Ultraljud är en pålitlig teknik för att fragmentera plasmid-DNA. Exakt kontrollerbar amplitud, pulseringsläge och temperaturkontroll är de viktigaste funktionerna hos en ultrasonicator för icke-skadlig plasmidfragmentering. Dessutom bidrar användningen av vissa medel till att skydda mot plasmidnedbrytning. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för kontrollerad plasmidfragmentering från enstaka injektionsflaskor, samtidigt ultraljudsbehandling av många prover samt multi-well plattor. Läs mer om framgångsrik ultraljudsplasmidfragmentering!

Plasmidskärning med ultraljud

När DNA-prover utsätts för ultraljudsvågor skapar de ultraljudsgenererade vibrationerna akustisk kavitation i vätskan som skjuvar eller bryter DNA-molekyler med hög molekylvikt via mekaniska krafter. Ultraljudsbehandling är den mest använda metoden för bulk DNA skjuvning experiment inklusive applikationer, såsom kromatin immunoprecipitation (ChIP), för vilka små fragment storlekar är helt avgörande för att få hög upplösning. (jfr Tseng m.fl., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) är en specifik form av DNA, kännetecknad av sin ringform och finns i bakterier och vissa eukaryoter.
Supercoiled pDNA är den önskade formen av plasmid-DNA eftersom det visar bästa resultat i nedströmsprocesser som automatiserad sekvensering och transfektion. Ultraljud är lämplig för att fragmentera pDNA, inklusive supercoiled pDNA, framgångsrikt.
(2008) visade att plasmid ultraljudsbehandling, som är känt för att fragmentera supercoiled DNA, är ett effektivt sätt att förbättra sekvens phred20 läslängder till den grad att de inte skiljer sig signifikant från Beckman Coulters kontrollmall eller enzymatiskt linjäriserade plasmider.

Användning av Plasmidvektorer

Plasmider används ofta som verktyg för att klona, överföra och manipulera gener. När plasmider används experimentellt för dessa ändamål kallas de vektorer. DNA-fragment eller gener kan sättas in i en plasmidvektor, vilket skapar en så kallad rekombinant plasmid. Plasmidvektorer används som fordon för att driva rekombinant DNA in i en värdcell och är en nyckelkomponent i molekylär kloning.
“Icke-virala vektorer studeras omfattande för deras potentiella användning i genterapi för att behandla olika komplicerade sjukdomar. Icke-virala vektorer skyddar plasmid-DNA mot fysisk, kemisk och enzymatisk nedbrytning och levererar DNA-molekylen till målplatsen. Till exempel bildar katjoniska liposomer, kitosan och andra positivt laddade nanopartiklar komplex med plasmid-DNA genom elektrostatiska interaktioner. De lättbildade katjoniska liposomerna/plasmid-DNA-komplexen är dock relativt stora (dvs. 300–400 nm) och heterogena till sin natur vilket gör dem svåra att använda i farmaceutiska tillämpningar. De stora och heterogena plasmid-DNA / liposomer, plasmid-DNA / aerosoler och plasmid-DNA / peptidkomplex kan reduceras till mindre och homogena partiklar med ultraljud.” (Sarker m.fl., 2019)
Ett framträdande exempel på användning av plasmidvektorer är CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet levereras vanligtvis till celler som en enda stor plasmid eller flera mindre plasmider som kodar för en målsekvens, en CRISPR-guide och Cas9.

Ultraljud beredning av DNA-laddade PLGA nanopartiklar genom nanoprecipitation

(2020) använde poly (mjölksyra-ko-glykolsyra) (PLGA) för att bilda en nanopartikelbärare för leverans av en modell CRISPR –Cas9-plasmid till primära benmärgsderiverade makrofager. För nanoprecipitation av PLGA-nanopartiklar användes PLGA med två olika ändgrupper (ester- och amingrupper) med målet att de positivt laddade aminändkapslarna ökar inkapslingseffektiviteten och belastningen på grund av laddningsinteraktionerna mellan den och den negativt laddade ryggraden i DNA. I ett 50 ml polypropen koniskt centrifugrör löstes 100 mg Pluronic F127 i 20 ml autoklaverat DI-vatten genom virvelblandning följt av 30 minuters mild ultraljudsbehandling med hjälp av ett ultraljudsbad (se CupHorn). En autoklaverad magnetisk omrörningsstång tillsattes och lösningen blandades vid 600 rpm i 30 min medan de andra lösningarna gjordes. Plastlabbvaror användes istället för glasvaror hela tiden för att minimera ospecifik adsorption av DNA. Lösningar av PLGA upplösta i DMF (44,48 mg/ml) och TIPS pentacen upplösta i THF (0,667 mg/ml) tillverkades separat. PLGA lämnades vilande för att blöta i DMF i 30 minuter innan den sonicerades i 30 minuter (för fullständigt protokoll se Jo et al., 2020)

Plasmid DNA-skydd under ultraljudsbehandling

DNA inklusive plasmider och supercoiled plasmider är mycket känslig nedbrytning. Alla tillgängliga fragmenteringsmetoder är kända för vissa nackdelar. Ultraljud DNA-fragmentering är en av de föredragna metoderna eftersom kontrollerad ultraljudsbehandling i kombination med skyddsåtgärder gör det möjligt att minska skjuv- och värmeinducerad skada av DNA-strängar.
Förutom låga amplitudinställningar, pulseringsläge och temperaturkontroll under ultraljuds-DNA-skjuvning visade användningen av vissa medel signifikant skyddande effekt mot DNA-nedbrytning. Till exempel skyddar olika polymerer, peptider och lipider plasmid-DNA under ultraljud.

Stabiliteten hos plasmid-DNA och plasmid-DNA / IL-nanokomplex mot ultraljudsskjuvspänning undersöktes med hjälp av agarosgelelektroforesanalys. Både plasmid-DNA och plasmid-DNA / IL-nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning för olika tidpunkter. Plasmid-DNA utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30 och 40 minuter. Plasmid-DNA / IL-nanokomplexen utsattes dock för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter.
(studie och bild: ©Sarker et al., 2019)

(2019) visade att när nanostrukturerna för plasmid-DNA / jonvätska (pDNA / IL) utsattes för ultraljudsskjuvspänning för 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 min och komplexades med det kommersiellt tillgängliga katjoniska genleveransmedlet lipofektamin, var andelen fluorescerande positiva celler 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% respektive 50% (se diagram nedan). Andelen fluorescerande positiva celler ökade när nanostrukturerna utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 10 och 20 min och minskade därefter långsamt.

Påverkan av jonvätska [Bmim] [PF6] på leveransen av plasmid-DNA till COS7-celler. Plasmid-DNA / IL (jonvätska) nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning i upp till 120 minuter och komplexades med LA innan de levererades till COS7-celler. Data visar det genomsnittliga antalet (%) GFP-positiva HeLa-celler räknade i 10 olika mikroskopiska fält och experimentet utfördes flera gånger på tre olika dagar. (Studie och diagram: ©Sarker et al., 2019)

Ultraljud Lysate beredning

Ultraljud Cell Lysis Protokoll
Börja med ett berikat cellprov som framställdes via en cellseparationsmetod (t.ex. immunomagnetisk cellseparation, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscellisolering).
Cellproverna måste visa en volym av en lysbuffert som är lämplig för det experimentella målet och ultraljud av sondtyp.
Hypotoniska buffertar föredras eftersom de förbättrar ultraljud celllys. Det är viktigt att tillsatser och saltkoncentration används på ett lämpligt sätt.
Välj din ultraljud lysis enhet: För indirekt ultraljudsbehandling av injektionsflaskor, VialTweeter eller CupHorn rekommenderas. För multiwell-plattor är UIP400MTP den perfekta ultrasonicator. Och klassisk sond-typ ultraljudsbehandling, en ultraljud homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospets är mest lämpliga.
Protokoll för sond-typ ultraljudsbehandling: Placera ultrasonicator sonden i provvolymen i ett mikrocentrifugrör och ultraljudsbehandling i ca 10 sekunder. Beroende på DNA-provet kan ultraljudsbehandlingen upprepas en eller två gånger till. Den nödvändiga ultraljudsenergiinmatningen (Ws / ml) beror på provets viskositet och DNA-typ. Kylning via isbad och pulseringsläge för ultrasonicator hjälper till att förhindra att provet försämras termiskt.
Efter ultraljudslys centrifugeras provet för att separera pelletsskräp (innehållande olyserade celler, kärnor och olyserade organeller)
Om provet inte omedelbart bearbetas ytterligare kan det lagras vid en lämplig temperatur för att bevara dess livskraft.

Ultrasonicators för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljud-baserade plattformar för DNA, RNA och kromatin fragmentering. Dessa olika plattformar inkluderar ultraljud sonder (sonotrodes), indirekt ultraljudsbehandling lösningar för samtidig prov förberedelse av flera rör eller multi-well plattor (t.ex. 96-brunn plattor, mikrotiter plattor), sonoreactors och ultraljud cuphorns. Alla plattformar för DNA-avsjuvning drivs av frekvensjusterade, högpresterande ultraljudsprocessorer, som är exakt kontrollerbara och ger reproducerbara resultat.

Ultraljud processorer för alla prov nummer och storlek

Med Hielschers ultraljud med flera prover VialTweeter (för upp till 10 provrör) och UIP400MTP (för mikroplattor / multiwellplattor) blir det lätt möjligt att minska provbehandlingstiden på grund av intensiv och exakt kontrollerbar ultraljud samtidigt som man uppnår önskad DNA-fragmentstorleksfördelning och utbyte. Ultraljud DNA-fragmentering gör plasmidberedningssteg effektiva, pålitliga och skalbara. Protokoll kan skalas linjärt från ett till många prover genom att tillämpa konstanta ultraljudsparametrar.
Probe ultrasonicators med en till fem fingrar är idealiska för beredning av mindre provnummer. Hielschers lab ultrasonicators finns med olika effektnivåer så att du kan välja den perfekta ultraljudsstörande för din DNA-relaterade applikation.