DNA-fragmentering med ultraljud för nästa generations sekvensering

Nästa generations sekvensering (NGS) kräver tillförlitlig skjuvning och fragmentering av genomiskt DNA för att sekvensera genomiska DNA-strängar och skapa genombibliotek. Kontrollerad fragmentering av DNA till DNA-fragment är ett viktigt provberedningssteg som krävs innan DNA sekvenseras. Ultraljudsbehandling är en beprövad, effektiv och tillförlitlig teknik för fragmentering av DNA till fragment av en viss längd. Protokoll för DNA-fragmentering med ultraljud ger reproducerbara fragmenteringsresultat. Hielschers ultraljudsapparater kan producera ett brett spektrum av storleksfördelningar för genomiska DNA-fragment, vilka kan styras exakt via driftparametrarna. Eftersom Hielschers system för DNA-skjuvning med ultraljud finns för både enstaka och flera provrör samt för mikroplattor blir provberedningen mycket effektiv.

Nästa generations sekvensering: DNA-fragmentering med ultraljud för biblioteksberedning

För att genomföra nästa generations sekvensering måste de tre grundläggande stegen (1) biblioteksberedning, (2) sekvensering och (3) dataanalys utföras. Under biblioteksberedningen fragmenteras DNA, varefter fragmentändarna repareras (poleras) genom att en enda adeninbas läggs till och målfragmenten omvandlas till dubbelsträngat DNA. Slutligen fästs så kallade adaptrar genom ligering, PCR eller tagmentering så att den slutliga DNA-produkten i biblioteket kan kvantifieras inför sekvensering.
DNA-fragmentering med ultraljudsbehandling: Särskilt när sekvenseringstekniker med korta läsningar, såsom Illumina, används, vilka inte enkelt kan läsa längre DNA-fragment, måste DNA-strängarna fragmenteras till en viss storlek, vilket kan uppnås tillförlitligt med ultraljudsbehandling.
Ultraljudsbehandling kan användas tillförlitligt för fragmentering av DNA, RNA och kromatin.

Nästa generations sekvensering – biblioteksberedning

DNA-fragmentering med ultraljud används ofta vid beredning av DNA-sekvenseringsbibliotek för plattformar för nästa generations sekvensering (NGS). Denna teknik används för att bryta ned DNA-molekyler till mindre fragment inom ett önskat storleksintervall, vilket underlättar de efterföljande stegen i biblioteksberedningen. DNA-fragmentering med ultraljud krävs vanligtvis under biblioteksberedningssteget i NGS-arbetsflöden för att fragmentera genomiskt DNA till mindre delar som lämpar sig för efterföljande bearbetning och sekvensering. Den spelar en avgörande roll för att säkerställa ett framgångsrikt sekvenseringsexperiment genom att generera DNA-fragment inom ett lämpligt storleksintervall för den specifika sekvenseringsplattform som används.

Nästa generations sekvensering – processteg:

• DNA-fragmentering med ultraljud: Före bibliotekskonstruktionen fragmenteras det genomiska DNA:t till mindre, mer hanterbara delar. Fragmentering med ultraljud innebär att högfrekventa ljudvågor används för att skjuva DNA-molekylerna till fragment inom det önskade storleksintervallet. Detta steg är avgörande eftersom det bidrar till att säkerställa att de sekvensläsningar som genereras senare får en lämplig längd för den sekvenseringsplattform som används. Fragmentens storleksintervall kan anpassas utifrån sekvenseringsexperimentets specifika krav.
• Klonal amplifiering med PCR: Efter ultraljudsfragmenteringen genomgår DNA-fragmenten ändreparation, adapterligering och PCR-amplifiering för att generera de slutliga DNA-sekvenseringsbiblioteken. Dessa steg förbereder de fragmenterade DNA-molekylerna för sekvenseringsprocessen genom att tillföra adaptersekvenser som behövs för bindning till sekvenseringsplattformen och som tillhandahåller bindningsställen för primrar vid PCR-amplifiering.
• DNA-sekvensering genom syntes: När sekvenseringsbiblioteken har förberetts börjar processen för DNA-sekvensering genom syntes (SBS). Under SBS bestäms DNA-sekvensen genom att nukleotider tillförs den komplementära strängen i tur och ordning. Detta steg omfattar cykliska reaktioner med nukleotidinkorporering, avbildning och klyvning, vilket gör det möjligt att bestämma DNA-sekvensen utifrån de fluorescenssignaler som avges av de inkorporerade nukleotiderna.
• Massivt parallell sekvensering: I det sista steget sekvenseras de rumsligt åtskilda, amplifierade DNA-mallarna samtidigt på ett massivt parallellt sätt. Denna sekvenseringsmetod med hög genomströmning gör det möjligt att generera miljontals till miljardtals sekvensläsningar i en enda sekvenseringskörning, vilket möjliggör effektiv och snabb bestämning av DNA-sekvenser.

Hur fungerar DNA-fragmentering med ultraljud?

Ultraljudsbehandling, även känd som akustisk provbearbetning, är en allmänt använd metod för att fragmentera DNA. Vid skjuvning av DNA med ultraljud utsätts proverna för ultraljudsvågor under kontrollerade förhållanden. Funktionsprincipen för DNA-fragmentering med ultraljud bygger på de vibrationer och den kavitation som ultraljudsvågorna genererar. Skjuvkrafterna som uppstår vid ultraljudskavitation (akustisk kavitation) bryter sönder DNA-molekyler med hög molekylvikt. Inställningarna för ultraljudsbehandlingen, såsom intensitet (amplitud, varaktighet), pulseringsläge och temperatur, möjliggör exakt DNA-fragmentering till en viss önskad längd på DNA-fragmenten. DNA förkortas ofta till 100 till 600 bp med ultraljudsbehandling, men längre DNA-fragment på upp till 1300 bp kan erhållas när mildare ultraljudsförhållanden används.

Temperaturkontroll för att förhindra DNA-nedbrytning

DNA:s dubbelsträngade molekylstruktur är mycket känslig för förhöjda temperaturer, vilket gör exakt temperaturkontroll under provberedningsstegen till en avgörande faktor för tillförlitliga analysresultat.
Oavsett om du använder Hielschers sondbaserade ultraljudsapparater, VialTweeter eller UIP400MTP säkerställs kontinuerlig temperaturövervakning och temperaturkontroll genom en anslutningsbar temperaturgivare och apparatens smarta programvara. För att hålla temperaturen inom ett visst intervall kan du ställa in en övre och en nedre temperaturgräns. Ultraljudsapparaten pausar därför så snart denna temperaturgräns överskrids och fortsätter automatiskt med ultraljudsbehandlingen när temperaturen har sjunkit med ett inställt ∆T.
Den avancerade programvaran i Hielschers ultraljudsapparater säkerställer att idealiska förhållanden för provbehandling upprätthålls på ett tillförlitligt sätt.

DNA-fragmentering av stora provmängder med ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor

Antalet prover inom livsvetenskaperna har ökat avsevärt under det senaste decenniet. Detta innebär att mycket stora antal prover (t.ex. 384, 1536 eller 3456 brunnar per mikroplatta) måste bearbetas under provberedning och analys under genomgående likvärdiga förhållanden för att erhålla jämförbara och giltiga resultat. Med UIP400MTP följer Hielscher Ultrasonics trenden mot bearbetning av stora provmängder. UIP400MTP är en ultraljudsapparat för provberedning med mikroplattor. UIP400MTP kan bearbeta plattor med 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 eller 3456 brunnar. Beroende på typen av mikroplatta kan varje brunn vanligtvis rymma provvolymer från tiotals nanoliter till flera milliliter. UIP400MTP har stor spridning inom livsvetenskaplig forskning och används mycket ofta för provberedning inför analyser som ELISA (enzymkopplad immunadsorberande analys) eller PCR, inför proteinanalys samt för kromatinberedning inför CHiP och CHiP-seq, identifiering av histonmodifieringar och andra analytiska behandlingar (t.ex. gelelektrofores och masspektrometri).
Läs mer om bearbetning av PCR-plattor med hög provgenomströmning!

VialTweeter för provberedning av upp till 10 provrör

VialTweeter är en allmänt använd ultraljudsapparat för laboratorier, VialTweeter, som möjliggör effektiv och bekväm ultraljudsbehandling av upp till 10 provrör samtidigt. Eftersom provrören (t.ex. Eppendorf-rör, kryorör och centrifugrör) ultraljudsbehandlas indirekt undviks all korskontaminering. Eftersom varje prov tillförs samma ultraljudsintensitet är alla resultat av ultraljudsbehandlingen homogena och reproducerbara. VialTweeter erbjuder alla smarta funktioner som våra andra digitala apparater har (t.ex. smart meny, programmerbara inställningar, temperaturreglering, fjärrstyrning osv.), vilket säkerställer högsta användarkomfort.

Flerfingersonder för mikrobrunnsplattor

Flerfingersonder med 4 eller 8 fingrar finns tillgängliga för ultraljudshomogenisatorerna med sond UP200Ht och UP200St och är ett bekvämt alternativ för att ultraljudsbehandla flera prover samtidigt under samma förhållanden. Exempelvis är sonotroden MTP-24-8-96 en sond med åtta fingrar som är idealisk för integrering i automatiserade system eller effektiv manuell provberedning i brunnarna på flerbrunnsplattor. Flerfingersonotroden är idealisk för automatisering i laboratorier där främst bägare och provrör bearbetas med en standardsonotrod för ultraljudsbehandling. Flerfingersonderna och standardsonderna kan snabbt bytas ut mot varandra inom några minuter, vilket omvandlar ultraljudsapparaten med en enda sond till en ultraljudsdisruptor med flera sonder.

Hielschers ultraljudsapparater för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade plattformar för fragmentering av DNA, RNA och kromatin. Dessa olika plattformar omfattar ultraljudssonder (sonotroder), lösningar för indirekt ultraljudsbehandling för samtidig provberedning av flera rör eller flerbrunnsplattor (t.ex. 96-brunnsplattor och mikrotiterplattor), sonoreaktorer och ultraljudskopphorn. Alla plattformar för DNA-skjuvning drivs av frekvensavstämda, högpresterande ultraljudsprocessorer som kan styras exakt och ger reproducerbara resultat.

Ultraljudsprocessorer för alla provantal och provstorlekar

Med Hielschers ultraljudsapparater för flera prover, VialTweeter (för upp till 10 provrör) och UIP400MTP (för mikroplattor/flerbrunnsplattor), blir det möjligt att minska provbearbetningstiden tack vare intensiv och exakt styrbar ultraljudsbehandling, samtidigt som önskad storleksfördelning och önskat utbyte av DNA-fragment uppnås. DNA-fragmentering med ultraljud gör provberedningen effektiv, tillförlitlig och skalbar. Protokoll kan skalas linjärt från ett till ett stort antal prover genom att applicera kontinuerligt kontrollerat ultraljud.
Ultraljudsapparater med sonder med ett till fem fingrar är idealiska för beredning av mindre antal prover. Hielschers ultraljudsapparater för laboratorier finns i olika storlekar så att vi kan rekommendera den idealiska apparaten för din tillämpning och dina krav.

Precis processtyrning

Exakt reglerbara inställningar för ultraljudsbehandling är avgörande eftersom alltför omfattande ultraljudsbehandling kan förstöra DNA, RNA och kromatin, medan otillräcklig skjuvning med ultraljud ger alltför långa DNA- och kromatinfragment. Hielschers digitala ultraljudsapparater kan enkelt ställas in med exakta parametrar för ultraljudsbehandlingen. Specifika inställningar för ultraljudsbehandling kan också sparas som programmerade inställningar för snabb upprepning av samma procedur.
Alla ultraljudsbehandlingar loggas automatiskt och lagras som en CSV-fil på ett inbyggt SD-kort. Detta möjliggör noggrann dokumentation av genomförda försök och gör det enkelt att granska ultraljudsbehandlingarna.
Alla digitala ultraljudsapparater kan styras och övervakas på distans via valfri standardwebbläsare. Ingen ytterligare programvara behöver installeras, eftersom en LAN-anslutning möjliggör en mycket enkel plug-and-play-installation.


Högsta användarvänlighet vid provberedning med ultraljud

Alla Hielschers ultraljudsapparater är utformade för att leverera högpresterande ultraljud och samtidigt alltid vara mycket användarvänliga och enkla att använda. Alla inställningar är välstrukturerade i en tydlig meny som är lätt att nå via en pekskärm i färg eller fjärrstyrning via webbläsare. Den smarta programvaran med programmerbara inställningar och automatisk dataregistrering säkerställer optimala inställningar för ultraljudsbehandling för tillförlitliga och reproducerbara resultat. Det tydliga och lättanvända menygränssnittet gör Hielschers ultraljudsapparater användarvänliga och effektiva.
Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra laboratorieultraljudsapparater, som är idealiska för provberedningsuppgifter såsom DNA- och RNA-fragmentering, celllys och proteinextraktion: