Ultraljudsberedning av C. elegans-prover

C. elegans, en nematodmask, är en allmänt använd modellorganism inom biologin. Provberedning före analys kräver lys, protein- och lipidextraktion samt RNA-fragmentering, vilket kan utföras på ett tillförlitligt sätt via ultraljudsbehandling. Ultraljudscellstörare är pålitliga, sofistikerade och lättanvända enheter för snabb beredning av C. elegans-prover.

Ultraljudsberedning av C. elegans-prover

C. elegans är rundmaskar som används i stor utsträckning i forskningslaboratorier för att undersöka genomik, utvecklingsbiologi och sjukdomar. Många gener i genomet hos C. elegans har funktionella motsvarigheter hos människor. Därmed är nematodmasken en extremt användbar modell för mänskliga sjukdomar. Andra fördelar med den breda användningen av C. elegans är dess enkla och billiga odling på plattor som innehåller bakterier (t.ex. E. coli), dess transparens, bekväm hantering samt möjligheten att frysa och förvara maskarna under en längre period.
Protein- och lipidanalys är vanliga procedurer i laboratorier och ultraljudsprovberedning är den etablerade metoden för att lysera C. elegans-nematoder i varje utvecklingsstadium (dvs. embryon, larver L1-L4, vuxna). Eftersom C. elegans också används som proteinuttryckssystem för att överuttrycka riktade proteiner, krävs en tillförlitlig, reproducerbar lys- och proteinextraktionsmetod, som ger hög proteinavkastning. Ultraljudscellstörning och extraktionssystem finns tillgängliga som homogenisatorer av sondtyp och som ultraljudsapparater med flera prov. Catering till bekväm provberedning och alla typer av provstorlekar nummer, Hielscher Ultrasonics har den perfekta ultraljudscellstöraren för ditt labbprocedur.

Ultraljudsprotokoll för C. elegans Disruption och Lysis

Ultraljudshomogenisering och lys av C. elegans och den efterföljande protein- och lipidextraktionen kan utföras med hjälp av olika procedurer med olika homogeniserings- och lysbuffertar etc. Gemensamt för alla lysprotokoll är att proverna kontinuerligt måste läggas på is för att förhindra proteinnedbrytning. Nedan presenterar vi några pålitliga och snabba ultraljudslys- och extraktionsprotokoll för beredning av högkvalitativa protein- eller lipidinnehållande C. elegans-prover.

Fördelar med ultraljud C. elegans Lysis

• Pålitlig
• Reproducerbara
• exakttemperaturkontrollerad
• Tillförlitlig processtyrning
• skonsam metod
• Lätt att applicera
• Säker

Ultraljud protein extraktion från C. elegans prover

Ultraljudslys och proteinextraktion av C. elegans-maskar kan utföras med hjälp av olika protokoll. Nedan presenterar vi några pålitliga och snabba lysprotokoll för reproducerbara proteinextraktionsresultat.

Snabb beredning av cytosoliskt extrakt från C. elegans maskar genom ultraljudsbehandling

Med följande protokoll kan du framställa C. elegans-lysat på mindre än 30 minuter.
Samling av C. elegans
Plocka de önskade C. elegans-maskarna i en 1,5 ml tubfosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller tvätta dem från en tallrik med 1,5 ml PBS. Centrifugera i 1 minut vid 2000 rpm till pellet. Förvara proverna hela tiden på is.
Tvätta sedan maskarna två gånger med PBS.
Tvätta sedan maskarna två gånger med ddH₂O.
Återsuspendera maskarna i minst 500 ul homogeniseringsbuffert (HB). Maskproverna är nu redo för ultraljudslys.
För högre kvalitet på proteinextraktet kanske du vill minska bakteriell kontaminering genom att tvätta maskarna i 5 minuter vardera i PBS och sterilt, ultrarent vatten (ddH₂O) eller utför sackarosflytning. Håll maskproverna kontinuerligt på is.

Ultraljud C. elegans lysis protokoll

• Se till att du förbereder ultraljudsapparaten i förväg så att ultraljudshomogenisatorn är redo att användas (sond monterad, ultraljudsbehandlingsprogram förinställt).

Om din ultraljudsapparat är monterad, placera isbadet med dina provrör under ultraljudssonden och sätt in ultraljudssonden i 1,5 ml röret.

• För C. elegans lys med UP200St eller UP200Ht, ultraljud bör utföras med hjälp av en mikrospets (t.ex. 2mm sond S26d2; se bilden till vänster) vid 40% amplitud i 1 sek med 30 sek pauser emellan. 5 ultraljudscykler för varje 1 sekund med 30sec pauser är idealiska för C. elegans lys. Om du utför lysen för första gången kan du kontrollera lysprogressionen i små alikvoter av provet efter varje puls med hjälp av ett mikroskop.
• Lysen är avslutad framgångsrikt när maskarna störs. Över-ultraljudsbehandling resulterar i brott av kärnor och blir synlig när provet blir visköst eller skummar. För att förhindra provnedbrytning, använd fler pulser om det behövs. Öka inte tiden för varje ultraljudspulscykel för att få proteinextrakt av hög kvalitet.
• Klarcellslysat genom centrifugering av ultraljudslyserade maskar vid 14 000 rpm i 10 minuter vid 4 °C.
• Överför sedan supernatanten till ett nytt rör och förbered för immunoprecipitering eller andra analyser.

Anmärkning för homogeniseringsbuffert: Förbered homogeniseringsbufferten för ultraljudslysprotokollet ovan enligt följande:

High-Throughput Lysis av C. elegans i 96-brunnars plattor med hjälp av UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (vuxna nematoder)
UIP400MTP 80% amplitud, 20 cykler (varje ultraljudsbehandling: 30 sek PÅ, 30 sek AV)
Buffert för lys:

• Alternativ 1) 4 % SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Alternativ 2) för Co-immunoprecipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (komplett cocktail av proteinashämmare)

DNA-fragmentering med hög genomströmning
C. elegans (vuxna nematoder) DNA 200-300bp: UIP400MTP platta sonikator – Ställ in 80 % amplitud, 30 pulser – varje 30sek på, 30sek av

UIP400MTP Plate Sonicator för höggenomströmning provberedning likformigt sonikerar prover i multi-brunnar, mikrotiterplattor och 96-brunnars plattor

Ultraljudslys av C. elegans för kvantitativ affinitetsreningsanalyser

C. elegans-embryon (∼2 miljoner per replikat) skördades nyligen i biologisk trippel genom blekning av unga gravida hermafroditer och sonikerades på is (cykel: 0,5 s, amplitud: 40–45 %, 5 slag/session, 5 sessioner, intervall mellan sessionerna: 30 s; UP200S ultraljudsprocessor med mikrospets S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) i lysbuffert (total volym: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10 % glycerol, proteashämmare blandning, 0,1 % Nonidet P-40 Substitute). Efter ultraljudsbehandling tillsattes Nonidet P-40 Substitute upp till 1% och lysaten inkuberades med huvud över svansen rotation vid 4 °C i 30 minuter, följt av centrifugering vid 20 000 × g i 20 minuter vid 4 °C. Rensat lysat aspirerades sedan utan att störa det övre lipidskiktet och delades upp till hälften i antingen anti-GFP-agarospärlorna eller de blockerade kontrollkulorna (40–50 μl). Efter rotation med huvudet över svansen vid 4 °C i 60–90 minuter tvättades pärlorna en gång med lysbuffert innehållande 0,1 % Nonidet P-40 Substitute, följt av två tvätttider i antingen buffert I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller buffert II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) eller båda. För GFP:MBK-2 pull-downs utfördes två separata experiment med olika tvättförhållanden. Proteiner eluerades genom orbital skakning i 50 μl 6 m urea/2 M tiourea vid rumstemperatur. För neddragningsexperimenten MBK-1::GFP eluerades proteiner två gånger genom att skaka i 50 μl 8 m guanidiniumklorid vid 90 °C, följt av etanolutfällning. Eluerade proteinprover rötades sedan i lösning.
(jfr Chen et al., 2016)

Ultraljud mask homogenisering och lys

För C.elegans-lys och proteinextraktionsprocedur samlades 30 000 nemotoder från det relevanta stadiet in per prov och tvättades i iskall S-basal, koncentrerades genom centrifugering vid 1500 rpm i 2 minuter, tvättades sex gånger med iskall S-basal för att avlägsna kvarvarande bakterier och lagrades sedan på is tills de var klara för användning. För proteinextraktion tilläts gravida-vuxna maskar att bilda en kompakt pellet efter den sista S-basala tvätten. Maskpellets återsuspenderades sedan i 1 ml iskall extraktionsbuffert [20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1 % Triton-X-100, proteashämmare (Sigma P2714)] och bearbetades omedelbart.
∼30 000 gravida-vuxna maskar (motsvarande ∼100 mg våtvikt), sonikerades på is med hjälp av en ultraljudsapparat av sondtyp (t.ex. UP50H med mikrospets MS2) vid 40% amplitud i 10 cykler av 3 sek på, 30 sek av, i 1 ml iskall extraktionsbuffert. (jfr Baskharan et al. 2012)

Ultraljud lipidextraktion från C. elegans

Inom lipidomik, en gren av metabolomik, karakteriseras och analyseras lipidkomplementet i biologiska system. C. elegans används i stor utsträckning inom lipidomik för att undersöka interaktionen mellan metaboliska lipider och deras effekter på hälsa och livslängd.
Ultraljud lys och extraktion används för att frigöra lipider såsom sfingolipider från C. elegans embryon, larver och vuxna maskar. Ultraljud används för att framställa maskhomogenat och därefter för att extrahera lipiderna från provet.
Protokoll för ultraljud lipid extraktion från C. elegans
Tina C. elegans-pelleten på is och blanda igen med 0,5 ml ultravatten. 
Ultraljudsbehandla C. elegans-proverna i 1,5 ml provrör, samtidigt som proverna hålls kontinuerligt på is.
Ultraljudsbehandling kan utföras med hjälp av en sond-ultraljudssstor som UP200Ht, enheten för förberedelse av ultraljudsprov VialTweeter (samtidig ultraljudsbehandling av 10 prover) eller UIP400MTP (för ultraljudsbehandling av plattor med flera brunnar, t.ex. 96-brunnsplattor). För ultraljudslys med UP200Ht använd mikrospetsen S26d2. Förinställ ultraljudscykelläget i den digitala menyn. Ställ in amplitud till 10% och ultraljudsbehandling cykel läge på 2 sek pulser på 20 cykler med en paus på 30 sek. mellan varje ultraljud pulsering burst.
Överför supernatanterna till glasrör med skruvlock. 
Utför Folch-extraktion genom att tillsätta 1 ml ultravatten till varje glasrör, följt av att tillsätta 6 ml kloroform/metanolblandning (förhållande = 2:1) till varje glasrör.
Virvla varje glasrör i 30 sekunder i 4 gånger. 
Centrifugera rören vid 1 258 x g i 15 minuter (Eppendorf, 5810 R) för att ytterligare förbättra fasseparationen. 
Överför den lägre hydrofoba fraktionen till ett rent glasrör med en Pasteur-pipett av glas. 
Torka den lägre hydrofoba fraktionen under kväveflöde i en kväveförångare. 
Förvara den torkade pelleten i en frys på -80 °C tills den ska användas.

Ultraljud beredning av masklysat

Masklysat: Maskar i L4-stadiet skördades och tvättades tre gånger med M9-buffert (42,26 mM Na₂Stadsorkester₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl och 0,87 mM MgSO₄) för att avlägsna alla bakterier. Efter att ha avlägsnat så mycket som möjligt av M9-bufferten återsuspenderades maskarna i lysbuffert: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfat β-glycerol, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumortovanadat, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,2 mM fenylmetansulfonylfluorid och proteashämmare. Maskar frystes i flytande kväve och tinades vid 37 °C tre gånger, sedan sonikerades maskarna på torris med en ultraljuds VialTweeter-enhet för samtidig beredning av 10 provrör. Ultraljudsbehandling utfördes vid 50% amplitud i 10 cykler av 2 sek. med 30 sek paus mellan ultraljudsbehandlingarna skurar. Därefter centrifugerades proverna vid 12000 rpm vid 4°C i 15 min. Supernatanten samlades in och förvarades vid -70°C. En alikvot användes för proteinkvantifiering genom Bradford-analys.
Bestämning av total glutation, GSH och GSSG: För glutationkvantifiering gjordes lysat och bestämning samma dag. Glukosutfodrade L4-larver skördades och tvättades med M9-buffert tre gånger. Efter att ha tagit bort så mycket som möjligt av M9 buffert, maskar återsuspenderades i iskall metafosforsyra (5% w/v), sedan maskar sonikerades i is med en ultraljud VialTweeter vid 50% amplitud i tio ultraljudscykler på 2 sek. med 30 sek. paus mellan varje cykel. Centrifugera sedan vid 12000 rpm vid 4 ̊C i 15 min.
(jfr Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Provförberedelse före immunprecipitulation och Western Blotting

I korthet, för embryonala extrakt odlades C. elegans L1-larver i storskaliga flytande S-mediumkulturer till vuxen ålder. Embryon samlades in med hjälp av standardblekmetoden och suspenderades i lysbuffert (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7 % glycerol, 0,05 % NP-40, 1 proteashämmare cocktail och 1 fasatashämmare cocktail I och II), snabbt frysta i flytande kväve och lyserades genom ultraljudscellstörning med hjälp av en ultraljudsapparat med mikrospets som UP200Ht med S26d2 för 10 pulser över 10 s vid 30 % amplitud. Om ett större antal prover måste prepareras ska ultraljudet VialTweeter eller MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP för brunnsplattor rekommenderas. Efter ultraljudsbehandling rensades extrakten i förväg genom centrifugering vid 30 000 g i 20 minuter vid 4 °C. Det förgodkända extraktet (300 μg totalt protein) inkuberades med 40 μförmånstagare anti-CDC-25.1 affinitetsrenad antikropp (denna studie) tvärbunden till protein A-agaros, eller som kontroll, användes en liknande mängd kaninimmunglobulin (Ig)G tvärbunden till protein A-agaros i en total volym av 200 μl lysbuffert innehållande 1 % NP-40, vars inkludering minskade den icke-specifika bindningen av proteiner till matrisen. Proverna roterades i 1 timme vid 4°C, pärlorna tvättades tre gånger med lysbuffert och eluerades med 30 μl glycin/HCl och 200 mM NaCl, pH 2,2. Efter immunoprecipitering späddes eluaterna i 30 μhuenie⏰l SDS-provbuffert, upphettades till 95 °C i 4 minuter, och vanligtvis applicerades 3 % av det totala värdet för input och 30 % för eluaterna på SDS-PAGE följt av Western blotting med anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3-gynnsamhetsantikroppar (1:500) eller anti-β-aktin (1:2000). I de fall där extrakten inte utsattes för immunoprecipitering återsuspenderades samma mängd protein som härrörde från dessa extrakt i SDS-provbufferten, upphettades till 95 °C och applicerades sedan direkt på SDS-PAGE och analyserades genom Western blotting. (jfr Segref et al. 2020)

Ultraljudslys under Prescise temperaturkontroll

Den exakta och tillförlitliga temperaturkontrollen är avgörande vid hantering av biologiska prover. Höga temperaturer initierar termiskt inducerad proteinnedbrytning i prover.
Som alla mekaniska provberedningstekniker skapar ultraljudsbehandling värme. Temperaturen på proverna kan dock kontrolleras väl när du använder VialTweeter. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen på dina prover samtidigt som du förbereder dem med VialTweeter och VialPress för analys.

1. Övervakning av provtemperaturen: Ultraljudsprocessorn UP200St, som driver VialTweeter, är utrustad med en intelligent programvara och en pluggbar temperatursensor. Anslut temperatursensorn till UP200St och sätt in spetsen på temperatursensorn i ett av sample rör. Via digital färgad pekskärm kan du ställa in i menyn för UP200St ett specifikt temperaturområde för ditt prov ultraljudsbehandling. Ultraljudaren stannar automatiskt när maxtemperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen är nere på det lägre värdet på den inställda temperaturen ∆. Sedan börjar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. VialTweeter-blocket kan förkylas. Sätt VialTweeter-blocket (endast sonotrode utan givare!) i kylen eller frysen för att förkyla, titanblocket hjälper till att skjuta upp temperaturökningen i provet. Om möjligt kan själva provet också förkylas.
3. Använd torris för att svalna under ultraljudsbehandling. Använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan skingras.

Hitta den optimala ultraljudscellstöraren för din lysapplikation

Hielscher Ultrasonics är sedan länge en erfaren tillverkare av högpresterande ultraljudscellstörare och homogenisatorer för laboratorier, bänkskivor och industriella skala. Storleken på din bakteriecellodling, ditt forsknings- eller produktionsmål och volymen av cell som ska bearbetas per timme eller dag är viktiga faktorer för att hitta rätt ultraljudscellstörare för din applikation.
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för samtidig ultraljudsbehandling av multi-prover (upp till 10 flaskor) samt massprover (dvs. mikrotiterplattor / 96-brunns plattor), den klassiska sond-typ lab ultraljudsapparat med olika effektnivåer från 50 till 400 watt till fullt industriella ultraljudsprocessorer med upp till 16.000watt per enhet för kommersiell cellstörning och proteinutvinning i stor produktion. Alla Hielscher ultraljudsapparater är byggda för 24/7/365 drift under full belastning. Robusthet och tillförlitlighet är kärnfunktionerna i våra ultraljudsenheter.
Alla digitala ultraljudshomogenisatorer är utrustade med smart programvara, färgad pekskärm och automatisk dataprotokollering, vilket gör ultraljudsenheten till ett bekvämt arbetsredskap i laboratorier och produktionsanläggningar.
Låt oss veta vilken typ av celler, vilken volym, med vilken frekvens och med vilket mål du måste bearbeta dina biologiska prover. Vi kommer att rekommendera dig den mest lämpliga ultraljudscellstöraren för dina processkrav.

Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från kompakta handhållna homogenisatorer och MultiSample ultraljudsprocessorer till industriella ultraljudsprocessorer för kommersiella applikationer: