Ultraljudslys för western blotting

• Western blotting är en analytisk metod för att detektera specifika proteiner i ett prov av vävnadshomogenat eller cellextrakt.
• För att utföra western blotting eller mäta enzymaktivitet kräver många analyser tillgång till de ämnen och strukturer (t.ex. proteiner, DNA, subcellulära fragment) som finns inneslutna i cellen.
• Sonikering är en tillförlitlig och lätthanterlig metod för kontrollerad cellsönderdelning och lys.

Cellsönderdelning med ultraljud

Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är det första steget i många biologiska, biokemiska och analytiska tekniker (PAGE, western blotting, ELISA, masspektrometri osv.) eller vid proteinrening. För att uppnå ett högt proteinutbyte måste cellmaterialet och vävnaden sönderdelas/lyseras effektivt. Oavsett om det gäller växtceller eller djurvävnad är sonikering metoden för att bereda ditt celllysat enkelt och snabbt.

Fördelar med sonikering

• snabb och effektiv
• enkel användning
• högt proteinutbyte
• reproducerbar/repeterbar
• exakt kontrollerad
• skalbar

Immunprecipitationsprotokoll för western immunblotting

A. Reagenser

Använd renat vatten, såsom Milli-Q, för att bereda lösningarna.

• 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
• 1X celllysbuffert: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Viktigt: Tillsätt 1 mM PMSF omedelbart före användning.
• 15 μl protein A+15 μl protein G räcker för IP, men det kan bero på din primära antikropp och provvolym. Du kan också använda färdigblandad protein A/G-agaros (t.ex. protein A för att fälla ut kanin-IgG och protein G för att fälla ut mus-IgG)
• 3X SDS-provbuffert: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 vid 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenolblått

B. Beredning av celllysat

• Skörda cellerna. För att skörda celler under icke-denaturerande förhållanden, avlägsna odlingsmediet och skölj cellerna en gång med iskall PBS.
• Avlägsna PBS och tillsätt 0,5 ml iskall 1X celllysbuffert till varje platta (10 cm) och inkubera plattorna på is i 5 minuter.
• Skrapa loss cellerna från plattorna och överför dem till mikrocentrifugrör. Förvara på is.
• Sonikera två gånger i 10 sekunder i iskall immunprecipitationsbuffert (IP-buffert: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 och proteashämmarblandningen). För sonikering är VialTweeter eller en ultraljudsapparat med sond, såsom UP100H eller UP200Ht bäst lämpade.
• Centrifugera lysaten vid 15 000 g i 10 minuter vid 4°C.
• Överför supernatanten till ett nytt rör. (Vid behov kan lysatet förvaras vid –80°C.)
• Tillsätt den primära antikroppen till supernatanten. Supernatanten med den primära antikroppen inkuberas i 1 h vid 4°C under lätt omrörning. Den primära antikroppen tillsätts vanligtvis i en mängd som ger en 10x högre koncentration än den som används för western blotting. (Du kan börja med 1μg per 100μL.)
• Supernatanten inkuberas sedan vidare med blandningen av lika mängder protein A-agaros (Invitrogen) och protein G-agaros i ytterligare 1 h.
• Tvätta agarospelletarna tre gånger med IP-buffert. Extrahera därefter de bundna proteinerna med SDS-PAGE-laddningsbufferten genom upphettning vid 95°C i 5 minuter.

C. Immunprecipitation

• Ta 200 μl celllysat och tillsätt primär antikropp. Inkubera under försiktig vaggning över natten vid 4°C.
• Tillsätt antingen protein A- eller protein G-agaroskulor (20 μl av en 50% kulsuspension). Inkubera under försiktig vaggning i 1–3 timmar vid 4°C.
• Centrifugera i mikrocentrifug i 30 sekunder vid 4°C. Tvätta pelleten fem gånger med 500 µl 1X celllysbuffert. Förvara på is under tvättarna.
• Resuspendera pelleten med 20 μl 3X SDS-provbuffert. Blanda på vortexblandare och centrifugera sedan i mikrocentrifug i 30 sekunder.
• Värm provet till 95–100°C i 2–5 minuter och centrifugera i mikrocentrifug i 1 minut vid 14 000 X g.
• Applicera provet (15–30 μl) på en SDS-PAGE-gel (12–15%).
• Analysera provet med western blotting.

Western blot-analys med ultraljudsapparaten UP50H

Följande protokoll med ultraljudsapparaten UP50H av sondtyp användes i studien av Kriebisch et al. (2011):
Totalprotein isolerades från MC3T3-E1-celler som behandlats med 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) eller vehikel. Cellerna lyserades med en buffert som innehöll 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) och 0,5% natriumdeoxikolat (Merck). Celllysatet sonikerades i 2 × 10 s vid cykel 1 och amplitud 80 med ultraljudsprocessorn UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Tyskland). Därefter centrifugerades materialet i 10 min vid 14 000 rpm och supernatanten användes för western blotting. Tjugofem μg protein kokades i provbuffert och reduktionsmedel (Invitrogen) och separerades därefter med SDS-PAGE med 4–12% polyakrylamidgeler (Invitrogen) och överfördes till ett nitrocellulosamembran (GE health care). Membranet blockerades i 1 h med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) som innehöll 1% kasein (Sigma-Aldrich) och 1% Tris (1 M). Efter blockeringen inkuberades membranet under lätt omrörning över natten vid 4°C med den primära antikroppen (kaninantikropp mot humant CBS 1/500, utvecklad i professor R. Banerjees laboratorium, Ann Arbor, MI, USA). Inkubering med en sekundär antikropp konjugerad med pepparrotsperoxidas (HPR) (Dako) utfördes i 1 h vid rumstemperatur. Alla blottar framkallades med förstärkt kemiluminiscens (Perkin Elmer).
 

Klicka här för att läsa mer om bästa praxis för celllys och extraktion med ultraljud, lysatberedning och rekommendationer för processförbättringar!
 
Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater i laboratorieskala:

Litteratur / Referenser

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.