Ultraljudslys för Western Blotting

• Western blot är en analytisk procedur för detektion av specifika proteiner i ett prov av vävnadshomogenat eller cellextrakt.
• För att köra en Western blot eller för att mäta enzymaktivitet kräver många analyser tillgång till de material (t.ex. proteiner, DNA, subcellulära fragment) som är instängda i cellen.
• Ultraljudsbehandling är en pålitlig och lätthanterlig metod för kontrollerad cellstörning och lys.

Ultraljud cellrubbning

Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är det första steget för många biologiska, biokemiska och analytiska tekniker (PAGE, Western blotting, ELISA, masspektrometri, etc.) eller proteinrening. För att få ett högt proteinutbyte måste cellmaterialet och vävnaden brytas/lyseras effektivt. Oavsett om växt cell eller djurvävnad, är ultraljudsbehandling metoden för att förbereda din cell lysate enkelt och snabbt.

Fördelar med ultraljudsbehandling

• Snabb & Effektiv
• Lätt att använda
• Högt proteinutbyte
• Reproducerbar/repeterbar
• Exakt kontrollerad
• skalbar

Immunoprecipitationsprotokoll för västerländsk immunoblotting

A. Reagenser

För beredning av lösningarna, använd renat vatten såsom Milli-Q.

• 1X fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)
• 1X celllysbuffert: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Viktigt: Tillsätt 1 mM PMSF omedelbart före användning.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G är tillräckligt för IP, men det kan bero på din primära antikropp och provvolym. Du kan också använda färdigblandat protein A/G-agaros (t.ex. protein A för kanin IgG pull down och protein G för mus IgG pull down)
• 3X SDS-provbuffert: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 vid 25 °C), 6 % w/v SDS, 30 % glycerol, 150 mM DTT, 0,03 % w/v bromfenolblått

B. Beredning av celllysat

• Skörda cellerna. För att skörda celler under icke-denaturerande förhållanden, ta bort media och skölj cellerna en gång med iskall PBS.
• Ta bort PBS och tillsätt 0,5 ml iskall 1X celllysbuffert till varje platta (10 cm) och inkubera plattorna på is i 5 minuter.
• Skrapa bort cellerna från plattorna och överför dem till mikrocentrifugrör. Håll dig på isen.
• Ultraljudsbehandling två gånger i 10 sekunder i iskall immunprecipitationsbuffert (IP-buffert: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 och proteashämmarblandningen). För ultraljudsbehandling, VialTweeter eller en sond ultraljud som t.ex. UP100H eller UP200Ht är mest lämpliga.
• Centrifugera lysaten vid 15 000 g i 10 minuter vid 4 °C.
• Överför supernatanten till ett nytt rör. (Vid behov kan lysat förvaras vid –80 °C.)
• Tillsätt den primära antikroppen till supernatanten. Supernatanten med den primära antikroppen inkuberas i 1 timme vid 4 °C under lätt omrörning. Primär antikropp tillsätts vanligtvis i en mängd som är 10 gånger mer koncentrerad än vad som används för western blotting. (Du kan börja med 1 μg per 100 μL.)
• Supernatanten inkuberas sedan ytterligare med en blandning av lika stora mängder protein A-agaros (Invitrogen) och protein G-agaros i ytterligare 1 timme.
• Tvätta agarospelletsen tre gånger med IP-buffert. Extrahera sedan de bundna proteinerna med SDS-PAGE-laddningsbufferten genom upphettning vid 95 °C i 5 minuter.

C. Immunoprecipitering

• Ta 200 μl celllysat och tillsätt primär antikropp. Inkubera med lätt gungning över natten vid 4 °C.
• Tillsätt antingen protein A- eller Gagarospärlor (20 μl 50 % pärlslam). Inkubera med lätt gungning i 1–3 timmar vid 4 °C.
• Mikrocentrifugera i 30 sekunder vid 4°C. Tvätta pelleten fem gånger med 500 μl 1X celllysbuffert. Förvara på is under tvättar.
• Återsuspendera pelleten med 20 μl 3X SDS-provbuffert. Vortex, mikrocentrifugera sedan i 30 sekunder.
• Värm provet till 95–100 °C i 2–5 minuter och mikrocentrifugera i 1 minut vid 14 000 X g.
• Ladda provet (15–30 μl) på SDS-PAGE gel (12–15 %).
• Analysera provet genom Western blotting.

Western Blot Analys med Sonicator UP50H

Efter protokoll med sond-typ sonikator UP50H användes i studien av Kriebisch et al. (2011):
Totalt protein isolerades från MC3T3-E1-celler behandlade med 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) eller fordonet. Cellerna lyserades med en buffert innehållande 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) och 0,5 % natriumdeoxikolat (Merck). Celllysatet sonikerades i 2 × 10 s vid cykel 1 och amplitud 80 med UP50H ultraljudsprocessor (Hielscher, Ultraljudsteknik, Teltow, Tyskland). Därefter centrifugerades materialet i 10 minuter vid 14 000 rpm och supernatanten användes för Western blotting. Tjugofem μg protein kokades i provbuffert och reduktionsmedel (Invitrogen) och separerades därefter av SDS-PAGE med 4–12 % polyakrylamidgeler (Invitrogen) och överfördes till ett nitrocellulosamembran (GE health care). Membranet blockerades i 1 timme med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) innehållande 1 % kasein (Sigma-Aldrich) och 1 % Tris (1 M). Efter blockering inkuberades membranet med lätt omrörning över natten vid 4 °C med den primära antikroppen (kanin anti-human CBS 1/500, utvecklad i laboratoriet av Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med en pepparrotsperoxidas (HPR)-konjugerad sekundär antikropp (Dako) utfördes under 1 timme vid rumstemperatur. Alla blottor har utvecklats med hjälp av förbättrad kemiluminiscens (Perkin Elmer).
 

Klicka här för att läsa mer om bästa praxis för ultraljudscelllys och extraktion, lysatberedning och rekommendationer för processförbättringar!
 
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten för våra ultraljudsapparater i labbstorlek:

Litteratur? Referenser