Protokoll för inaktivering av coronaviruset SARS-CoV-2 med ultraljudsbehandling

Hielscher VialTweeter är en unik ultraljudsenhet för beredning av flera prover som används för att inaktivera coronaviruset SARS-COV-2. VialTweeter möjliggör samtidig beredning av upp till 10 provflaskor och är därmed den idealiska enheten för bearbetning av stora provmängder.

Inaktivering av coronaviruset SARS-CoV-2 med VialTweeter

Efter att fixeringsmedlet avlägsnats tvättades monolagren tre gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), varefter cellerna skrapades loss i 1mL MEM/5% FBS och ultraljudsbehandlades (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder av vid 100% effekt och amplitud) med Hielschers ultraljudsprocessor UP200St med VialTweeter -tillsats. Supernatanterna klarades genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter. 

Läs hela protokollet för inaktivering av coronaviruset SARS-CoV-2 av Welch et al. (2020) nedan:

Celler och virus

Vero E6-celler (Vero C1008; ATCC CRL-1586) odlades i modifierat Eagles minimala essentiella medium (MEM) kompletterat med 10% (v/v) fetalt kalvserum (FCS). Det virus som användes var SARS-CoV-2-stammen hCOV-19/England/2/2020, som isolerades av PHE från det första patientklustret i Storbritannien den 29/01/2020. Detta virus erhölls vid passage 1 och användes för inaktiveringsstudier vid passage 2 eller 3.
För reagenser och kemikalier som användes för inaktivering av SARS-CoV-2 samt avlägsnande av reagensernas cytotoxicitet, se den vetenskapliga rapporten av Welch et al. (2020).

Virusinaktivering med detergenter – protokoll för inaktivering av coronaviruset SARS-CoV-2 av Welch et al. 2020

Inaktivering av SARS-CoV-2


För kommersiella produkter behandlades viruspreparationer (vävnadsodlingsvätska, titrar från 1 × 10⁶ till 1 × 10⁸ PFU/ml) i triplikat med reagenser vid de koncentrationer och under de kontakttider som rekommenderades i tillverkarens bruksanvisningar, där sådana fanns tillgängliga, eller vid koncentrationer och under tider som särskilt begärts av testlaboratorier. När tillverkaren angav ett koncentrationsintervall testades det lägsta förhållandet mellan produkt och prov (dvs. den lägsta rekommenderade koncentrationen av testprodukten). Reagenser för provtransportrör testades med förhållandet en volym vävnadsodlingsvätska till tio volymer reagens, såvida tillverkaren inte hade angett ett volymförhållande mellan provvätska och reagens. Detergenter, fixeringsmedel och lösningsmedel testades vid de angivna koncentrationerna under de angivna tiderna. Alla inaktiveringssteg utfördes vid omgivande rumstemperatur (18 – 25°C). För testning av alternativa provtyper tillsattes virus till den angivna provmatrisen i förhållandet 1:9, varefter den behandlades med testreagenser enligt ovan. Alla försök omfattade skenbehandlade kontrollprover i triplikat med en motsvarande volym PBS i stället för testreagens. Omedelbart efter den erforderliga kontakttiden bearbetades 1mL behandlat prov med den lämpligt valda filtreringsmatrisen. Avlägsnande av reagenser inför inaktiveringstestning utfördes i ett större spinnkolonnformat med Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), eller genom att fylla tomma Pierce-centrifugkolonner med en kapacitet på 10mL (Thermo Fisher) med SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR eller Sephadex LH-20 för att erhålla 4mL packade kulor/harts. Vid rening med Amicon-filter renades 2 × 500μl prover med två centrifugfilter enligt den tidigare beskrivna metoden och slogs sedan samman. För avlägsnande av formaldehyd respektive formaldehyd med glutaraldehyd användes ett filter med en provvolym på 1× 500μl, som efter bearbetningen resuspenderades i 500μl PBS och tillsattes till 400ul MEM/5% FBS. För inaktivering av infekterade monolager, 12,5 cm² odlingsflaskor med Vero E6-celler (2,5 × 10⁶ celler/flaska i 2,5mL MEM/5% FBS) infekterades vid MOI 0,001 och inkuberades vid 37°C/5% CO₂ i 24 timmar. Supernatanterna avlägsnades och cellerna fixerades med 5mL formaldehyd, eller formaldehyd och glutaraldehyd, vid rumstemperatur i 15 eller 60 minuter. Fixeringsmedlet avlägsnades och monolagren tvättades tre gånger med PBS innan cellerna skrapades loss i 1mL MEM/5% FBS och ultraljudsbehandlades (3 × 10 sekunder på, 10 sekunder av vid 100% effekt och amplitud) med en UP200St med VialTweeter-tillsats (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanterna klarades genom centrifugering vid 3000 × g i 10 minuter.


Detaljer om reagenset som används för inaktivering av coronaviruset SARS-CoV-2 med ultraljudsenheten VialTweeter enligt protokollet av Welch et al. 2020

Hela protokollet, inklusive användningen av Hielscher VialTweeter, finns här:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Avancerade ultraljudsdisintegratorer och cellsönderdelare

Ultraljudsenheten VialTweeter för flera prover är bara en av många ultraljudslösningar för provberedning i biologiska, biokemiska och kliniska laboratorier. Hielscher Ultrasonics erbjuder den idealiska ultraljudsdisintegratorn för din tillämpning, t.ex. cellys, cellextraktion, vävnadshomogenisering, solubilisering av lysat, upplösning, avgasning av prover osv.
Berätta för oss hur många prover du behöver bearbeta per timme och dag, om du föredrar direkt eller indirekt ultraljudsbehandling och vad målet med ultraljudsbehandlingen av proverna är. Vi rekommenderar den ultraljudsenhet som är bäst lämpad för ditt dagliga arbete!
Hielscher Ultrasonics digitala ultraljudsprocessorer är utrustade med smart programvara, automatisk dataregistrering, enkla förinställningsmöjligheter för temperaturreglering, ultraljudsbehandlingens varaktighet och cykel-/pulsläge samt provbelysning och fjärrstyrning via webbläsare. Vi strävar efter att göra våra ultraljudsenheter så smarta som möjligt så att din forskning och ditt dagliga arbete blir så smidiga och framgångsrika som möjligt.
Klicka här för fler tillämpningar, inklusive protokoll för provberedning med ultraljud med VialTweeter!