Plasmidpreparering med ultraljud

Ultraljudsbehandling är en tillförlitlig teknik för att fragmentera plasmid-DNA. Exakt reglerbar amplitud, pulseringsläge och temperaturkontroll är de viktigaste egenskaperna hos en ultraljudsapparat för skonsam plasmidfragmentering. Dessutom bidrar användningen av vissa ämnen till att skydda mot plasmidnedbrytning. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för kontrollerad plasmidfragmentering i enskilda provflaskor, samtidig ultraljudsbehandling av ett stort antal prover samt behandling av flerbrunnsplattor. Läs mer om framgångsrik plasmidfragmentering med ultraljud!

Skjuvning av plasmider med ultraljud

När DNA-prover utsätts för ultraljudsvågor skapar de ultraljudsgenererade vibrationerna akustisk kavitation i vätskan, som genom mekaniska krafter skjuvar eller bryter sönder DNA-molekyler med hög molekylvikt. Ultraljudsbehandling är den mest använda metoden för försök med skjuvning av DNA i bulk, inklusive tillämpningar såsom kromatinimmunprecipitation (ChIP), där små fragmentstorlekar är helt avgörande för att uppnå hög upplösning. (jfr Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) är en specifik form av DNA som kännetecknas av sin ringform och förekommer hos bakterier och vissa eukaryoter.
Superhelikalt pDNA är den önskade formen av plasmid-DNA eftersom den ger bäst resultat i efterföljande processer såsom automatiserad sekvensering och transfektion. Ultraljudsbehandling är lämplig för att framgångsrikt fragmentera pDNA, inklusive superhelikalt pDNA.
Thompson et al. (2008) visade att ultraljudsbehandling av plasmider, som är känd för att fragmentera superhelikalt DNA, är ett effektivt sätt att förbättra sekvensläsningslängderna vid phred20 så att de inte skiljer sig signifikant från dem som erhålls med Beckman Coulters kontrolltemplat eller enzymatiskt linjäriserade plasmider.

Användning av plasmidvektorer

Plasmider används ofta som verktyg för att klona, överföra och manipulera gener. När plasmider används experimentellt för dessa ändamål kallas de vektorer. DNA-fragment eller gener kan infogas i en plasmidvektor, vilket skapar en så kallad rekombinant plasmid. Plasmidvektorer används som bärare för att föra in rekombinant DNA i en värdcell och är en central komponent i molekylär kloning.
”Icke-virala vektorer studeras ingående med avseende på deras potentiella användning inom genterapi för att behandla olika komplicerade sjukdomar. Icke-virala vektorer skyddar plasmid-DNA mot fysikalisk, kemisk och enzymatisk nedbrytning och levererar DNA-molekylen till målplatsen. Till exempel bildar katjoniska liposomer, kitosan och andra positivt laddade nanopartiklar komplex med plasmid-DNA genom elektrostatiska interaktioner. De lättbildade komplexen av katjoniska liposomer/plasmid-DNA är dock relativt stora (dvs. 300–400 nm) och heterogena till sin natur, vilket gör dem svåra att använda i farmaceutiska tillämpningar. De stora och heterogena komplexen av plasmid-DNA/liposomer, plasmid-DNA/aerosoler och plasmid-DNA/peptider kan med ultraljudsbehandling reduceras till mindre och homogena partiklar.” (Sarker et al., 2019)
Ett framträdande exempel på användning av plasmidvektorer är CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet levereras vanligtvis till celler som en enda stor plasmid eller flera mindre plasmider som kodar för en målsekvens, en CRISPR-guide och Cas9.

Ultraljudsbaserad framställning av DNA-laddade PLGA-nanopartiklar genom nanoprecipitation

Jo et al. (2020) använde poly(mjölksyra-ko-glykolsyra) (PLGA) för att framställa en nanopartikelbärare för leverans av en CRISPR–Cas9-modellplasmid till primära benmärgshärledda makrofager. För nanoprecipiteringen av PLGA-nanopartiklar användes PLGA med två olika ändgrupper (ester- och amingrupper) med avsikten att de positivt laddade aminändgrupperna skulle öka inkapslingseffektiviteten och inlastningen genom laddningsinteraktionerna mellan dem och DNA:ts negativt laddade ryggrad. I ett koniskt 50 mL-centrifugrör av polypropen löstes 100 mg Pluronic F127 i 20 mL autoklaverat avjoniserat vatten genom vortexblandning, följt av 30 min skonsam ultraljudsbehandling i ett ultraljudsbad (se CupHorn). En autoklaverad magnetomrörarstav tillsattes och lösningen blandades vid 600 RPM i 30 min medan de andra lösningarna bereddes. Laboratorieutrustning av plast användes genomgående i stället för glasutrustning för att minimera ospecifik adsorption av DNA. Lösningar av PLGA löst i DMF (44,48 mg/ ml) och TIPS-pentacen löst i THF (0,667 mg/ml) bereddes separat. PLGA fick stå utan omrörning för att vätas i DMF i 30 min innan det ultraljudsbehandlades i 30 min. (För fullständigt protokoll, se Jo et al., 2020)

Skydd av plasmid-DNA under ultraljudsbehandling

DNA, inklusive plasmider och supercoilade plasmider, är mycket känsligt för nedbrytning. Alla tillgängliga fragmenteringsmetoder är kända för att ha vissa nackdelar. DNA-fragmentering med ultraljud är en av de föredragna metoderna eftersom kontrollerad ultraljudsbehandling i kombination med skyddsåtgärder gör det möjligt att minska skjuvnings- och värmeinducerade skador på DNA-strängar.
Utöver låga amplitudinställningar, pulseringsläge och temperaturkontroll vid DNA-skjuvning med ultraljud har användning av vissa ämnen visat en betydande skyddande effekt mot DNA-nedbrytning. Exempelvis skyddar olika polymerer, peptider och lipider plasmid-DNA under ultraljudsbehandling.

Stabiliteten hos plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex mot ultraljudsinducerad skjuvspänning undersöktes med agarosgelelektrofores. Både plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex utsattes för ultraljudsinducerad skjuvspänning under olika lång tid. Plasmid-DNA utsattes för ultraljudsinducerad skjuvspänning i 0, 10, 20, 30 och 40 minuter. Plasmid-DNA/IL-nanokomplexen utsattes däremot för ultraljudsinducerad skjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter.
(studie och bild: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) visade att när nanostrukturerna av plasmid-DNA / jonvätska (pDNA/IL) utsattes för ultraljudsinducerad skjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 min och komplexbildades med det kommersiellt tillgängliga katjoniska genleveransmedlet lipofectamine var andelen fluorescenspositiva celler 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% respektive 50% (se diagrammet nedan). Andelen fluorescenspositiva celler ökade när nanostrukturerna utsattes för ultraljudsinducerad skjuvspänning i 10 och 20 min och minskade därefter långsamt.

Inverkan av jonvätskan [Bmim][PF6] på leveransen av plasmid-DNA till COS7-celler. Plasmid-DNA/IL-nanokomplex (jonvätska) utsattes för ultraljudsinducerad skjuvspänning i upp till 120 minuter och komplexbildades med LA före leverans till COS7-celler. Data visar det genomsnittliga antalet (%) GFP-positiva HeLa-celler som räknades i 10 olika mikroskopiska synfält, och experimentet utfördes flera gånger under tre olika dagar. (Studie och diagram: ©Sarker et al., 2019)

Lysatberedning med ultraljud

Protokoll för celllys med ultraljud
Börja med ett anrikat cellprov som har beretts med en cellseparationsmetod (t.ex. immunomagnetisk cellseparation, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immunodensitetsbaserad cellisolering).
Cellproverna måste innehålla en volym lysbuffert som är lämplig för försökets syfte och ultraljudsapparaten av sondtyp.
Hypotona buffertar föredras eftersom de förstärker celllys med ultraljud. Det är viktigt att tillsatser och saltkoncentration används på ett lämpligt sätt.
Välj utrustning för celllys med ultraljud: För indirekt ultraljudsbehandling av provflaskor rekommenderas VialTweeter eller CupHorn. För flerbrunnsplattor är UIP400MTP den idealiska ultraljudsapparaten. För klassisk ultraljudsbehandling med sond är en ultraljudshomogenisator som UP100H eller UP200Ht med mikrospets mest lämplig.
Protokoll för ultraljudsbehandling med sond: Placera ultraljudsapparatens sond i provvolymen i ett mikrocentrifugrör och ultraljudsbehandla i cirka 10 sekunder. Beroende på DNA-provet kan ultraljudsbehandlingen behöva upprepas en eller två gånger till. Den erforderliga tillförseln av ultraljudsenergi (Ws/mL) beror på provets viskositet och DNA-typ. Kylning med isbad och ultraljudsapparatens pulsläge hjälper till att förhindra termisk nedbrytning av provet.
Efter celllys med ultraljud centrifugeras provet för att avskilja cellrester som bildar en pellet (innehållande olyserade celler, cellkärnor och olyserade organeller)
Om provet inte omedelbart bearbetas vidare kan det förvaras vid en lämplig temperatur för att bevara dess livsduglighet.

Ultraljudsapparater för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade plattformar för fragmentering av DNA, RNA och kromatin. Dessa olika plattformar omfattar ultraljudssonder (sonotroder), lösningar för indirekt ultraljudsbehandling för samtidig provberedning av flera rör eller flerbrunnsplattor (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor), sonoreaktorer och ultraljudscuphorn. Alla plattformar för skjuvning av DNA drivs av frekvensavstämda, högpresterande ultraljudsprocessorer som kan styras exakt och ger reproducerbara resultat.

Ultraljudsprocessorer för alla provantal och provstorlekar

Med Hielschers ultraljudsapparater för flera prover, VialTweeter (för upp till 10 provrör) och UIP400MTP (för mikroplattor/flerbrunnsplattor), blir det enkelt att minska provbearbetningstiden tack vare intensiv och exakt styrbar ultraljudsbehandling, samtidigt som önskad storleksfördelning och önskat utbyte av DNA-fragment erhålls. DNA-fragmentering med ultraljud gör stegen i plasmidberedningen effektiva, tillförlitliga och skalbara. Protokoll kan skalas linjärt från ett till ett stort antal prover genom att hålla ultraljudsparametrarna konstanta.
Ultraljudsapparater med sonder med en till fem fingrar är idealiska för beredning av ett mindre antal prover. Hielschers ultraljudsapparater för laboratorier finns med olika effektnivåer så att du kan välja den idealiska ultraljudsdisruptorn för din DNA-relaterade tillämpning.