Ultraljudslys för Western Blotting
- Western blot är en analytisk procedur för detektion av specifika proteiner i ett prov av vävnadshomogenat eller cellextrakt.
- För att köra en Western blot eller för att mäta enzymaktivitet kräver många analyser tillgång till de material (t.ex. proteiner, DNA, subcellulära fragment) som är instängda i cellen.
- Ultraljudsbehandling är en pålitlig och lätthanterlig metod för kontrollerad cellstörning och lys.
Ultraljud cellrubbning
Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är det första steget för många biologiska, biokemiska och analytiska tekniker (PAGE, Western blotting, ELISA, masspektrometri, etc.) eller proteinrening. För att få ett högt proteinutbyte måste cellmaterialet och vävnaden brytas/lyseras effektivt. Oavsett om växt cell eller djurvävnad, är ultraljudsbehandling metoden för att förbereda din cell lysate enkelt och snabbt.
Fördelar med ultraljudsbehandling
- Snabb & Effektiv
- Lätt att använda
- Högt proteinutbyte
- Reproducerbar/repeterbar
- Exakt kontrollerad
- skalbar

VialTweeter ultraljudsapparat för ultraljudsprovförberedelse såsom cellstörning och proteinisolering
Immunoprecipitationsprotokoll för västerländsk immunoblotting
A. Reagenser
För beredning av lösningarna, använd renat vatten såsom Milli-Q.
- 1X fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS)
- 1X celllysbuffert: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
Viktigt: Tillsätt 1 mM PMSF omedelbart före användning. - 15 μl Protein A+15 μl Protein G är tillräckligt för IP, men det kan bero på din primära antikropp och provvolym. Du kan också använda färdigblandat protein A/G-agaros (t.ex. protein A för kanin IgG pull down och protein G för mus IgG pull down)
- 3X SDS-provbuffert: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 vid 25 °C), 6 % w/v SDS, 30 % glycerol, 150 mM DTT, 0,03 % w/v bromfenolblått
B. Beredning av celllysat
- Skörda cellerna. För att skörda celler under icke-denaturerande förhållanden, ta bort media och skölj cellerna en gång med iskall PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 0,5 ml iskall 1X celllysbuffert till varje platta (10 cm) och inkubera plattorna på is i 5 minuter.
- Skrapa bort cellerna från plattorna och överför dem till mikrocentrifugrör. Håll dig på isen.
- Ultraljudsbehandling två gånger i 10 sekunder i iskall immunprecipitationsbuffert (IP-buffert: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 och proteashämmarblandningen). För ultraljudsbehandling, VialTweeter eller en sond ultraljud som t.ex. UP100H eller UP200Ht är mest lämpliga.
- Centrifugera lysaten vid 15 000 g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt rör. (Vid behov kan lysat förvaras vid –80 °C.)
- Tillsätt den primära antikroppen till supernatanten. Supernatanten med den primära antikroppen inkuberas i 1 timme vid 4 °C under lätt omrörning. Primär antikropp tillsätts vanligtvis i en mängd som är 10 gånger mer koncentrerad än vad som används för western blotting. (Du kan börja med 1 μg per 100 μL.)
- Supernatanten inkuberas sedan ytterligare med en blandning av lika stora mängder protein A-agaros (Invitrogen) och protein G-agaros i ytterligare 1 timme.
- Tvätta agarospelletsen tre gånger med IP-buffert. Extrahera sedan de bundna proteinerna med SDS-PAGE-laddningsbufferten genom upphettning vid 95 °C i 5 minuter.
C. Immunoprecipitering
- Ta 200 μl celllysat och tillsätt primär antikropp. Inkubera med lätt gungning över natten vid 4 °C.
- Tillsätt antingen protein A- eller Gagarospärlor (20 μl 50 % pärlslam). Inkubera med lätt gungning i 1–3 timmar vid 4 °C.
- Mikrocentrifugera i 30 sekunder vid 4°C. Tvätta pelleten fem gånger med 500 μl 1X celllysbuffert. Förvara på is under tvättar.
- Återsuspendera pelleten med 20 μl 3X SDS-provbuffert. Vortex, mikrocentrifugera sedan i 30 sekunder.
- Värm provet till 95–100 °C i 2–5 minuter och mikrocentrifugera i 1 minut vid 14 000 X g.
- Ladda provet (15–30 μl) på SDS-PAGE gel (12–15 %).
- Analysera provet genom Western blotting.
Western Blot Analys med Sonicator UP50H
Efter protokoll med sond-typ sonikator UP50H användes i studien av Kriebisch et al. (2011):
Totalt protein isolerades från MC3T3-E1-celler behandlade med 1,25(OH)2D3 (10−8 M) eller fordonet. Cellerna lyserades med en buffert innehållande 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) och 0,5 % natriumdeoxikolat (Merck). Celllysatet sonikerades i 2 × 10 s vid cykel 1 och amplitud 80 med UP50H ultraljudsprocessor (Hielscher, Ultraljudsteknik, Teltow, Tyskland). Därefter centrifugerades materialet i 10 minuter vid 14 000 rpm och supernatanten användes för Western blotting. Tjugofem μg protein kokades i provbuffert och reduktionsmedel (Invitrogen) och separerades därefter av SDS-PAGE med 4–12 % polyakrylamidgeler (Invitrogen) och överfördes till ett nitrocellulosamembran (GE health care). Membranet blockerades i 1 timme med TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) innehållande 1 % kasein (Sigma-Aldrich) och 1 % Tris (1 M). Efter blockering inkuberades membranet med lätt omrörning över natten vid 4 °C med den primära antikroppen (kanin anti-human CBS 1/500, utvecklad i laboratoriet av Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubation med en pepparrotsperoxidas (HPR)-konjugerad sekundär antikropp (Dako) utfördes under 1 timme vid rumstemperatur. Alla blottor har utvecklats med hjälp av förbättrad kemiluminiscens (Perkin Elmer).
Klicka här för att läsa mer om bästa praxis för ultraljudscelllys och extraktion, lysatberedning och rekommendationer för processförbättringar!
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten för våra ultraljudsapparater i labbstorlek:
Rekommenderade enheter | Batchvolym | Flöde |
---|---|---|
UIP400MTP Ultraljudsbehandling med 96 brunnar | Multi-brunnar? mikrotiterplattor | N.A. |
Ultraljud CupHorn | CupHorn för ampuller eller bägare | N.A. |
GDmini2 | ultraljud mikroflödesreaktor | N.A. |
VialTweeter | 0.5 till 1,5 ml | N.A. |
UP100H | 1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min |
UP200Ht, UP200St | 10 till 1000 ml | 20 till 200 ml/min |
UP400St | 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min |
Ultraljud Sikt Shaker | N.A. | N.A. |
Kontakta oss!? Fråga oss!

UIP400MTP platta ultraljudsbehandling för ultraljudsbehandling med hög genomströmning av 96-brunns plattor
Om Western Blotting
Blot är analytiska procedurer där DNA, RNA och proteiner överförs till en bärare så att de kan separeras.
Den södra blotet används för att detektera DNA, den norra blotet för RNA och den västra blotet för proteiner.
Western blotting kallas också proteinimmunoblotting eftersom en antikropp används för att specifikt detektera dess antigen. Western Blotting är en av de viktigaste analysmetoderna för att detektera specifika proteiner i provet. I Western blot immobiliseras proteinerna på membran för att detekteras med hjälp av monoklonala eller polyklonala antikroppar.
Genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) separeras nativa proteiner av 3-D-struktur eller denaturerade proteiner med längden på polypeptiden. Proteinerna överförs sedan till ett membran (vanligtvis nitrocellulosa eller PVDF), där de färgas med antikroppar som är specifika för målproteinet. Gelelektroforessteget ingår i western blot-analysen för att lösa problemet med korsreaktivitet hos antikroppar.
Därefter torkas de separerade proteinerna på en matris (mestadels på ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran), där de färgas med antikroppar. Antikropparna fungerar som en sond och selekteras specifikt till målproteinet. Analysen av platsen och intensiteten för den specifika reaktionen avslöjar uttrycksdetaljer för målproteinerna i det givna provet. Western blotting kunde detektera målprotein som är så lågt som 1ng på grund av hög upplösning av gelelektroforesen och stark specificitet och hög känslighet hos immunanalysen. Western blot-metoden används inom molekylärbiologi, biokemi, immunogenetik och andra molekylära forskningsområden.
Andra relaterade tekniker inkluderar dot blot-analys, immunhistokemi och immunocytokemi där antikroppar används för att detektera proteiner i vävnader och celler genom immunfärgning, och enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA).
Litteratur? Referenser
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter ultraljudsapparat för samtidig provberedning av flera injektionsflaskor