2/2020, isolerats av PHE från den första patienten klustret i Storbritannien den 29/01/2020. Detta virus erhölls vid passage 1 och används för inaktivering studier vid passage 2 eller 3.
För reagens och kemikalier som används för SARS-CoV-2 inaktivering samt avlägsnande av reagenscyttoxicitet vänligen se den vetenskapliga rapporten från Welch et al. (2020).

Virusinaktivering genom tvättmedel – SARS-CoV-2 Coronavirus inaktiveringsprotokoll av Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktivering

För kommersiella produkter, viruspreparat (vävnadskulturvätska, titers som sträcker sig från 1 × 10⁶ till 1 × 10⁸ PFU/ml) behandlades i tre exemplar med reagens i koncentrationer och för kontakttider som rekommenderas i tillverkarnas bruksanvisning, där sådan finns, eller för koncentrationer och tider som särskilt efterfrågas av testlaboratorier. Där ett intervall av koncentrationer gavs av tillverkaren, testades det lägsta förhållandet mellan produkt och prov (dvs. lägsta rekommenderade koncentration av testprodukt). Preparattransportrörsreagenser testades med hjälp av ett förhållande mellan en volym vävnadsodlingsvätska till tio volymer reagens, om inte ett volymförhållande mellan provvätska och reagens angavs av tillverkaren. Rengöringsmedel, fixeringsmedel och lösningsmedel testades vid de angivna koncentrationerna för de angivna tiderna. Alla inaktiveringssteg utfördes i omgivnings rumstemperatur (18 – 25°C). För testning av alternativa provtyper spetsades virus i den angivna provmatrisen vid förhållandet 1:9, därefter behandlades med testreagens enligt ovan. Alla experiment inkluderade tre exemplarkontroll mock-behandlade prover med en motsvarande volym PBS i stället för testreagens. Omedelbart efter den erforderliga kontakttiden bearbetades 1mL behandlat prov med hjälp av den lämpligt valda filtreringsmatrisen. Reagens borttagning för inaktivering testning utfördes i en större spin kolumn format med pierce 4mL rengöringsmedel borttagning Spin Kolumner (Thermo Fisher), eller genom att fylla tomma Pierce 10mL kapacitet centrifug kolumner (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Pärlor, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20 att ge 4mL packade pärlor / harts. För rening med användning av Amicon-filter renades 2 × 500μl prover med hjälp av två centrifugalfilter med den metod som tidigare beskrivits, sedan sammanfördes tillsammans. För formaldehyd och formaldehyd med glutaraldehyd bort, användes ett filter med 1× 500μl provvolym, återanvänds efter bearbetning i 500μl PBS, och läggas till 400ul MEM/5% FBS. För inaktivering av infekterade monolayers, 12,5 cm² kolvar av Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/kolv i 2,5mL MEM/5% FBS) smittades vid MOI 0,001 och inkuberades vid 37°C/5% CO₂ i 24 timmar. Supernatant togs bort, och celler fast med hjälp av 5mL av formaldehyd, eller formaldehyd och glutaraldehyd vid rumstemperatur i 15 eller 60 minuter. Fixativet togs bort, och monolayers tvättas tre gånger med PBS innan skrapa celler i 1mL MEM/5% FBS och sonicated (3 × 10 andra på, 10 sekunder av vid 100% effekt och amplitud) med hjälp av en UP200St med VialTweeter fastsättning (Hielscher Ultraljud Technology). Supernatanter klargjordes genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter.

Uppgifter om reagensen som används för SARS-CoV-2 coronavirus inaktivering med ultraljuds-VialTweeter enligt protokollet av Welch et al. 2020

Det fullständiga protokollet inklusive användning av Hielscher VialTweeter finns här:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofistikerade Ultraljud Dismembrators och Störceller Cell

Den multi-sample ultraljudsdonator VialTweeter är bara en av många ultraljud lösningar för provberedning i biologiska, biokemiska och kliniska laboratorier. Hielscher Ultrasonics erbjuder den idealiska ultraljud dismembrator för din ansökan, t ex cell lys, cell utvinning, vävnad homogenisering, lysate solubilisering, upplösning, prov avgasning etc.
Låt oss veta hur många prover du har att bearbeta per timme och dag, om du föredrar direkt eller indirekt ultraljudsbehandling och vad målet för ultraljud provbehandling är. Vi kommer att rekommendera dig den mest lämpliga ultraljudsenheten för din dagliga arbetsrutin!
Hielscher Ultrasonics digitala ultraljud processorer är utrustade med smart programvara, automatisk datainspelning, enkel förinställning alternativ för temperaturkontroll, ultraljudsbehandling varaktighet, cykel /puls läge samt prov belysning och webbläsare fjärrkontroll. Vi strävar efter att göra våra ultraljudsenheter så smarta som möjligt så att din forskning och arbetsrutin blir så bekväm och framgångsrik som möjligt.
Klicka här, för att hitta fler applikationer inklusive protokoll av ultraljud prov beredning med Den VialTweeter!