Plasmidförberedelse med hjälp av ultraljud
Ultraljud är en pålitlig teknik för att fragmentera plasmid DNA. Exakt kontrollerbar amplitud, pulsationsläge och temperaturkontroll är de viktigaste egenskaperna hos en ultraljudsapparat för icke-skadlig plasmidfragmentering. Dessutom hjälper användningen av vissa medel till att skydda mot plasmidnedbrytning. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för kontrollerad plasmidfragmentering från enstaka flaskor, samtidigt ultraljudsbehandling av många prover samt flera brunnsplattor. Lär dig mer om framgångsrik fragmentering av ultraljudsplasmider!

Den UIP400MTP Möjliggör exakt kontrollerad ultraljudsbehandling av plattor med flera brunnar. En av tillämpningarna av UIP400MTP är fragmentering av plasmid-DNA för att erhålla fragment av en specifikt riktad längd.
Plasmidskjuvning med hjälp av ultraljud
När DNA-prover utsätts för ultraljudsvågor skapar de ultraljudsgenererade vibrationerna akustisk kavitation i vätskan som skjuver eller bryter DNA-molekyler med hög molekylvikt via mekaniska krafter. Ultraljudsbehandling är den mest använda metoden för bulk DNA-skjuvningsexperiment inklusive tillämpningar, såsom Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), för vilka små fragmentstorlekar är helt avgörande för att få hög upplösning. (jfr Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) är en specifik form av DNA, som kännetecknas av sin ringform och finns i bakterier och vissa eukaryoter.
Superlindat pDNA är den önskade formen av plasmid-DNA eftersom det visar bäst resultat i nedströmsprocesser som automatiserad sekvensering och transfektion. Ultraljud är lämpligt för att fragmentera pDNA, inklusive superlindat pDNA, framgångsrikt.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.
- Exakt kontrollerbar
- Reproducerbara resultat
- Justerbar för att rikta in sig på DNA-fragmentlängder
- Temperaturkontroll
- Skalbar till alla provstorlekar
Användning av plasmidvektorer
Plasmider används ofta som verktyg för att klona, överföra och manipulera gener. När plasmider används experimentellt för dessa ändamål kallas de vektorer. DNA-fragment eller gener kan infogas i en plasmidvektor och skapa en så kallad rekombinant plasmid. Plasmidvektorer används som bärare för att driva rekombinant DNA in i en värdcell och är en nyckelkomponent i molekylär kloning.
“Icke-virala vektorer studeras i stor utsträckning för deras potentiella användning inom genterapi för att behandla olika komplicerade sjukdomar. Icke-virala vektorer skyddar plasmid-DNA mot fysisk, kemisk och enzymatisk nedbrytning och levererar DNA-molekylen till målplatsen. Till exempel bildar katjoniska liposomer, kitosan och andra positivt laddade nanopartiklar komplex med plasmid-DNA genom elektrostatiska interaktioner. De lättbildade katjoniska liposomerna/plasmid-DNA-komplexen är dock relativt stora (dvs. 300–400 nm) och heterogena till sin natur, vilket gör dem svåra att använda i farmaceutiska tillämpningar. De stora och heterogena plasmid-DNA/liposomerna, plasmid-DNA/aerosoler och plasmid-DNA/peptidkomplex kan reduceras till mindre och homogena partiklar med hjälp av ultraljud.” (Sarker et al., 2019)
Ett framträdande exempel på användning av plasmidvektorer är CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-systemet levereras vanligtvis till celler som en enda stor plasmid eller flera mindre plasmider som kodar för en målsekvens, en CRISPR-guide och Cas9.
Ultraljudsberedning av DNA-laddade PLGA-nanopartiklar genom nanoprecipitation
Jo et al. (2020) använde poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) för att bilda en nanopartikelbärare för leverans av en modell CRISPR-Cas9-plasmid till primära benmärgshärledda makrofager. För nanoutfällning av PLGA-nanopartiklar användes PLGA med två olika ändgrupper (ester- och amingrupper) med målet att de positivt laddade aminändlocken ökar inkapslingseffektiviteten och belastningen på grund av laddningsinteraktionerna mellan den och den negativt laddade ryggraden i DNA. I ett 50 ml koniskt centrifugrör av polypropen löstes 100 mg Pluronic F127 i 20 ml autoklaverat DI-vatten genom virvelblandning följt av 30 minuters skonsam ultraljudsbehandling med hjälp av ett ultraljudsbad (se CupHorn). En autoklaverad magnetomrörare tillsattes och lösningen blandades vid 600 rpm i 30 minuter medan de andra lösningarna gjordes. Laboratorieartiklar av plast användes genomgående istället för glas för att minimera ospecifik adsorption av DNA. Lösningar av PLGA upplöst i DMF (44,48 mg/ml) och TIPS pentacen upplöst i THF (0,667 mg/ml) framställdes separat. PLGA lämnades vilande att blöta i DMF i 30 minuter innan den sonikerades i 30 minuter. (för fullständigt protokoll se Jo et al., 2020)
- Extraktion av DNA
- Inkapsling av DNA
- Dispersion av nanopartikelbelagt DNA
- Leverans av plasmid-DNA till celler

UP200St CupHorn för indirekt ultraljudsbehandling av prover, t.ex. för DNA-extraktion och fragmentering.
Plasmid DNA-skydd under ultraljudsbehandling
DNA, inklusive plasmider och superspolade plasmider, är mycket känsliga för nedbrytning. Alla tillgängliga fragmenteringsmetoder är kända för vissa nackdelar. Ultraljud DNA-fragmentering är en av de föredragna metoderna eftersom kontrollerad ultraljudsbehandling i kombination med skyddsåtgärder gör det möjligt att minska skjuv- och värmeinducerad skada på DNA-strängar.
Förutom inställningar för låg amplitud, pulsationsläge och temperaturkontroll under ultraljuds-DNA-skjuvning, visade användningen av vissa medel signifikant skyddande effekt mot DNA-nedbrytning. Till exempel skyddar olika polymerer, peptider och lipider plasmid-DNA under ultraljud.

Stabiliteten hos plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex mot ultraljudsskjuvspänning undersöktes med hjälp av agarosgelelektroforesanalys. Både plasmid-DNA och plasmid-DNA/IL-nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvspänning under olika tidpunkter. Plasmid-DNA:t utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30 och 40 minuter. Plasmid-DNA/IL-nanokomplexen utsattes dock för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter.
(studie och bild: ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) visade att när nanostrukturerna för plasmid-DNA? jonisk vätska (pDNA/IL) utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuter och komplexerade med det kommersiellt tillgängliga katjoniska genleveransmedlet lipofektamin, var andelen fluorescerande positiva celler 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 % respektive 50 % (se diagram nedan). Andelen fluorescerande positiva celler ökade när nanostrukturerna utsattes för ultraljudsskjuvspänning i 10 och 20 minuter, och minskade därefter långsamt.

Inverkan av jonisk vätska [Bmim][PF6] på leveransen av plasmid-DNA till COS7-celler. Plasmid DNA/IL (jonisk vätska) nanokomplex utsattes för ultraljudsskjuvstress i upp till 120 minuter och komplexerades med LA innan de levererades in i COS7-celler. Data visar det genomsnittliga antalet (%) GFP-positiva HeLa-celler räknade i 10 olika mikroskopiska fält och experimentet utfördes flera gånger på tre olika dagar. (Studie och diagram: ©Sarker et al., 2019)

Plasmid-DNA kan skyddas genom att lägga till ett medel före ultraljudsfragmentering: Ultraljudsbehandling-inducerad nedbrytning av naket pDNA (A) och av pDNA formulerat med 1,5 mM CaCl2 och 20 % (v/v) t-butanol (B)
Prover sonikerades med en 20W sond i upp till 120s, som anges på toppen av varje körfält. Körfält H motsvarar markören för Hyperladder I ™️. OC- och SC-plasmidbanden är indikerade.
(studie och bilder: ©Wu et al., 2009)
Förberedelse av ultraljudslysat
Protokoll för ultraljudscelllys
Börja med ett berikat prov av celler som preparerats via en cellseparationsmetod (t.ex. immunmagnetisk cellseparation, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), densitetsgradientcentrifugering, immundensitetscellisolering).
Cellproverna måste visa en volym av en lysbuffert som är lämplig för det experimentella målet och ultraljudsapparat av sondtyp.
Hypotoniska buffertar är att föredra eftersom de förbättrar ultraljudscelllys. Det är viktigt att tillsatser och saltkoncentration används på ett lämpligt sätt.
Välj din ultraljudslysanordning: För indirekt ultraljudsbehandling av injektionsflaskor rekommenderas VialTweeter eller CupHorn. För multiwell-plattor är UIP400MTP den perfekta ultraljudsapparaten. Och klassisk sond-typ ultraljudsbehandling, en ultraljud homogenisator som UP100H eller UP200Ht med en mikrospets är mest lämpliga.
Protokoll för sond-typ ultraljudsbehandling: Placera ultraljudssonden i provvolymen i ett mikrocentrifugrör och sonikera i ca 10 sekunder. Beroende på DNA-provet kan ultraljudsbehandlingen upprepas en eller två gånger till. Den nödvändiga ultraljudsenergitillförseln (Ws/ml) beror på provets viskositet och DNA-typ. Kylning via isbad och pulsationsläge för ultraljudaren hjälper till att förhindra att provet bryts ned termiskt.
Efter ultraljudslys centrifugeras provet för att separera pelletsskräp (som innehåller olyserade celler, kärnor och olyserade organeller)
Om provet inte omedelbart bearbetas ytterligare kan det förvaras vid en lämplig temperatur för att bevara dess livskraft.
Ultraljudsapparater för DNA-fragmentering
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade plattformar för DNA, RNA och kromatinfragmentering. Dessa olika plattformar inkluderar ultraljudssonder (sonotroder), indirekta ultraljudslösningar för samtidig provberedning av flera rör eller flerbrunnsplattor (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor), sonorektorer och ultraljudskoppar. Alla plattformar för DNA-skjuvning drivs av frekvensjusterade, högpresterande ultraljudsprocessorer, som är exakt kontrollerbara och ger reproducerbara resultat.
Ultraljudsprocessorer för alla provnummer och storlekar
With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

Enheten för förberedelse av ultraljud med flera prover VialTweeter möjliggör samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaskor. Med klämanordningen VialPress kan upp till 4 extra rör pressas fram för intensiv ultraljudsbehandling.
Exakt processtyrning
Precisely controllable sonication settings are crucial since exhaustive sonification can destroy DNA, RNA and chromatin, but inadequate ultrasonic shearing results in too long DNA and chromatin fragments. Hielscher’s digital ultrasonicators can be easily set to precise sonication parameter. Specific sonication settings can be also saved as programmed setting for fast repetition of the same procedure.
All ultraljudsbehandling protokollförs automatiskt och lagras som CSV-fil på ett inbyggt SD-kort. Detta möjliggör noggrann dokumentation av utförda försök och gör det möjligt att enkelt revidera ultraljudsbehandling.
Via webbläsarens fjärrkontroll kan alla digitala ultraljudsapparater användas och övervakas via vilken standardwebbläsare som helst. Installation av ytterligare programvara krävs inte, eftersom LAN-anslutningen är en mycket enkel plug-n-play-installation.
Högsta användarvänlighet under ultraljud DNA-förberedelse
Alla Hielscher ultraljudsapparater är utformade för att leverera högpresterande ultraljud, samtidigt som de alltid är mycket användarvänliga och lätta att använda. Alla inställningar är välstrukturerade i en tydlig meny, som enkelt kan nås via färgpekskärm eller webbläsarens fjärrkontroll. Den smarta programvaran med programmerbara inställningar och automatisk datainspelning säkerställer optimala ultraljudsinställningar för tillförlitliga och reproducerbara resultat. Det rena och lättanvända menygränssnittet förvandlar Hielscher ultraljudsapparater till användarvänliga och effektiva enheter.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra labb ultraljudsapparater för celllys och DNA-fragmentering:
Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
---|---|---|
Plattor med flera brunnar | n/a | UIP400MTP |
Ampuller, liten bägare | n/a | Ultraljud CupHorn |
upp till 10 injektionsflaskor | n/a | VialTweeter |
1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
Kontakta oss!? Fråga oss!
Litteratur? Referenser
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Fakta som är värda att veta
Vad är plasmider?
En plasmid är en liten cirkulär DNA-molekyl som är fysiskt skild från kromosomalt DNA och replikerar självständigt. Plasmider är ofta förknippade med gener som bidrar till en organisms överlevnad och ger specifika fördelar, t.ex. antibiotikaresistens. Plasmider finns oftast som små cirkulära, dubbelsträngade DNA-molekyler i bakterier; Plasmider finns dock ibland i arkéer och eukaryota organismer. Plasmider är viktiga verktyg inom molekylärbiologi, genetik, biokemi och biovetenskap. Plasmider är kända som vektorer inom genteknik och används för att replikera eller uttrycka vissa gener. Den riktade ändringen av en vektor kallas vektordesign.
GFP-analys inom cellforskning
Grönt fluorescerande protein (GFP) är en mångsidig biologisk markör för övervakning av fysiologiska processer, visualisering av proteinlokalisering och detektion av transgent uttryck in vivo. GFP kan exciteras av 488 nm laserlinjen och detekteras optimalt vid 510 nm.

Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från labb till industriell storlek.