Bioengineered bakteriearter som E. coli samt genetiskt modifierade däggdjurs- och växtcellstyper används i stor utsträckning inom bioteknik för att uttrycka molekyler. För att frigöra dessa syntetiserade biomolekyler krävs en tillförlitlig cellstörningsteknik. Högpresterande ultraljud är en beprövad metod för effektiv och pålitlig celllys – lätt skalbar till stora data flöde. Hielscher Ultrasonics erbjuder dig högpresterande ultraljud utrustning för effektiv celllys för att producera stora volymer av högkvalitativa biomolekyler.

Extraktion av molekyler från cellfabriker

För produktion av ett brett spektrum av biomolekyler kan olika konstruerade mikrober och växtceller användas som mikrobiella cellfabriker, inklusive Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana bentiae och nicotiaa benthama och alger. Dessa cellfabriker kan producera proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobränslen och oleokemikalier, som används som livsmedel eller råmaterial för industriella tillämpningar. Celler som används som cellfabriker odlas i slutna bioreaktorer, där de kan uppnå hög effektivitet, specificitet och låga energibehov.
För att isolera målmolekylerna från de bioengineered cellkulturerna måste cellerna störas så att det intracellulära materialet frigörs. Ultraljud cell upplösare är väl etablerade som mycket tillförlitlig och effektiv teknik för cellupplösning och sammansatt frisättning.

Mikrobiella cellfabriker är metaboliskt konstruerade celler som används för syntes av olika värdefulla föreningar. Ultraljud cell störningar är en effektiv och pålitlig metod för att frigöra de värdefulla föreningarna från cellen interiören.
studie och grafik: ©Villaverde, 2010.

Fördelar med ultraljud cell disruptorer

Som en icke-termisk, mild men ändå högeffektiv teknik används ultraljud disruptorer i labb och industri för att lysa celler och för att producera högkvalitativa extrakt, t.ex. används för isolering av molekyler från cellfabriker.

Power-ultraljud för effektiv störning av mikrobiella cellfabriker

Mekanism och effekter av ultraljud cell disruptorer:
Ultraljud cell störningar använde kraften i ultraljud vågor. Ultraljud homogenisator / cell disruptor är utrustad med en sond (aka sonotrode) tillverkad av titanlegering som svänger vid en hög frekvens på ca 20 kHz. Detta innebär ultraljud sond par 20,000 vibrationer per sekund i den sonicated vätskan. Ultraljudsvågorna kopplade till vätskan kännetecknas av alternerande högtrycks- / lågtryckscykler. Under en lågtryckscykel expanderar vätskan och minutvakuumbubblor uppstår. Dessa mycket små bubblor växer under flera alternerande tryckcykler tills de inte kan absorbera ytterligare energi. Vid denna tidpunkt imploderar kavitationsbubblorna våldsamt och skapar lokalt en extraordinär energität miljö. Detta fenomen är känt som akustisk kavitation och kännetecknas av lokalt mycket höga temperaturer, mycket höga tryck och skjuvkrafter. Dessa skjuvspänningar bryter effektivt cellväggar och ökar massöverföringen mellan cellens inre och det omgivande lösningsmedlet. Som en rent mekanisk teknik används ultraljudsgenererade skjuvkrafter i stor utsträckning och det rekommenderade förfarandet för bakteriell cellstörning, liksom för proteinisolering. Som en enkel och snabb cell störning metod, ultraljudsbehandling är idealisk för isolering av små, medelstora och stora volymer. Hielschers digitala ultraljudsapparater är utrustade med en tydlig meny med inställningar för exakt ultraljudsbehandlingskontroll. Alla ultraljudsbehandlingsdata lagras automatiskt på ett inbyggt SD-kort och är helt enkelt tillgängliga. Sofistikerade alternativ för värmeavledning såsom extern kylning, ultraljudsbehandling i pulsläge etc. under ultraljud sönderfallsprocessen säkerställer upprätthållandet av den ideala processtemperaturen och därmed intaktheten av extraherade värmekänsliga föreningar.

Forskning understryker styrkorna av ultraljud cell störningar och extraktion

Prof. Chemat et al. (2017) återupptar i sin studie att "ultraljudsassisterad extraktion är ett grönt och ekonomiskt livskraftigt alternativ till konventionella tekniker för livsmedel och naturliga produkter. De viktigaste fördelarna är minskning av extraktions- och bearbetningstiden, mängden energi och lösningsmedel som används, enhetsoperationer och CO₂ utsläpp."
(2014) använde en högtryckshomogenisator och en ultraljudscellsdintegratör i sin studie för lys av sporer för att frigöra DNA. Genom att jämföra båda cellstörningsmetoderna drar forskargruppen slutsatsen att när det gäller celllys för spor-DNA har "analys gjorts genom att använda celllysslar från högtryckshomogeniseringen. Efteråt insåg vi att en ultraljud cell störning har enastående fördelar för detta ändamål. Den är ganska snabb och kan bearbetas för små provvolymer." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekyler från cellfabriker för livsmedelsproduktion

Mikrobiella cellfabriker är en livskraftig och effektiv produktionsmetod som använder mikrobiella organismer för att producera höga utbyten av inhemska och icke-inhemska metaboliter genom metabolisk bioteknik av mikrobiella mikroorganismer som bakterier, jäst, svampar etc. Bulkenzymer produceras till exempel med mikroorganismer a liksom Aspergillus oryzae, svampar och bakterier. Dessa bulkenzymer används för livsmedels- och dryckesproduktion, liksom inom jordbruk, bioenergi och hushållsvård.
Vissa bakterier som Acetobacter xylinum och Gluconacetobacter xylinus producerar cellulosa under jäsningsprocessen, där nanofibrer syntetiseras i en bottom-up-process. Bakteriell cellulosa (även känd som mikrobiell cellulosa) är kemiskt likvärdig med växtcellulosa, men den har hög grad av kristallinitet och hög renhet (fri från lignin, hemicellulosa, pektin och andra biogena komponenter) samt en unik struktur av cellulosa nanofibervävt tredimensionellt (3D) retikulerat nätverk. (jfr Zhong, 2020) I jämförelse med cellulosa från växter är bakteriell cellulosa mer hållbar och den cellulosa som produceras är ren och kräver rena inte komplexa reningssteg. Ultraljud och lösningsmedel extraktion med hjälp av NaOH eller SDS (natrium dodecylsulfat) är mycket effektiva för isolering av bakteriell cellulosa från bakteriecellerna.

Biomolekyler från cellfabriker för läkemedels- och vaccinproduktion

En av de mest framstående farmaceutiska produkterna som härrör från cellfabriker är humaninsulin. För bioengineered insulinproduktion används främst E. coli och Saccharomyces cerevisiae. Eftersom biosyntiserade nanostora molekyler erbjuder en hög biokompatibilitet är biologiska nanopartiklar som ferritin fördelaktiga för många biotillverkningstillämpningar. Dessutom är produktionen i metaboliskt konstruerade mikrober ofta betydligt mer effektiv i de erhållna utbytena. Till exempel, produktionen av artemisinic syra, resveratrol och lykopen har tiofaldigt till flera hundrafaldigt, och är redan etablerad eller är under utveckling till industriell skala produktion. (jfr Liu et al.; Mikrob. Cell fakta. 2017)
Till exempel är proteinbaserade biomolekyler i nanostorlek med självmonterande egenskaper som ferritin och virusliknande partiklar särskilt intressanta för vaccinutveckling eftersom de efterliknar både patogenernas storlek och struktur och är mottagliga för ytkonjugation av antigener för att främja interaktionen med immunceller. Sådana molekyler uttrycks i så kallade cellfabriker (t.ex. konstruerade E. coli-stammar), som producerar en viss målmolekyl.

Protokoll för ultraljud Lysis och av E. coli BL21 för Ferritin Release

Ferritin är ett protein, som primär funktion är lagring av järn. Ferritin visar lovande förmåga som självmonterande nanopartiklar i vacciner, där det används som vaccinleveransfordon (t.ex. SARS-Cov-2 spikproteiner). Den vetenskapliga forskningen av Sun et. (2016) visar att rekombinant ferritin kan frigöras som löslig form från Escherichia coli vid låga NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). För att uttrycka ferritin i E. coli BL21 och för att frigöra ferrtin tillämpades följande protokoll framgångsrikt. Rekombinant pET-28a/ferritin plasmid omvandlades till E coli BL21 (DE3) stam. Ferritin E coli BL21 (DE3) cellerna odlades i LB tillväxt media med 0,5% kanamycin vid 37 °C och induceras vid en OD600 av 0,6 med 0,4% isopropyl-β-D-tiogalactopyranoside i 3 timmar vid 37 °C. Den slutliga kulturen skördades sedan genom centrifugering vid 8000 g i 10 minuter vid 4°C, och pelleten samlades in. Sedan återanvändes pelleten i LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% jästextrakt)/lysbuffert (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) och olika koncentrationer av NaCl-lösning (0, 50, 100, 170, 170) respektive 300 mmol/ L. För bakteriell celllys applicerades ultraljudsbehandling i pulsläge: t.ex. med hjälp av ultraljudsapparat UP400St vid 100% amplitud med en arbetscykel på 5 sekunder PÅ, 10 sekunder AV, i 40 cykler) och sedan centrifugeras vid 10 000 g i 15 minuter vid 4 °C. Supernatant och fällning analyserades av natrium dodecylsulfat polyakrylamide gel elektrofores (SDS-PAGE). Alla natrium dodecyl sulfat-färgade geler skannades med högupplöst skanner. Gel bilder analyserades med Magic Chemi 1D programvara. För optimal klarhet upptäcktes proteinband genom att justera parametrar. Uppgifterna för banden genererades från tekniska tre exemplar. (jfr. Sön et al., 2016)

Ultraljud Cell Disruptors för industriell lys av cellfabriker

Ultraljud lys och extraktion är en pålitlig och bekväm metod för att frigöra metaboliter från cellfabriker och därigenom hjälpa till med en effektiv produktion av målmolekyler. Ultraljud cell disruptorer är tillgängliga från labb till industriell storlek och processer kan skalas helt linjär.
Hielscher Ultrasonics är din kompetenta partner för högpresterande ultraljud disruptorer och har lång erfarenhet inom området implantering ultraljud system i bänk-top och industriella inställningar.
När det gäller sofistikerad hårdvara och programvara, Hielscher Ultrasonics cell störningssystem uppfyller alla krav för optimal processkontroll, enkel drift och användarvänlighet. Kunder och användare av Hielscher ultrasonicators värderar fördelen som Hielscher ultraljud cell disruptorer och extraktorer möjliggör den exakta processövervakning och kontroll – via digital pekskärm och webbläsarfjärrkontroll. Alla viktiga ultraljudsbehandlingsdata (t.ex. nettoenergi, total energi, amplitud, varaktighet, temperatur, tryck) lagras automatiskt som CSV-fil på ett integrerat SD-kort. Detta bidrar till att uppnå reproducerbara och repeterbara resultat och underlättar processstandardisering samt uppfyllandet av god tillverkningssed (cGMP).
Naturligtvis, Hielscher ultraljud processorer är byggda för 24/7 drift under full belastning och kan därför tillförlitligt drivas i industriella produktionsmiljöer. På grund av hög robusthet och lågt underhåll är stilleståndstiden för ultraljudsutrustningen riktigt låg. CIP-funktionerna (clean-in-place) och SIP (sterilize-in-place) minimerar mödosam rengöring, särskilt eftersom alla våta delar är släta metallytor (inga dolda öppningar eller munstycken).

Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera: