Ultraljudsljus för Western Blotting

• Den västra blot är ett analytiskt förfarande för detektion av specifika proteiner i ett prov av vävnad Homogenatet eller cell extrakt.
• För att köra en västerländsk blot eller för att mäta enzym aktivitet kräver många analyser till gång till materialen (t. ex. proteiner, DNA, subcellulära fragment) som är anhållna i cellen.
• Ultraljudsbehandling är en pålitlig och lätt att hantera metod för kontrollerad cell störningar och Lys.

Ultraljud cell störningar

Protein utvinning från vävnader och odlade celler är det första steget för många biologiska, biokemiska och analytiska tekniker (PAGE, Western blotting, ELISA, masspektrometri, etc.) eller protein rening. För att få en hög protein avkastning måste cell materialet och vävnaden effektivt störas/lyseras. Oavsett om växten cell eller djur vävnad, ultraljudsbehandling är metoden för att förbereda din cell lysate enkelt och snabbt.

Fördelar med ultraljudsbehandling

• Snabb & Effektiv
• enkel hantering
• hög protein avkastning
• reproducerbara/repeterbara
• kontrol leras noggrant
• Skalbar

Immunutfällning protokoll för Western Immunoblotting

A. reagenser

För beredning av lösningarna, Använd renat vatten som Milli-Q.

• 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
• 1X Celllysbuffert: 20 mM tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4 μg/ml Leupeptin
  Viktigt: tillsätt 1 mM PMSF omedelbart före användning.
• 15 μl protein A + 15 μl protein G är tillräckligt för IP, men det kan bero på din primära anti kropp och prov volym. Du kan också använda pre-blandade protein a/G AGA Ros (t. ex. protein a för kanin IgG dra ner och protein G för mus IgG dra ner)
• 3x SDS provbuffert: 187,5 mm Tris-HCl (pH 6,8 vid 25 ° c), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mm DTT, 0,03% w/v bromfenolblått blå

B. beredning av Celllysater

• Skörda cellerna. För att skörda celler under nondenaturering förhållanden, ta bort media och skölj celler en gång med iskall PBS.
• Ta bort PBS och tillsätt 0,5 ml iskalla 1X celllyssningsbuffert till varje platta (10 cm) och inkubera plattorna på is i 5 minuter.
• Skrapa bort cellerna från plattorna och överför till mikrocentrifugrör. Håll på isen.
• Sonikera två gånger i 10 sekunder i iskalla immunprecipitationsbuffert (IP-buffert: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 och proteashämmare Mix). För ultraljudsbehandling, VialTweeter eller en sond ultrasonicator som UP100H eller Uf200 ः t är mest lämpade.
• Centrifugera lysaterna vid 15 000 g i 10 minuter vid 4 ° c.
• Överför supernatanten till ett nytt rör. (Vid behov kan lysat förvaras vid – 80 ° c.)
• Tillsätt den primära anti kroppen till supernatanten. Supernatanten med den primära anti kroppen inkuberas i 1 h vid 4 ° c under lätt omrörning. Primär anti kropp tillsätts vanligt vis i ett belopp 10x mer koncentrerad än vad som används för Western blotting. (Du kan börja med 1μg per 100 μL.)
• Supernatanten inkuberas därefter vidare med blandningen av lika stora mängder protein A-AGA Ros (Invitrogen) och protein G AGA ros för en annan 1 h.
• Tvätta AGA ros pellets tre gånger med IP-buffert. Efteråt, extrahera bundna proteiner med SDS-PAGE lastning buffert genom upphettning vid 95 ° c i 5 minuter.

C. Immunutfällning

• Ta 200 μl celllysat och tillsätt primär anti kropp. Inkubera med mild gungande över natten vid 4 ° c.
• Tillsätt antingen protein A eller G AGA ros pärlor (20 μl 50% pärlslurry). Inkubera med mild vagga i 1 – 3 timmar vid 4 ° c.
• Mikrocentrifug i 30 sekunder vid 4 ° c. Tvätta pelleten fem gånger med 500 μl 1X celllyssningsbuffert. Håll på isen under tvättningarna.
• Omsuspendera pelleten med 20 μl 3X SDS exempelbuffert. Vortex, sedan mikrocentrifug i 30 sekunder.
• Värm provet till 95 – 100 ° c i 2 – 5 minuter och mikrocentrifug i 1 minut vid 14 000 X g.
• Fyll på provet (15 – 30 μl) på SDS-PAGE gel (12 – 15%).
• Analysera prov genom Western blotting.

Western blot analys med ultrasonicator UP50H

Följande protokoll användes i studien av Kriebisch et al. (2011):
Totalt protein isolerades från MC3T3-E1-celler som behandlades med 1,25 (OH)₂D₃ (10^{− 8} M) eller fordon. Cellerna lyserat med en buffert innehåll ande 50 mm Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) och 0,5% natriumdeoxycholat (Merck). Cellen lysate var sonicated för 2 × 10 s vid cykel 1 och amplitud 80 med UP50H ultraljud processor (Hielscher, ultraljud Technology, Teltow, Tyskland). Därefter centrifugerades materialet i 10 min vid 14 000 rpm och supernatanten användes för Western blotting. Tjugofem μg protein kokas i provbuffert och reducerande medel (Invitrogen) och därefter separeras av SDS-PAGE med 4 – 12% polyakrylamidgeler (Invitrogen) och överförs till ett nitrocellulosamembran (GE-hälsovård). Membranet blockerades för 1 h med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) innehåll ande 1% kasein (Sigma-Aldrich) och 1% tris (1 M). Efter blockering, var membranet inkuberas med lätt agitation över natten vid 4 ° c med den primära anti kroppen (kanin anti-mänskliga CBS 1/500, som utvecklats i labbet av prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med en peppar rots peroxidas (HPR)-konjugerad sekundär anti kropp (Dako) utfördes för 1 h vid rums temperatur. Alla blotting utvecklades av förstärkt Kemiluminiscens (Perkin Elmer).

Litteratur / Referenser