Ultraljud DNA-fragmentering för nästa generations sekvensering

Next Generation Sequencing (NGS) kräver tillförlitlig klippning och fragmentering av genomiskt DNA för att sekvensera genomiska DNA-strängar och för att skapa genombibliotek. Den kontrollerade fragmenteringen av DNA till DNA-fragment är ett viktigt steg i provberedningen som krävs innan DNA:t sekvenseras. Ultraljud har visat sig vara en effektiv och tillförlitlig teknik för DNA-fragmentering av en viss längd. Ultraljuds-DNA-fragmenteringsprotokoll uppnår reproducerbara fragmenteringsresultat. Hielscher ultraljudsapparater är kapabla att producera ett brett spektrum av genomiska DNA-fragment storleksfördelningar, exakt kontrollerbara via driftsparametrarna. Eftersom Hielscher ultraljud DNA-klippningssystem är tillgängliga för enkla och flera injektionsflaskor samt för mikroplattor, blir provberedning mycket effektiv.

Nästa generations sekvensering: Ultraljud DNA-fragmentering för biblioteksförberedelse

För att kunna utföra en nästa generations sekvensering måste de tre grundläggande stegen (1) biblioteksförberedelse, (2) sekvensering och (3) dataanalys utföras. Under biblioteksförberedelsen fragmenteras DNA, sedan repareras (poleras) fragmentändarna genom att lägga till en enda adeninbas och målfragmenten omvandlas till dubbelsträngat DNA. Slutligen fästs så kallade adaptrar genom ligering, PCR eller tagmentation så att den slutliga DNA-produkten kan kvantifieras för sekvensering.
DNA-fragmentering med hjälp av ultraljudsbehandling: Speciellt när kortlästa sekvenseringstekniker som Illumina, som inte kan läsa längre DNA-fragment lätt, måste DNA-bestånden fragmenteras till en viss storlek som kan uppnås på ett tillförlitligt sätt genom ultraljud.
Ultraljud kan användas på ett tillförlitligt sätt för DNA, RNA och kromatinfragmentering.

Nästa generations sekvensering – Förberedelse av bibliotek

Ultraljud DNA-fragmentering används ofta vid framställning av DNA-sekvenseringsbibliotek för nästa generations sekvenseringsplattformar (NGS). Denna teknik används för att bryta ner DNA-molekyler i mindre fragment av ett önskat storleksintervall, vilket underlättar de efterföljande stegen i biblioteksförberedelsen. Ultraljud DNA-fragmentering krävs vanligtvis under biblioteksförberedelsesteget för NGS-arbetsflöden för att fragmentera genomiskt DNA i mindre bitar som är lämpliga för nedströmsbearbetning och sekvensering. Det spelar en avgörande roll för att säkerställa framgången för sekvenseringsexperimentet genom att generera DNA-fragment av lämplig storleksintervall för den specifika sekvenseringsplattform som används.

Nästa generations sekvensering – Processteg:

• Fragmentering av ultraljud DNA: Innan bibliotek byggs är det genomiska DNA:t fragmenterat i mindre, mer hanterbara bitar. Ultraljudsfragmentering innebär att man använder högfrekventa ljudvågor för att skjuva DNA-molekylerna till fragment av önskat storleksintervall. Det här steget är viktigt eftersom det hjälper till att säkerställa att sekvenseringsläsningarna som genereras senare har lämplig längd för den sekvenseringsplattform som används. Storleksintervallet för fragmenten kan justeras baserat på de specifika kraven för sekvenseringsexperimentet.
• Klonal amplifiering med PCR: Efter ultraljudsfragmentering genomgår DNA-fragmenten ändreparation, adapterligering och PCR-amplifiering för att generera de slutliga DNA-sekvenseringsbiblioteken. Dessa steg förbereder de fragmenterade DNA-molekylerna för sekvenseringsprocessen genom att lägga till adaptersekvenser som är nödvändiga för bindning till sekvenseringsplattformen och tillhandahålla primingställen för PCR-amplifiering.
• DNA-sekvensering genom syntes: När sekvenseringsbiblioteken är förberedda börjar processen för DNA-sekvensering genom syntes (SBS). Under SBS bestäms DNA-sekvensen genom sekventiell tillsats av nukleotider till den komplementära strängen. Detta steg involverar cykliska reaktioner av nukleotidinkorporering, avbildning och klyvning, vilket möjliggör bestämning av DNA-sekvensen baserat på de fluorescerande signaler som sänds ut av de inkorporerade nukleotiderna.
• Massivt parallell sekvensering: I det sista steget sekvenseras de spatialt segregerade, amplifierade DNA-mallarna samtidigt på ett massivt parallellt sätt. Denna sekvenseringsmetod med hög genomströmning gör det möjligt att generera miljontals till miljarder sekvenseringsläsningar i en enda sekvenseringskörning, vilket möjliggör effektiv och snabb bestämning av DNA-sekvenser.

Hur fungerar ultraljud DNA-fragmentering?

Ultraljudsbehandling, även känd som akustisk provbehandling, är en allmänt använd metod för att fragmentera DNA. För ultraljuds-DNA-skjuvning utsätts proverna för ultraljudsvågor under kontrollerat tillstånd. Arbetsprincipen för ultraljuds-DNA-fragmentering är baserad på vibrationerna och kavitationen som genereras av ultraljudsvågorna. Skjuvkrafterna som uppstår vid ultraljudskavitation (akustisk) bryter sönder DNA-molekyler med hög molekylvikt. Inställningen av ultraljudsbehandling såsom intensitet (amplitud, varaktighet), pulseringsläge och temperatur möjliggör exakt DNA-fragmentering till en viss önskad längd av DNA-fragment. Medan DNA ofta reduceras till 100 till 600 bp med hjälp av ultraljud, kan längre DNA-fragment på upp till 1300 bp erhållas när mildare ultraljudsförhållanden tillämpas.

Temperaturkontroll för att förhindra DNA-nedbrytning

Den dubbelsträngade molekylära formen av DNA är mycket känslig för förhöjda temperaturer, så att exakt kontroll över temperaturen under provberedningsstegen är en avgörande faktor för tillförlitliga analysresultat.
Oavsett om du använder Hielschers sond ultraljudsapparater, VialTweeter eller UIP400MTP – Kontinuerlig temperaturövervakning och kontroll säkerställs tack vare en pluggbar temperatursensor och programvaran för den smarta enheten. För att hålla temperaturen inom ett visst intervall kan du ställa in en övre och nedre temperaturgräns. Följaktligen, ultrasonicator kommer att pausa så snart denna temperaturgräns överskrids och automatiskt kommer att fortsätta att sonikera när temperaturen har sänkts med en inställd ∆T.
Den sofistikerade programvaran för Hielscher ultraljudsapparater säkerställer tillförlitligt underhåll av idealiska provbehandlingsförhållanden.

Massprov DNA-fragmentering med UIP400MTP Multi-Well Plate ultraljudsapparat

Antalet stickprov inom life science har ökat markant under det senaste decenniet. Detta innebär att ett mycket stort antal prover (t.ex. 384, 1536 eller 3456 brunnar per mikroplatta) måste bearbetas under provberedning och analys under konsekvent lika förhållanden för att erhålla jämförbara och giltiga resultat. Med UIP400MTP följer Hielscher Ultrasonics trenden med massprovbearbetning. Den UIP400MTP är en ultraljudsapparat för provberedning med hjälp av mikroplattor. UIP400MTP kan bearbeta plattor med 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 eller 3456 brunnar. Beroende på typ av mikroplatta kan varje brunn vanligtvis innehålla provvolymer mellan tiotals nanoliter till flera milliliter. UIP400MTP används i stor utsträckning inom biovetenskaplig forskning och används mycket ofta för provberedning före analyser såsom ELISA (enzymkopplad immunadsorberande analys) eller PCR, före proteinanalys, samt för kromatinberedning före CHiP och CHiP-seq, histonmodifieringsidentifiering och andra analytiska behandlingar (t.ex. gelelektrofores, masspektrometri).
Läs mer om bearbetning av PCR-plattor med hög kapacitet!

VialTweeter för provbehandling av upp till 10 injektionsflaskor

VialTweeter är en allmänt använd lab ultrasonicator VialTweeter som möjliggör effektiv och bekväm ultraljudsbehandling av upp till 10 flaskor samtidigt. Eftersom ampullerna och provrören (t.ex. Eppendorf-flaskor, kryoflaskor, centrifugrör) är ultraljudsbehandlade indirekt, undviks all korskontaminering. Eftersom samma ultraljudsintensitet levereras till varje prov, är alla ultraljudsbehandlingsresultat homogena och reproducerbara. VialTweeter erbjuder alla smarta funktioner precis som våra andra digitala enheter (t.ex. smart meny, programmerbara inställningar, temperaturkontroll, fjärrkontroll etc.) så att högsta användarkomfort garanteras.

Flerfingersonder för mikrobrunnsplattor

Tillgänglig för ultraljudssonden homogenisatorer UP200Ht och UP200St, flerfingersonder med 4 eller 8 fingrar är ett bekvämt alternativ för att sonikera flera prov samtidigt under samma förhållanden. Till exempel är sonotrode MTP-24-8-96 en sond med åtta fingrar, som är idealisk för integration i automatiserade system eller effektiv manuell provberedning av brunnarna i flerbrunnsplattor. Sonotroden med flera fingrar är idealisk för automatiserade laboratorier, där mestadels bägare och provrör med hjälp av en standard ultraljudssonotrode bearbetas. Multi-finger och standardsonder kan snabbt bytas ut inom några minuter, vilket förvandlar ensond ultraljudsapparat till en multi-probe ultraljudsstörare.

Hielscher ultraljudsapparater för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade plattformar för DNA, RNA och kromatinfragmentering. Dessa olika plattformar inkluderar ultraljudssonder (sonotroder), indirekta ultraljudslösningar för samtidig provberedning av flera rör eller flerbrunnsplattor (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor), sonorektorer och ultraljudskoppar. Alla plattformar för DNA-skjuvning drivs av frekvensjusterade, högpresterande ultraljudsprocessorer, som är exakt kontrollerbara och ger reproducerbara resultat.

Ultraljudsprocessorer för alla provnummer och storlekar

Med Hielschers multi-prov ultraljudsapparater VialTweeter (för upp till 10 provrör) och UIP400MTP (för mikroplattor / multibrunnsplattor) blir det lätt möjligt att minska provbearbetningstiden på grund av intensiv och exakt kontrollerbar ultraljud samtidigt som man får den önskade DNA-fragment storleksfördelning och utbyte. Ultraljud DNA-fragmentering gör provberedning effektiv, pålitlig och skalbar. Protokoll kan skalas linjärt från ett till flera prover genom att tillämpa ständigt kontrollerat ultraljud.
Sondultraljudsapparater med en till fem fingrar är idealiska för beredning av mindre provantal. Hielschers laboratorium ultraljudsapparater finns i olika storlekar så att vi kan rekommendera dig den perfekta enheten för din applikation och dina krav.

Exakt processtyrning

Exakt kontrollerbara ultraljudsinställningar är avgörande eftersom uttömmande sonifiering kan förstöra DNA, RNA och kromatin, men otillräcklig ultraljudsskjuvning resulterar i för långa DNA- och kromatinfragment. Hielschers digitala ultraljudsapparater kan enkelt ställas in på exakt ultraljudsbehandling parameter. Specifika ultraljudsbehandling inställningar kan också sparas som programmerad inställning för snabb upprepning av samma procedur.
All ultraljudsbehandling protokollförs automatiskt och lagras som CSV-fil på ett inbyggt SD-kort. Detta möjliggör noggrann dokumentation av utförda försök och gör det möjligt att enkelt revidera ultraljudsbehandling.
Via webbläsarens fjärrkontroll kan alla digitala ultraljudsapparater användas och övervakas via vilken standardwebbläsare som helst. Installation av ytterligare programvara krävs inte, eftersom en LAN-anslutning möjliggör en mycket enkel plug-n-play-installation.

Högsta användarvänlighet vid beredning av ultraljudsprov

Alla Hielscher ultraljudsapparater är utformade för att leverera högpresterande ultraljud, samtidigt som de alltid är mycket användarvänliga och lätta att använda. Alla inställningar är välstrukturerade i en tydlig meny, som enkelt kan nås via färgpekskärm eller webbläsarens fjärrkontroll. Den smarta programvaran med programmerbara inställningar och automatisk datainspelning säkerställer optimala ultraljudsinställningar för tillförlitliga och reproducerbara resultat. Det rena och lättanvända menygränssnittet förvandlar Hielscher ultraljudsapparater till användarvänliga och effektiva enheter.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra laboratorieultraljudsapparater, som är idealiska för provberedningsuppgifter såsom DNA- och RNA-fragmentering, celllys samt proteinextraktion: