Plasmidförberedelse med hjälp av ultraljud

Ultraljud är en pålitlig teknik för att fragmentera plasmid DNA. Exakt kontrollerbar amplitud, pulsationsläge och temperaturkontroll är de viktigaste egenskaperna hos en ultraljudsapparat för icke-skadlig plasmidfragmentering. Dessutom hjälper användningen av vissa medel till att skydda mot plasmidnedbrytning. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för kontrollerad plasmidfragmentering från enstaka flaskor, samtidigt ultraljudsbehandling av många prover samt flera brunnsplattor. Lär dig mer om framgångsrik fragmentering av ultraljudsplasmider!

Plasmidskjuvning med hjälp av ultraljud

När DNA-prover utsätts för ultraljudsvågor skapar de ultraljudsgenererade vibrationerna akustisk kavitation i vätskan som skjuver eller bryter DNA-molekyler med hög molekylvikt via mekaniska krafter. Ultraljudsbehandling är den mest använda metoden för bulk DNA-skjuvningsexperiment inklusive tillämpningar, såsom Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), för vilka små fragmentstorlekar är helt avgörande för att få hög upplösning. (jfr Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) är en specifik form av DNA, som kännetecknas av sin ringform och finns i bakterier och vissa eukaryoter.
Superlindat pDNA är den önskade formen av plasmid-DNA eftersom det visar bäst resultat i nedströmsprocesser som automatiserad sekvensering och transfektion. Ultraljud är lämpligt för att fragmentera pDNA, inklusive superlindat pDNA, framgångsrikt.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

Användning av plasmidvektorer

Plasmider används ofta som verktyg för att klona, överföra och manipulera gener. När plasmider används experimentellt för dessa ändamål kallas de vektorer. DNA-fragment eller gener kan infogas i en plasmidvektor och skapa en så kallad rekombinant plasmid. Plasmidvektorer används som bärare för att driva rekombinant DNA in i en värdcell och är en nyckelkomponent i molekylär kloning.
“Icke-virala vektorer studeras i stor utsträckning för deras potentiella användning inom genterapi för att behandla olika komplicerade sjukdomar. Icke-virala vektorer skyddar plasmid-DNA mot fysisk, kemisk och enzymatisk nedbrytning och levererar DNA-molekylen till målplatsen. Till exempel bildar katjoniska liposomer, kitosan och andra positivt laddade nanopartiklar komplex med plasmid-DNA genom elektrostatiska interaktioner. De lättbildade katjoniska liposomerna/plasmid-DNA-komplexen är dock relativt stora (dvs. 300–400 nm) och heterogena till sin natur, vilket gör dem svåra att använda i farmaceutiska tillämpningar. De stora och heterogena plasmid-DNA/liposomerna, plasmid-DNA/aerosoler och plasmid-DNA/peptidkomplex kan reduceras till mindre och homogena partiklar med hjälp av ultraljud.” (Sarker et al., 2019)
Ett framträdande exempel på användning av plasmidvektorer är CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet levereras vanligtvis till celler som en enda stor plasmid eller flera mindre plasmider som kodar för en målsekvens, en CRISPR-guide och Cas9.

Ultraljudsberedning av DNA-laddade PLGA-nanopartiklar genom nanoprecipitation

Jo et al. (2020) använde poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) för att bilda en nanopartikelbärare för leverans av en modell CRISPR-Cas9-plasmid till primära benmärgshärledda makrofager. För nanoutfällning av PLGA-nanopartiklar användes PLGA med två olika ändgrupper (ester- och amingrupper) med målet att de positivt laddade aminändlocken ökar inkapslingseffektiviteten och belastningen på grund av laddningsinteraktionerna mellan den och den negativt laddade ryggraden i DNA. I ett 50 ml koniskt centrifugrör av polypropen löstes 100 mg Pluronic F127 i 20 ml autoklaverat DI-vatten genom virvelblandning följt av 30 minuters skonsam ultraljudsbehandling med hjälp av ett ultraljudsbad (se CupHorn). En autoklaverad magnetomrörare tillsattes och lösningen blandades vid 600 rpm i 30 minuter medan de andra lösningarna gjordes. Laboratorieartiklar av plast användes genomgående istället för glas för att minimera ospecifik adsorption av DNA. Lösningar av PLGA upplöst i DMF (44,48 mg/ml) och TIPS pentacen upplöst i THF (0,667 mg/ml) framställdes separat. PLGA lämnades vilande att blöta i DMF i 30 minuter innan den sonikerades i 30 minuter. (för fullständigt protokoll se Jo et al., 2020)

Plasmid DNA-skydd under ultraljudsbehandling

DNA, inklusive plasmider och superspolade plasmider, är mycket känsliga för nedbrytning. Alla tillgängliga fragmenteringsmetoder är kända för vissa nackdelar. Ultraljud DNA-fragmentering är en av de föredragna metoderna eftersom kontrollerad ultraljudsbehandling i kombination med skyddsåtgärder gör det möjligt att minska skjuv- och värmeinducerad skada på DNA-strängar.
Förutom inställningar för låg amplitud, pulsationsläge och temperaturkontroll under ultraljuds-DNA-skjuvning, visade användningen av vissa medel signifikant skyddande effekt mot DNA-nedbrytning. Till exempel skyddar olika polymerer, peptider och lipider plasmid-DNA under ultraljud.

Stabiliteten hos plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex mot ultraljudsskjuvspänning undersöktes med hjälp av agarosgelelektroforesanalys. Både plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning under olika tidpunkter. Plasmid-DNA:t utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30 och 40 minuter. Plasmid-DNA/IL-nanokomplexen utsattes dock för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter.(studie och bild: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) visade att när nanostrukturerna för plasmid-DNA? jonisk vätska (pDNA/IL) utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter och komplexerade med det kommersiellt tillgängliga katjoniska genleveransmedlet lipofektamin, var andelen fluorescerande positiva celler 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 % respektive 50 % (se diagram nedan). Andelen fluorescerande positiva celler ökade när nanostrukturerna utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 10 och 20 minuter, och minskade därefter långsamt.

Inverkan av jonisk vätska [Bmim][PF6] på leveransen av plasmid-DNA till COS7-celler. Plasmid DNA/IL (jonisk vätska) nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvstress i upp till 120 minuter och komplexerades med LA innan de levererades in i COS7-celler. Data visar det genomsnittliga antalet (%) GFP-positiva HeLa-celler räknade i 10 olika mikroskopiska fält och experimentet utfördes flera gånger på tre olika dagar. (Studie och diagram: ©Sarker et al., 2019)

Förberedelse av ultraljudslysat

Protokoll för ultraljudscelllys
Börja med ett berikat prov av celler som preparerats via en cellseparationsmetod (t.ex. immunmagnetisk cellseparation, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscellisolering).
Cellproverna måste visa en volym av en lysbuffert som är lämplig för det experimentella målet och ultraljudsapparat av sondtyp.
Hypotoniska buffertar är att föredra eftersom de förbättrar ultraljudscelllys. Det är viktigt att tillsatser och saltkoncentration används på ett lämpligt sätt.
Välj din ultraljudslysanordning: För indirekt ultraljudsbehandling av injektionsflaskor rekommenderas VialTweeter eller CupHorn. För multiwell-plattor är UIP400MTP den perfekta ultraljudsapparaten. Och klassisk sond-typ ultraljudsbehandling, en ultraljud homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospets är mest lämpliga.
Protokoll för sond-typ ultraljudsbehandling: Placera ultraljudssonden i provvolymen i ett mikrocentrifugrör och sonikera i ca 10 sekunder. Beroende på DNA-provet kan ultraljudsbehandlingen upprepas en eller två gånger till. Den nödvändiga ultraljudsenergitillförseln (Ws/ml) beror på provets viskositet och DNA-typ. Kylning via isbad och pulsationsläge för ultraljudaren hjälper till att förhindra att provet bryts ned termiskt.
Efter ultraljudslys centrifugeras provet för att separera pelletsskräp (som innehåller olyserade celler, kärnor och olyserade organeller)
Om provet inte omedelbart bearbetas ytterligare kan det förvaras vid en lämplig temperatur för att bevara dess livskraft.

Ultraljudsapparater för DNA-fragmentering

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade plattformar för DNA, RNA och kromatinfragmentering. Dessa olika plattformar inkluderar ultraljudssonder (sonotroder), indirekta ultraljudslösningar för samtidig provberedning av flera rör eller flerbrunnsplattor (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor), sonorektorer och ultraljudskoppar. Alla plattformar för DNA-skjuvning drivs av frekvensjusterade, högpresterande ultraljudsprocessorer, som är exakt kontrollerbara och ger reproducerbara resultat.

Ultraljudsprocessorer för alla provnummer och storlekar

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.