Ultraljudsbaserad beredning av C. elegans-prover

C. elegans, en nematod, är en modellorganism som används i stor utsträckning inom biologin. Provberedning inför analys kräver lysering, protein- och lipidextraktion samt RNA-fragmentering, vilket kan utföras tillförlitligt med ultraljudsbehandling. Ultraljudsbaserade celldisruptorer är tillförlitliga, avancerade och lättanvända instrument för snabb beredning av C. elegans-prover.

Ultraljudsbaserad beredning av C. elegans-prover

Caenorhabditis elegans är rundmaskar som används i stor utsträckning i forskningslaboratorier för att studera genomik, utvecklingsbiologi och sjukdomar. Många gener i C. elegans genom har funktionella motsvarigheter hos människan. Därför är nematoden en ytterst användbar modell för mänskliga sjukdomar. Andra fördelar som bidrar till den utbredda användningen av C. elegans är att den är enkel och billig att odla på plattor som innehåller bakterier (t.ex. E. coli), att den är genomskinlig och lätt att hantera samt att maskarna kan frysas och förvaras under en längre tid.
Protein- och lipidanalys är rutinmetoder i laboratorier, och ultraljudsbaserad provberedning är den etablerade metoden för att lysera C. elegans-nematoder i varje utvecklingsstadium (dvs. embryon, larver L1–L4 och vuxna individer). Eftersom C. elegans även används som ett proteinexpressionssystem för att överuttrycka specifika proteiner krävs en tillförlitlig, reproducerbar metod för lysering och proteinextraktion som ger höga proteinutbyten. Ultraljudssystem för celldisruption och extraktion finns som sondhomogenisatorer och som ultraljudsinstrument för flera prover. Hielscher Ultrasonics har den idealiska ultraljudsbaserade celldisruptorn för din laboratoriemetod, med bekväm provberedning för alla provstorlekar och provantal.

Protokoll för ultraljudsbaserad sönderdelning och lysering av C. elegans

Ultraljudshomogenisering och lysering av C. elegans samt efterföljande protein- och lipidextraktion kan utföras med olika förfaranden och med olika homogeniserings- och lyseringsbuffertar etc. Gemensamt för alla lyseringsprotokoll är att proverna hela tiden måste hållas på is för att förhindra proteinnedbrytning. Nedan presenterar vi några tillförlitliga och snabba protokoll för ultraljudslysering och extraktion för beredning av högkvalitativa C. elegans-prover som innehåller proteiner eller lipider.

Fördelar med ultraljudslysering av C. elegans

• tillförlitlig
• reproducerbar
• exakt temperaturkontrollerad
• tillförlitlig processtyrning
• skonsam metod
• enkel att använda
• säker

Ultraljudsbaserad proteinextraktion från C. elegans-prover

Ultraljudslysering och proteinextraktion av C. elegans-maskar kan utföras enligt olika protokoll. Nedan presenterar vi några tillförlitliga och snabba lyseringsprotokoll för reproducerbara proteinextraktionsresultat.

Snabb beredning av cytosoliskt extrakt från C. elegans-maskar med ultraljudsbehandling

Med följande protokoll kan du bereda C. elegans-lysat på mindre än 30 minuter.
Insamling av C. elegans
Plocka de önskade C. elegans-maskarna till ett 1,5ml-rör med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller skölj av dem från en platta med 1,5ml PBS. Centrifugera i 1min vid 2000rpm för att bilda en pellet. Håll proverna hela tiden på is.
Tvätta sedan maskarna två gånger med PBS.
Tvätta därefter maskarna två gånger med ddH₂O.
Resuspendera maskarna i minst 500ul homogeniseringsbuffert (HB). Maskproverna är nu redo för ultraljudslysering.
För att få proteinextrakt av högre kvalitet kan du minska bakteriekontamineringen genom att tvätta maskarna i 5min vardera i PBS och sterilt, ultrarent vatten (ddH₂O) eller utföra sackarosflotation. Håll maskproverna hela tiden på is.

Protokoll för ultraljudslysering av C. elegans

• Se till att förbereda ultraljudsinstrumentet i förväg så att ultraljudshomogenisatorn är klar att använda (sonden monterad, ultraljudsprogrammet förinställt). 

Om din ultraljudsapparat är stativmonterad placerar du isbadet med provrören under ultraljudssonden och för in ultraljudssonden i 1,5ml-röret.

• För lysering av C. elegans med UP200St eller UP200Ht bör ultraljudsbehandlingen utföras med en mikrospets (t.ex. 2mm-sonden S26d2; se bilden till vänster) vid 40% amplitud i 1sek med 30sek pauser emellan. 5 ultraljudscykler på vardera 1 sekund med 30sek pauser är idealiska för lysering av C. elegans. Om du utför lyseringen för första gången kan du kontrollera hur lyseringen fortskrider i små alikvoter av provet efter varje puls med hjälp av ett mikroskop.
• Lyseringen är framgångsrikt slutförd när maskarna har sönderdelats. För lång ultraljudsbehandling leder till att cellkärnorna bryts sönder och märks genom att provet blir visköst eller skummar. Använd vid behov fler pulser för att förhindra nedbrytning av provet. Förläng inte tiden för varje ultraljudspulscykel om du vill få proteinextrakt av hög kvalitet.
• Klarna celllysatet genom att centrifugera de ultraljudslyserade maskarna vid 14 000rpm i 10min vid 4ºC.
• Överför därefter supernatanten till ett nytt rör och förbered för immunoprecipitation eller andra analyser.

Anmärkning om homogeniseringsbufferten: Bered homogeniseringsbufferten för ultraljudslyseringsprotokollet ovan enligt följande:

Lysering av C. elegans med högt provgenomflöde i 96-brunnsplattor med plattsonikatorn UIP400MTP

Lysering av C. elegans (vuxna nematoder)
UIP400MTP 80% amplitud, 20 cykler (varje ultraljudscykel: 30 sek PÅ, 30 sek AV)
Lyseringsbuffert:

• Alternativ 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Alternativ 2) för koimmunoprecipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete-proteinashämmarcocktail)

DNA-fragmentering med högt provgenomflöde
DNA från C. elegans (vuxna nematoder) 200–300bp: plattsonikatorn UIP400MTP – ställ in 80% amplitud, 30pulser – vardera 30sek på, 30sek av

Plattsonikatorn UIP400MTP för provberedning med högt provgenomflöde ultraljudsbehandlar prover jämnt i flerbrunnsplattor, mikrotiterplattor och 96-brunnsplattor

Ultraljudslysering av C. elegans för kvantitativa affinitetsreningsanalyser

C. elegans-embryon (∼2 miljoner per replikat) skördades färska i biologiska triplikat genom blekning av unga äggbärande hermafroditer och ultraljudsbehandlades på is (cykel: 0,5 s, amplitud: 40–45%, 5 pulser/omgång, 5 omgångar, intervall mellan omgångarna: 30 s; ultraljudsprocessorn UP200S med mikrospets S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) i lyseringsbuffert (totalvolym: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteashämmarblandning, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Efter ultraljudsbehandlingen tillsattes Nonidet P-40 Substitute upp till 1% och lysaten inkuberades under rotation ände över ände vid 4°C i 30 min, följt av centrifugering vid 20 000 × g i 20 min vid 4°C. Det klarnade lysatet aspirerades därefter utan att störa det övre lipidskiktet och delades i två lika stora delar, som tillsattes till anti-GFP-agarospärlor respektive blockerade kontrollpärlor (40–50 μl). Efter rotation ände över ände vid 4°C i 60–90 min tvättades pärlorna en gång med lyseringsbuffert innehållande 0,1% Nonidet P-40 Substitute, följt av två tvättar i antingen buffert I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller buffert II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller båda. För GFP:MBK-2-pull-down utfördes två separata experiment med olika tvättbetingelser. Proteiner eluerades genom orbitalskakning i 50 μl 6 m urea/2 M tiourea vid rumstemperatur. För MBK-1::GFP-pull-down-experimenten eluerades proteinerna två gånger genom skakning i 50μl 8 m guanidiniumklorid vid 90°C, följt av etanolutfällning. De eluerade proteinproverna digererades därefter i lösning.
(jfr Chen et al., 2016)

Homogenisering och lysering av maskar med ultraljud

För lysering av C.elegans och proteinextraktion samlades 30 000 nematoder i det aktuella utvecklingsstadiet per prov och tvättades i iskallt S-basalmedium, koncentrerades genom centrifugering vid 1500 rpm i 2 min., tvättades sex gånger med iskallt S-basalmedium för att avlägsna kvarvarande bakterier och förvarades sedan på is tills de skulle användas. För proteinextraktion fick äggbärande vuxna maskar bilda en kompakt pellet efter den sista tvätten med S-basalmedium. Maskpelletarna resuspenderades sedan i 1 ml iskall extraktionsbuffert [20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteashämmare (Sigma P2714)] och bearbetades omedelbart.
∼30 000 äggbärande vuxna maskar (motsvarande ∼100 mg våtvikt) ultraljudsbehandlades på is med en ultraljudsapparat av sondtyp (t.ex. UP50H med mikrospets MS2) vid 40% amplitud under 10 cykler med 3 sec på och 30 sec av, i 1 ml iskall extraktionsbuffert. (jfr Baskharan et al. 2012)

Ultraljudsextraktion av lipider från C. elegans

Inom lipidomik, en gren av metabolomiken, karakteriseras och analyseras den samlade uppsättningen lipider i biologiska system. C. elegans används i stor utsträckning inom lipidomik för att undersöka samspelet mellan lipider i ämnesomsättningen och deras effekter på hälsa och livslängd.
Lysering och extraktion med ultraljud används för att frigöra lipider såsom sfingolipider från embryon, larver och vuxna maskar av C. elegans. Ultraljudsbehandling används för att framställa maskhomogenat och därefter extrahera lipiderna ur provet.
Protokoll för ultraljudsextraktion av lipider från C. elegans
Tina C. elegans-pelleten på is och resuspendera med 0,5 ml ultrarent vatten. 
Ultraljudsbehandla C. elegans-proverna i 1,5mL provrör och håll proverna kontinuerligt på is.
Ultraljudsbehandling kan utföras med en ultraljudsapparat av sondtyp såsom UP200Ht, ultraljudsenheten för provberedning VialTweeter (samtidig ultraljudsbehandling av 10 prover) eller UIP400MTP (för ultraljudsbehandling av flerbrunnsplattor såsom 96-brunnsplattor).
Använd mikrospetsen S26d2 för lysering med ultraljud med UP200Ht. Förinställ ultraljudets cykelläge i den digitala menyn. Ställ in amplituden på 10% och ultraljudets cykelläge på 20 cykler med pulser på 2 sec och en paus på 30 sec. mellan varje ultraljudspuls.
Överför supernatanterna till glasrör med skruvlock. 
Utför Folch-extraktion genom att tillsätta 1 ml ultrarent vatten till varje glasrör och därefter tillsätta 6 ml 
kloroform/metanolblandning (förhållande = 2:1) till varje glasrör.
Vortexblanda varje glasrör i 30 sec, 4 gånger. 
Centrifugera rören vid 1 258 x g i 15 min (Eppendorf, 5810 R) för att ytterligare förbättra fasseparationen. 
Överför den nedre hydrofoba fraktionen till ett rent glasrör med en Pasteurpipett av glas. 
Torka den nedre hydrofoba fraktionen under kvävgasflöde i en kvävgasevaporator. 
Förvara den torkade pelleten i en frys vid -80 °C tills den ska användas. 


Beredning av masklysat med ultraljud

Masklysat: Maskar i L4-stadiet skördades och tvättades tre gånger med M9-buffert (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl och 0,87 mM MgSO₄) för att avlägsna alla bakterier. Efter att så mycket M9-buffert som möjligt hade avlägsnats resuspenderades maskarna i lyseringsbuffert: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glycerolfosfat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,2 mM fenylmetansulfonylfluorid och proteashämmare. Maskarna frystes i flytande kväve och tinades vid 37°C tre gånger, varefter maskarna ultraljudsbehandlades på torris med en VialTweeter-ultraljudsenhet för samtidig beredning av 10 provrör. Ultraljudsbehandlingen utfördes vid 50% amplitud i 10 cykler om 2 sek. med 30 sek. paus mellan ultraljudspulserna. Därefter centrifugerades proverna vid 12 000 rpm vid 4°C i 15 min. Supernatanten samlades upp och förvarades vid -70°C. En alikvot användes för proteinkvantifiering med Bradford-analys.
Bestämning av totalt glutation, GSH och GSSG: För glutationkvantifiering framställdes lysat och utfördes bestämningen samma dag. Glukosutfodrade L4-larver och L4-kontrollarver skördades och tvättades tre gånger med M9-buffert. Efter att så mycket M9-buffert som möjligt hade avlägsnats resuspenderades maskarna i iskall metafosforsyra (5% w/v), varefter maskarna ultraljudsbehandlades i is med en VialTweeter-ultraljudsenhet vid 50% amplitud i tio ultraljudscykler om 2 sek. med 30 sek. paus mellan varje cykel. Därefter centrifugerades de vid 12 000 rpm vid 4 ̊C i 15 min.
(jfr Alcántar-Fernández et al., 2018)

Provberedning av C. elegans före immunoprecipitation och Western blotting

Kortfattat odlades C. elegans-larver i L1-stadiet till vuxenstadiet i storskaliga flytande S-mediumkulturer för framställning av embryonala extrakt. Embryon samlades in med standardmetoden med blekmedel och suspenderades i lyseringsbuffert (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteashämmarcocktail och 1􏰅 fosfatashämmarcocktail I och II), snabbfrystes i flytande kväve och lyserades genom cellupplösning med ultraljud med hjälp av en ultraljudsenhet med mikrospets, såsom UP200Ht med S26d2 med 10 pulser under 10 s vid 30% amplitud. Om ett större antal prover måste beredas rekommenderas ultraljudsenheten VialTweeter eller ultraljudsenheten UIP400MTP för samtidig behandling av flera prover i brunnsplattor. Efter ultraljudsbehandlingen förklarades extrakten genom centrifugering vid 30 000g i 20 min vid 4°C. Det förklarade extraktet (300µg totalt protein) inkuberades med 40µ􏰂g affinitetsrenad anti-CDC-25.1-antikropp (denna studie) tvärbunden till protein A-agaros, eller så användes som kontroll en liknande mängd kaninimmunglobulin (Ig)G tvärbundet till protein A-agaros, i en total volym av 200µl lyseringsbuffert innehållande 1% NP-40, vars tillsats minskade ospecifik bindning av proteiner till matrisen. Proverna roterades i 1 h vid 4°C, kulorna tvättades tre gånger med lyseringsbuffert och eluerades med 30µl glycin/HCl och 200 mM NaCl, pH 2,2. Efter immunoprecipitation späddes eluaten i 30µ􏰂l SDS-provbuffert, upphettades till 95°C i 4 min, och vanligtvis applicerades 3% av totalmängden som ingångsprov och 30% av eluaten på SDS-PAGE, följt av Western blotting med antikropparna anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) eller anti-􏰁β-aktin (1:2000). När extrakten inte genomgick immunoprecipitation resuspenderades samma mängd totalt protein från dessa extrakt i SDS-provbuffert, upphettades till 95°C och applicerades sedan direkt på SDS-PAGE och analyserades med Western blotting. (jfr Segref et al. 2020)

Ultraljudslysering med exakt temperaturkontroll

Exakt och tillförlitlig temperaturkontroll är avgörande vid hantering av biologiska prover. Höga temperaturer sätter igång värmeinducerad proteinnedbrytning i proverna.
Liksom alla mekaniska provberedningstekniker alstrar ultraljudsbehandling värme. Provernas temperatur kan dock kontrolleras väl när VialTweeter används. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen på dina prover medan du bereder dem med VialTweeter och VialPress inför analys.

1. Övervakning av provtemperaturen: Ultraljudsprocessorn UP200St, som driver VialTweeter, är utrustad med intelligent programvara och en anslutningsbar temperatursensor. Anslut temperatursensorn till UP200St och för in sensorns spets i ett av provrören. Via den digitala pekskärmen i färg kan du i menyn på UP200St ställa in ett specifikt temperaturintervall för ultraljudsbehandlingen av dina prover. Ultraljudsapparaten stannar automatiskt när maxtemperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen har sjunkit till det lägre värdet i det inställda temperaturintervallet ∆. Därefter startar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. VialTweeter-blocket kan förkylas. Placera VialTweeter-blocket (endast sonotroden utan omvandlare!) i kylskåpet eller frysen för att förkyla titanblocket, vilket hjälper till att fördröja temperaturökningen i provet. Om möjligt kan även själva provet förkylas.
3. Använd torris för kylning under ultraljudsbehandlingen. Använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan avledas.

Hitta den optimala ultraljudscelldisruptorn för din lystillämpning

Hielscher Ultrasonics har lång erfarenhet av tillverkning av högpresterande ultraljudscelldisruptorer och homogenisatorer för laboratorier samt system i bänkskala och industriell skala. Storleken på din bakteriecellodling, ditt forsknings- eller produktionsmål och den cellvolym som ska bearbetas per timme eller dag är avgörande faktorer för att hitta rätt ultraljudscelldisruptor för din tillämpning.
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för samtidig ultraljudsbehandling av flera prover (upp till 10 provflaskor) samt stora provmängder (dvs. mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor), från den klassiska sondbaserade ultraljudsapparaten för laboratorier med olika effektnivåer från 50 till 400 watt till helt industriella ultraljudsprocessorer med upp till 16 000 watt per enhet för kommersiell celldisruption och proteinextraktion i storskalig produktion. Alla Hielschers ultraljudsapparater är byggda för drift 24/7/365 under full belastning. Robusthet och tillförlitlighet är grundläggande egenskaper hos våra ultraljudsapparater.
Alla digitala ultraljudshomogenisatorer är utrustade med smart programvara, pekskärm i färg och automatisk dataloggning, vilket gör ultraljudsapparaten till ett praktiskt arbetsredskap i laboratorier och produktionsanläggningar.
Berätta vilken typ av celler, vilken volym, hur ofta och med vilket mål du behöver bearbeta dina biologiska prover. Vi rekommenderar den ultraljudscelldisruptor som är bäst lämpad för dina processkrav.

Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från kompakta handhållna homogenisatorer och ultraljudsapparater för flera prover till industriella ultraljudsprocessorer för kommersiella tillämpningar: