Plasmidberedning med ultraljud

Ultraljud är en pålitlig teknik för att fragmentera plasmid-DNA. Exakt kontrollerbar amplitud, pulseringsläge och temperaturkontroll är de viktigaste funktionerna hos en ultrasonicator för icke-skadlig plasmidfragmentering. Dessutom bidrar användningen av vissa medel till att skydda mot plasmidnedbrytning. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för kontrollerad plasmidfragmentering från enstaka injektionsflaskor, samtidigt ultraljudsbehandling av många prover samt multi-well plattor. Läs mer om framgångsrik ultraljudsplasmidfragmentering!

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Ultraljud DNA-fragmentering är en pålitlig och effektiv teknik som vanligtvis används i nästa generations sekvensering (NGS)

The UIP400MTP möjliggör exakt kontrollerad ultraljud av flerbrunnsplattor. En av tillämpningarna av UIP400MTP är fragmenteringen av plasmid-DNA för att erhålla fragment av en specifikt riktad längd.

Plasmidskärning med ultraljud

När DNA-prover utsätts för ultraljudsvågor skapar de ultraljudsgenererade vibrationerna akustisk kavitation i vätskan som skjuvar eller bryter DNA-molekyler med hög molekylvikt via mekaniska krafter. Ultraljudsbehandling är den mest använda metoden för bulk DNA skjuvning experiment inklusive applikationer, såsom kromatin immunoprecipitation (ChIP), för vilka små fragment storlekar är helt avgörande för att få hög upplösning. (jfr Tseng m.fl., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) är en specifik form av DNA, kännetecknad av sin ringform och finns i bakterier och vissa eukaryoter.
Supercoiled pDNA är den önskade formen av plasmid-DNA eftersom det visar bästa resultat i nedströmsprocesser som automatiserad sekvensering och transfektion. Ultraljud är lämplig för att fragmentera pDNA, inklusive supercoiled pDNA, framgångsrikt.
(2008) visade att plasmid ultraljudsbehandling, som är känt för att fragmentera supercoiled DNA, är ett effektivt sätt att förbättra sekvens phred20 läslängder till den grad att de inte skiljer sig signifikant från Beckman Coulters kontrollmall eller enzymatiskt linjäriserade plasmider.

Fördelar med ultraljud DNA fragmentering

  • Exakt kontrollerbar
  • Reproducerbara resultat
  • Justerbar för att rikta DNA-fragmentlängder
  • temperaturkontroll
  • Skalbar till alla provstorlekar
Videon visar ultraljud provberedningssystemet UIP400MTP, vilket möjliggör tillförlitlig provberedning av alla standard multi-brunnsplattor med högintensiv ultraljud. Typiska tillämpningar av UIP400MTP inkluderar celllys, DNA, RNA och kromatinspjuvning samt proteinutvinning.

Ultrasonicator UIP400MTP för multi-well platta ultraljudsbehandling

Användning av Plasmidvektorer

Plasmider används ofta som verktyg för att klona, överföra och manipulera gener. När plasmider används experimentellt för dessa ändamål kallas de vektorer. DNA-fragment eller gener kan sättas in i en plasmidvektor, vilket skapar en så kallad rekombinant plasmid. Plasmidvektorer används som fordon för att driva rekombinant DNA in i en värdcell och är en nyckelkomponent i molekylär kloning.
“Icke-virala vektorer studeras omfattande för deras potentiella användning i genterapi för att behandla olika komplicerade sjukdomar. Icke-virala vektorer skyddar plasmid-DNA mot fysisk, kemisk och enzymatisk nedbrytning och levererar DNA-molekylen till målplatsen. Till exempel bildar katjoniska liposomer, kitosan och andra positivt laddade nanopartiklar komplex med plasmid-DNA genom elektrostatiska interaktioner. De lättbildade katjoniska liposomerna/plasmid-DNA-komplexen är dock relativt stora (dvs. 300–400 nm) och heterogena till sin natur vilket gör dem svåra att använda i farmaceutiska tillämpningar. De stora och heterogena plasmid-DNA / liposomer, plasmid-DNA / aerosoler och plasmid-DNA / peptidkomplex kan reduceras till mindre och homogena partiklar med ultraljud.” (Sarker m.fl., 2019)
Ett framträdande exempel på användning av plasmidvektorer är CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet levereras vanligtvis till celler som en enda stor plasmid eller flera mindre plasmider som kodar för en målsekvens, en CRISPR-guide och Cas9.

Ultraljud beredning av DNA-laddade PLGA nanopartiklar genom nanoprecipitation

(2020) använde poly (mjölksyra-ko-glykolsyra) (PLGA) för att bilda en nanopartikelbärare för leverans av en modell CRISPR –Cas9-plasmid till primära benmärgsderiverade makrofager. För nanoprecipitation av PLGA-nanopartiklar användes PLGA med två olika ändgrupper (ester- och amingrupper) med målet att de positivt laddade aminändkapslarna ökar inkapslingseffektiviteten och belastningen på grund av laddningsinteraktionerna mellan den och den negativt laddade ryggraden i DNA. I ett 50 ml polypropen koniskt centrifugrör löstes 100 mg Pluronic F127 i 20 ml autoklaverat DI-vatten genom virvelblandning följt av 30 minuters mild ultraljudsbehandling med hjälp av ett ultraljudsbad (se CupHorn). En autoklaverad magnetisk omrörningsstång tillsattes och lösningen blandades vid 600 rpm i 30 min medan de andra lösningarna gjordes. Plastlabbvaror användes istället för glasvaror hela tiden för att minimera ospecifik adsorption av DNA. Lösningar av PLGA upplösta i DMF (44,48 mg/ml) och TIPS pentacen upplösta i THF (0,667 mg/ml) tillverkades separat. PLGA lämnades vilande för att blöta i DMF i 30 minuter innan den sonicerades i 30 minuter (för fullständigt protokoll se Jo et al., 2020)

Relaterade applikationer:

  • Extraktion av DNA
  • Inkapsling av DNA
  • Dispersion av nanopartikelbelagt DNA
  • Leverans av plasmid-DNA till celler
UP200St TD_CupHorn för den indirekta ultraljudsbehandling av prover

UP200St CupHorn för indirekt ultraljudsbehandling av prover, t.ex. för DNA-extraktion och fragmentering.

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Plasmid DNA-skydd under ultraljudsbehandling

DNA inklusive plasmider och supercoiled plasmider är mycket känslig nedbrytning. Alla tillgängliga fragmenteringsmetoder är kända för vissa nackdelar. Ultraljud DNA-fragmentering är en av de föredragna metoderna eftersom kontrollerad ultraljudsbehandling i kombination med skyddsåtgärder gör det möjligt att minska skjuv- och värmeinducerad skada av DNA-strängar.
Förutom låga amplitudinställningar, pulseringsläge och temperaturkontroll under ultraljuds-DNA-skjuvning visade användningen av vissa medel signifikant skyddande effekt mot DNA-nedbrytning. Till exempel skyddar olika polymerer, peptider och lipider plasmid-DNA under ultraljud.

Joniska vätskor kan skydda plasmid-DNA mot skador under ultraljudsbehandling.

Stabiliteten hos plasmid-DNA och plasmid-DNA / IL-nanokomplex mot ultraljudsskjuvspänning undersöktes med hjälp av agarosgelelektroforesanalys. Både plasmid-DNA och plasmid-DNA / IL-nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning för olika tidpunkter. Plasmid-DNA utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30 och 40 minuter. Plasmid-DNA / IL-nanokomplexen utsattes dock för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter.
(studie och bild: ©Sarker et al., 2019)

(2019) visade att när nanostrukturerna för plasmid-DNA / jonvätska (pDNA / IL) utsattes för ultraljudsskjuvspänning för 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 min och komplexades med det kommersiellt tillgängliga katjoniska genleveransmedlet lipofektamin, var andelen fluorescerande positiva celler 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% respektive 50% (se diagram nedan). Andelen fluorescerande positiva celler ökade när nanostrukturerna utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 10 och 20 min och minskade därefter långsamt.

Ultraljud fragmentering av plasmid-DNA

Påverkan av jonvätska [Bmim] [PF6] på leveransen av plasmid-DNA till COS7-celler. Plasmid-DNA / IL (jonvätska) nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning i upp till 120 minuter och komplexades med LA innan de levererades till COS7-celler. Data visar det genomsnittliga antalet (%) GFP-positiva HeLa-celler räknade i 10 olika mikroskopiska fält och experimentet utfördes flera gånger på tre olika dagar. (Studie och diagram: ©Sarker et al., 2019)

Plasmid-DNA kan skyddas och lägga till ett medel före ultraljudsfragmentering.

Plasmid-DNA kan skyddas och lägga till ett medel före ultraljudsfragmentering: Ultraljudsbehandling-inducerad nedbrytning av naken pDNA (A) och av pDNA formulerad med 1.5 mM CaCl2 och 20% (v / v) t-butanol (B)
Prover sonikerades med en 20W sond i upp till 120s, som anges på toppen av varje körfält. Lane H motsvarar Hyperladder I-markören ™️. OC- och SC-plasmidbanden anges.
(studie och bilder: ©Wu et al., 2009)

Ultraljud Lysate beredning

Ultraljud Cell Lysis Protokoll
Ultrasonicator UP200Ht med microtip S26d2 för ultraljud lys av biologiska proverBörja med ett berikat cellprov som framställdes via en cellseparationsmetod (t.ex. immunomagnetisk cellseparation, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscellisolering).
Cellproverna måste visa en volym av en lysbuffert som är lämplig för det experimentella målet och ultraljud av sondtyp.
Hypotoniska buffertar föredras eftersom de förbättrar ultraljud celllys. Det är viktigt att tillsatser och saltkoncentration används på ett lämpligt sätt.
Välj din ultraljud lysis enhet: För indirekt ultraljudsbehandling av injektionsflaskor, VialTweeter eller CupHorn rekommenderas. För multiwell-plattor är UIP400MTP den perfekta ultrasonicator. Och klassisk sond-typ ultraljudsbehandling, en ultraljud homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospets är mest lämpliga.
Protokoll för sond-typ ultraljudsbehandling: Placera ultrasonicator sonden i provvolymen i ett mikrocentrifugrör och ultraljudsbehandling i ca 10 sekunder. Beroende på DNA-provet kan ultraljudsbehandlingen upprepas en eller två gånger till. Den nödvändiga ultraljudsenergiinmatningen (Ws / ml) beror på provets viskositet och DNA-typ. Kylning via isbad och pulseringsläge för ultrasonicator hjälper till att förhindra att provet försämras termiskt.
Efter ultraljudslys centrifugeras provet för att separera pelletsskräp (innehållande olyserade celler, kärnor och olyserade organeller)
Om provet inte omedelbart bearbetas ytterligare kan det lagras vid en lämplig temperatur för att bevara dess livskraft.

Ultrasonicators för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljud-baserade plattformar för DNA, RNA och kromatin fragmentering. Dessa olika plattformar inkluderar ultraljud sonder (sonotrodes), indirekt ultraljudsbehandling lösningar för samtidig prov förberedelse av flera rör eller multi-well plattor (t.ex. 96-brunn plattor, mikrotiter plattor), sonoreactors och ultraljud cuphorns. Alla plattformar för DNA-avsjuvning drivs av frekvensjusterade, högpresterande ultraljudsprocessorer, som är exakt kontrollerbara och ger reproducerbara resultat.

Ultraljud processorer för alla prov nummer och storlek

Med Hielschers ultraljud med flera prover VialTweeter (för upp till 10 provrör) och UIP400MTP (för mikroplattor / multiwellplattor) blir det lätt möjligt att minska provbehandlingstiden på grund av intensiv och exakt kontrollerbar ultraljud samtidigt som man uppnår önskad DNA-fragmentstorleksfördelning och utbyte. Ultraljud DNA-fragmentering gör plasmidberedningssteg effektiva, pålitliga och skalbara. Protokoll kan skalas linjärt från ett till många prover genom att tillämpa konstanta ultraljudsparametrar.
Probe ultrasonicators med en till fem fingrar är idealiska för beredning av mindre provnummer. Hielschers lab ultrasonicators finns med olika effektnivåer så att du kan välja den perfekta ultraljudsstörande för din DNA-relaterade applikation.

VialTweeter är en MultiSample Ultrasonicator som möjliggör tillförlitlig provberedning under exakt kontrollerade temperaturförhållanden.

Ultraljud multi-prov beredning enhet VialTweeter möjliggör samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaska. Med den påspänna enheten VialPress kan upp till 4 extra rör pressas fram för intensiv ultraljudsbehandling.

noggrann processtyrning

Hielscher ultrasonicators kan fjärrstyras via webbläsarkontroll. Ultraljudsbehandling parametrar kan övervakas och justeras exakt till processkraven.Exakt kontrollerbara ultraljudsbehandling inställningar är avgörande eftersom uttömmande sonifiering kan förstöra DNA, RNA och kromatin, men otillräcklig ultraljud shearing resulterar i för länge DNA och kromatin fragment. Hielschers digitala ultraljudspumpar kan enkelt ställas in på exakt ultraljudsbehandling parameter. Specifika ultraljudsbehandling inställningar kan också sparas som programmerad inställning för snabb upprepning av samma förfarande.
All ultraljudsbehandling protokolleras automatiskt och lagras som CSV-fil på ett inbyggt SD-kort. Detta möjliggör korrekt dokumentation av utförda försök och gör det möjligt att enkelt revidera ultraljudsbehandling.
Via webbläsarens fjärrkontroll kan alla digitala ultraljudspumpar styras och övervakas via vilken standardwebbläsare som helst. Installation av ytterligare programvara krävs inte, eftersom LAN-anslutningen är en mycket enkel plug-n-play-installation.

Högsta användarvänlighet under ultraljud DNA-beredning

Alla Hielscher ultrasonicators är utformade för att leverera högpresterande ultraljud, samtidigt som de alltid är mycket användarvänliga och lätt att använda. Alla inställningar är välstrukturerade i en tydlig meny, som enkelt kan nås via färgad pekskärm eller webbläsarfjärrkontroll. Den smarta programvaran med programmerbara inställningar och automatisk dataregistrering säkerställer optimala ultraljudsbehandlingsinställningar för tillförlitliga och reproducerbara resultat. Det rena och lättanvända menygränssnittet förvandlar Hielscher ultrasonicators till användarvänliga och effektiva enheter.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra lab ultrasonicators för celllys och DNA-fragmentering:

batch Volym Flödeshastighet Rekommenderade Devices
plattor med flera brunnar Ej tillämpligt UIP400MTP
injektionsflaskor, liten bägare Ej tillämpligt Ultraljud CupHorn
upp till 10 injektionsflaskor Ej tillämpligt VialTweeter
1 till 500 ml 10 till 200 ml / min UP100H
10 till 2000 ml 20 till 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St

Kontakta oss! / Fråga oss!

Be om mer information

Använd formuläret nedan för att begära ytterligare information om ultraljud homogenisatorer för DNA utvinning och fragmentering, applikationsprotokoll och priser. Vi kommer gärna att diskutera din process med dig och erbjuda dig ett ultraljudssystem som uppfyller dina krav!









Observera att våra Integritetspolicy.




Litteratur / Referenser

Fakta Värt att veta

Vad är Plasmider?
En plasmid är en liten cirkulär DNA-molekyl som är fysiskt skild från kromosomalt DNA och replikeras oberoende. Plasmider är ofta förknippade med gener som bidrar till en organisms överlevnad och ger specifika fördelar, t.ex. antibiotikaresistens. Plasmider finns oftast som små cirkulära, dubbelsträngade DNA-molekyler i bakterier; emellertid är plasmider ibland närvarande i arkéer och eukaryota organismer. Plasmider är viktiga verktyg inom molekylärbiologi, genetik, biokemi och life science. Kända som vektorer inom genteknik används plasmider för att replikera eller uttrycka vissa gener. Den riktade förändringen av en vektor kallas vektordesign.

GFP-analys inom cellforskning
Grönt fluorescerande protein (GFP) är en mångsidig biologisk markör för att övervaka fysiologiska processer, visualisera proteinlokalisering och detektera transgent uttryck in vivo. GFP kan exciteras av 488 nm laserlinjen och detekteras optimalt vid 510 nm.


Högpresterande ultraljud! Hielschers produktsortiment täcker hela spektrumet från den kompakta labb ultrasonicator över bänkenheter till fullindustriella ultraljudssystem.

Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljud homogenisatorer från Labb till industriell storlek.