Ultraljudslys av biokonstruerade celler i industriell produktion
Biokonstruerade bakteriearter som E. coli samt genetiskt modifierade däggdjurs- och växtcelltyper används i stor utsträckning inom bioteknik för att uttrycka molekyler. För att frigöra dessa syntetiserade biomolekyler krävs en tillförlitlig cellstörningsteknik. Högpresterande ultraljud är en beprövad metod för effektiv och tillförlitlig celllys – Enkelt skalbar till stora dataflöden. Hielscher Ultrasonics erbjuder dig högpresterande ultraljudsutrustning för effektiv celllys för att producera stora volymer av högkvalitativa biomolekyler.
Extraktion av molekyler från cellfabriker
För produktion av ett brett spektrum av biomolekyler kan olika konstruerade mikrober och växtceller användas som mikrobiella cellfabriker, inklusive Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cyanobakterier, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana och alger, bland många andra. Dessa cellfabriker kan producera proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobränslen och oleokemikalier, som används som livsmedel eller råvara för industriella tillämpningar. Celler som används som cellfabriker odlas i slutna bioreaktorer, där de kan uppnå hög effektivitet, specificitet och låga energibehov.
För att isolera målmolekylerna från de biokonstruerade cellkulturerna måste cellerna störas så att det intracellulära materialet frigörs. Ultraljud cellstörare är väl etablerade som mycket tillförlitliga och effektiva tekniker för cellupplösning och sammansatt frisättning.

Ultraljudscelldesintegratorer som t.ex. UIP2000hdT används för att isolera föreningar från mikrobiella cellfabriker.

Mikrobiella cellfabriker är metaboliskt modifierade celler som används för syntes av olika värdefulla föreningar. Ultraljud cellstörning är en effektiv och pålitlig metod för att frigöra de värdefulla föreningarna från cellens inre.
studie och grafik: ©Villaverde, 2010.
Fördelar med ultraljudscellstörare
Som en icke-termisk, mild, men ändå mycket effektiv teknik, används ultraljudsstörande ämnen i laboratorium och industri för att lysera celler och för att producera högkvalitativa extrakt, t.ex. används för isolering av molekyler från cellfabriker.
- Hög effektiv
- Icke-termisk, idealisk för temperaturkänsliga ämnen
- Tillförlitliga, repeterbara resultat
- Exakt bearbetningskontroll
- Linjär skalbar till större dataflöden
- Tillgänglig för industriell produktionskapacitet
Power-ultraljud för effektiv störning av mikrobiella cellfabriker
Mekanism och effekter av ultraljudscellstörare:
Ultraljudscellrubbning använde kraften i ultraljudsvågor. Ultraljudshomogenisatorn / cellstöraren är utrustad med en sond (aka sonotrode) tillverkad av titanlegering som oscillerar vid en hög frekvens på ca 20 kHz. Detta innebär att ultraljudssonden kopplar 20 000 vibrationer per sekund i den sonikerade vätskan. Ultraljudsvågorna som kopplas in i vätskan kännetecknas av växlande högtrycks- / lågtryckscykler. Under en lågtryckscykel expanderar vätskan och små vakuumbubblor uppstår. Dessa mycket små bubblor växer över flera alternerande tryckcykler tills de inte kan absorbera någon mer energi. Vid denna tidpunkt imploderar kavitationsbubblorna våldsamt och skapar lokalt en extraordinär energität miljö. Detta fenomen är känt som akustisk kavitation och kännetecknas av lokalt mycket höga temperaturer, mycket höga tryck och skjuvkrafter. Dessa skjuvspänningar bryter effektivt sönder cellväggarna och ökar massöverföringen mellan cellens inre och det omgivande lösningsmedlet. Som en rent mekanisk teknik används ultraljudsgenererade skjuvkrafter i stor utsträckning och är den rekommenderade proceduren för bakteriell cellstörning, såväl som för proteinisolering. Som en enkel och snabb cellstörningsmetod, ultraljudsbehandling är idealisk för isolering av små, medelstora och stora volymer. Hielschers digitala ultraljudsapparater är utrustade med en tydlig meny med inställningar för exakt ultraljudsbehandling. Alla ultraljudsbehandling data lagras automatiskt på ett inbyggt SD-kort och är helt enkelt tillgängliga. Sofistikerade alternativ för värmeavledning såsom extern kylning, ultraljudsbehandling i pulsläge etc. under ultraljudsdesintegrationsprocessen säkerställer upprätthållandet av den idealiska processtemperaturen och därmed intaktheten hos extraherade värmekänsliga föreningar.
Forskning understryker styrkorna med ultraljudscellstörning och extraktion
Prof. Chemat et al. (2017) återupptar i sin studie att "ultraljudsassisterad extraktion är ett grönt och ekonomiskt lönsamt alternativ till konventionella tekniker för livsmedel och naturprodukter. De främsta fördelarna är minskning av extraktions- och bearbetningstiden, mängden energi och lösningsmedel som används, enhetsoperationer och CO2 utsläpp."
Gabig-Ciminska et al. (2014) använde en högtryckshomogenisator och en ultraljudscellintegrator i sin studie för lysering av sporer för att frigöra DNA. Genom att jämföra de båda cellstörningsmetoderna drar forskargruppen slutsatsen att när det gäller celllys för spor-DNA, "har analysen gjorts genom att använda celllysat från högtryckshomogeniseringen. Efteråt insåg vi att en ultraljudscellstörning har enastående fördelar för detta ändamål. Det är ganska snabbt och kan bearbetas för små provvolymer. (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Industriell ultraljudscelldesintegrator UIP4000hdT (4000W, 20kHz) För kontinuerlig inline-isolering och rening av syntetiserade föreningar från mikrobiella cellfabriker.
Biomolekyler från cellfabriker för livsmedelsproduktion
Mikrobiella cellfabriker är en livskraftig och effektiv produktionsmetod som använder mikrobiella organismer för att producera höga utbyten av inhemska och icke-inhemska metaboliter genom metabolisk bioteknik av mikrobiella mikroorganismer som bakterier, jäst, svampar etc. Bulkenzymer produceras till exempel med hjälp av mikroorganismer som Aspergillus oryzae, svampar och bakterier. Dessa bulkenzymer används för livsmedels- och dryckesproduktion, såväl som inom jordbruk, bioenergi och hushållsvård.
Vissa bakterier som Acetobacter xylinum och Gluconacetobacter xylinus producerar cellulosa under jäsningsprocessen, där nanofibrer syntetiseras i en bottom-up-process. Bakteriell cellulosa (även känd som mikrobiell cellulosa) är kemiskt ekvivalent med växtcellulosa, men den har hög grad av kristallinitet och hög renhet (fri från lignin, hemicellulosa, pektin och andra biogena komponenter) samt en unik struktur av cellulosa nanofibervävt tredimensionellt (3D) retikulerat nätverk. (jfr Zhong, 2020) I jämförelse med växtbaserad cellulosa är bakteriell cellulosa mer hållbar och den cellulosa som produceras är ren och kräver inte komplexa reningssteg. Ultraljud och lösningsmedel extraktion med NaOH eller SDS (natriumdodecylsulfat) är mycket effektiva för isolering av bakteriell cellulosa från bakteriecellerna.
Biomolekyler från cellfabriker för läkemedels- och vaccinproduktion
En av de mest framstående farmaceutiska produkterna som härrör från cellfabriker är humant insulin. För bioteknisk insulinproduktion används främst E. coli och Saccharomyces cerevisiae. Eftersom biosyntetiserade molekyler i nanostorlek erbjuder en hög biokompatibilitet är biologiska nanopartiklar som ferritin fördelaktiga för många biotillverkningstillämpningar. Dessutom är produktionen av metaboliskt modifierade mikrober ofta betydligt mer effektiv i de erhållna avkastningarna. Till exempel har produktionen av artemisinsyra, resveratrol och lykopen ökat tiofaldigt till flera hundrafaldigt, och är redan etablerad eller håller på att utvecklas till produktion i industriell skala. (jfr Liu et al.; Mikrob. Cell Fakta. 2017)
Till exempel är proteinbaserade biomolekyler i nanostorlek med självorganiserande egenskaper, såsom ferritin och virusliknande partiklar, särskilt intressanta för vaccinutveckling eftersom de efterliknar både storleken och strukturen hos patogener och är mottagliga för ytkonjugering av antigener för att främja interaktionen med immunceller. Sådana molekyler uttrycks i så kallade cellfabriker (t.ex. konstruerade E. coli-stammar), som producerar en viss målmolekyl.
Protokoll för ultraljudslys och av E. coli BL21 för ferritinfrisättning
Ferritin är ett protein vars primära funktion är att lagra järn. Ferritin visar lovande egenskaper som självorganiserande nanopartiklar i vacciner, där det används som bärare av vaccin (t.ex. SARS-Cov-2 spikproteiner). Den vetenskapliga forskningen av Sun et. al. (2016) visar att rekombinant ferritin kan frisättas som en löslig form från Escherichia coli vid låga NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). För att uttrycka ferritin i E. coli BL21 och för att frigöra ferrtinet tillämpades följande protokoll framgångsrikt. Den rekombinanta plasmiden pET-28a/ferritin omvandlades till E coli BL21 (DE3) stammen. Ferritin E coli BL21 (DE3) cellerna odlades i LB-odlingsmedier med 0,5 % kanamycin vid 37 °C och inducerades vid en OD600 på 0,6 med 0,4 % isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid i 3 timmar vid 37 °C. Den slutliga kulturen skördades sedan genom centrifugering vid 8000 g i 10 minuter vid 4 °C, och pelleten samlades in. Därefter återsuspenderades pelleten i LB-medium (1 % NaCl, 1 % tyton, 0,5 % jästextrakt)/lysbuffert (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) och olika koncentrationer av NaCl-lösning (0, 50, 100, 170 respektive 300 mmol/L). För bakteriell celllys tillämpades ultraljudsbehandling i pulsläge: t.ex. med hjälp av Ultraljud UP400St vid 100 % amplitud med en arbetscykel på 5 sekunder PÅ, 10 sekunder AV, i 40 cykler) och centrifugeras sedan vid 10 000 g i 15 minuter vid 4 °C. Supernatanten och fällningen analyserades med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Alla natriumdodecylsulfatfärgade geler skannades med högupplöst skanner. Gelbilder analyserades med hjälp av programvaran Magic Chemi 1D. För optimal tydlighet detekterades proteinband genom att justera parametrarna. Data för banden genererades från tekniska trilikat. (jfr Sun et al., 2016)
Ultraljudscellstörare för industriell lys av cellfabriker
Ultraljud lys och extraktion är en pålitlig och bekväm metod för att frigöra metaboliter från cellfabriker och därigenom bidra till en effektiv produktion av målmolekyler. Ultraljudscellstörare finns tillgängliga från labb till industriell storlek och processer kan skalas helt linjärt.
Hielscher Ultrasonics är din kompetenta partner för högpresterande ultraljudsstörare och har lång erfarenhet inom området för implantation av ultraljudssystem i stationära och industriella miljöer.
När det gäller sofistikerad hårdvara och mjukvara uppfyller Hielscher Ultrasonics cellstörningssystem alla krav på optimal processtyrning, enkel drift och användarvänlighet. Kunder och användare av Hielscher ultraljudsapparater värdesätter fördelen att Hielscher ultraljud cellstörare och extraktorer möjliggör exakt processövervakning och kontroll – via digital pekskärm och webbläsarens fjärrkontroll. Alla viktiga ultraljudsbehandlingsdata (t.ex. nettoenergi, total energi, amplitud, varaktighet, temperatur, tryck) lagras automatiskt som CSV-fil på ett integrerat SD-kort. Detta hjälper till att uppnå reproducerbara och repeterbara resultat och underlättar processstandardisering samt uppfyllandet av Good Manufacturing Practices (cGMP).
Naturligtvis är Hielscher ultraljudsprocessorer byggda för 24/7 drift under full belastning och kan därför användas på ett tillförlitligt sätt i industriella produktionsmiljöer. På grund av hög robusthet och lågt underhåll är stilleståndstiden för ultraljudsutrustningen riktigt låg. CIP-funktionerna (clean-in-place) och SIP (sterilize-in-place) minimerar mödosam rengöring, särskilt eftersom alla våta delar är släta metallytor (inga dolda öppningar eller munstycken).
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater:
Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
---|---|---|
1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 till 20L | 0.2 till 4L/min | UIP2000hdT |
10 till 100L | 2 till 10L/min | UIP4000hdT |
N.A. | 10 till 100 L/min | UIP16000 |
N.A. | Större | kluster av UIP16000 |
Kontakta oss! / Fråga oss!
Litteratur / Referenser
- Sun, W., Jiao, C., Xiao, Y., Wang, L., Yu, C., Liu, J., Yu, Y., Wang, L. (2016):Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E Coli-Expressed Ferritin. Dose-Response, March 2016.
- Rodrigues, M.Q.; Alves, P.M.; Roldão, A. (2021): Functionalizing Ferritin Nanoparticles for Vaccine Development. Pharmaceutics 2021, 13, 1621.
- Farid Chemat, Natacha Rombaut, Anne-Gaëlle Sicaire, Alice Meullemiestre, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Maryline Abert-Vian (2017): Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 34, 2017. 540-560.
- Villaverde, Antonio (2010): Nanotechnology, bionanotechnology and microbial cell factories. Microbial Cell Factories 2010 9:53.
Fakta som är värda att veta
Sono-bioreaktorer
Ultraljud används å ena sidan för att störa celler för att frigöra intracellulära föreningar, men tillämpas med mildare amplituder och / eller som pulserande ultraljudskurar, ultraljudsbehandling kan kraftigt förbättra metabolisk produktivitet hos mikrobiella, växt- och djurceller i bioreaktorer och därigenom öka biotekniska processer. Ultraljudssonder kan enkelt integreras i bioreaktorer (så kallade sono-bioreaktorer) för att intensifiera effektiviteten hos levande biokatalysatorer. Hielscher ultraljudsapparater möjliggör exakt kontrollerade ultraljudsförhållanden, som kan finjusteras optimalt för hög katalytisk omvandling av levande celler. Lär dig mer om Hielscher ultraljudssonder för sonobioreaktorer och effekterna av ultraljudsförstärkt biokatalys!
Cellfabriker och syntes av metaboliter
Olika mikroorganismer kan syntetisera liknande metaboliter, till exempel för produktion av aminosyror har Corynebacterium, Brevibacterium och Escherichia coli använts framgångsrikt; vitaminer har syntetiserats med hjälp av Propionibacterium och Pseudomonas; organiska syror härrör från Aspergillus, Lactobacillus, Rhizopus; medan enzymer kan tillverkas av Aspergillus och Bacillus; antibiotika kan produceras av Streptomyces och Penicillium; medan för produktion av bioytaktiva ämnen som vanligtvis bildas används Pseudomonas, Bacillus och Lactobacillus som cellfabriker.
E. coli som mikrobiella cellfabriker
Bakterien E. coli och dess många stammar används i stor utsträckning inom molekylärbiologi och har blivit en av de första effektiva cellmodellerna som används som mikrobiella cellfabriker för produktion av rekombinanta proteiner, biobränslen och olika andra kemikalier. E. coli har en naturlig förmåga att producera flera föreningar, vilket har förbättrats genom bioteknik och genetiska modifieringar. Till exempel, genom att överföra heterologa enzymer, har E.colis förmåga att producera många produkter modifierats för att utveckla nya biosyntetiska vägar.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)
Streptomyces som mikrobiella cellfabriker
Streptomyces är den största gruppen av aktinomyceter; Streptomyces-arter är utbredda i akvatiska och terrestra ekosystem. Medlemmar av Streptomyces-släktet är av kommersiellt intresse på grund av deras förmåga att producera ett enormt antal biomolekyler och bioaktiva sekundära metaboliter. Den producerar kliniskt användbara antibiotika såsom tetracykliner, aminoglykosider, makrolider, kloramfenikol och rifamyciner. Förutom antibiotika producerar Streptomyces även andra mycket värdefulla farmaceutiska produkter, inklusive anticancer, immunstimulerande, immunsuppressiva, antioxidativa medel, insekticider och antiparasitiska läkemedel, som har breda medicinska och jordbrukstillämpningar.
Streptomyces-arter producerar en rad enzymer som är medicinskt viktiga, inklusive L-asparaginas, urikase och kolesteroloxidas. Många aktinomyceter kan producera industriellt viktiga enzymer som cellulaser, kitinaser, kitosanaser, α-amylas, proteaser och lipaser. Många aktinomyceter kan producera olika pigment som är potentiellt bra alternativ till syntetiska färger. Streptomyces-arter har stor kapacitet att producera aktiva ytbiomolekyler, inklusive bioemulgeringsmedel och biotensider. Antidiabetisk akarbos framställdes av stammar av Streptomyces via mikrobiell fermentering. Arter av Streptomyces har visat förmågan att syntetisera kolesterolsynteshämmare, som pravastatin. På senare tid har Streptomyces-arter kunnat användas som miljövänliga "nanofabriker" för syntes av nanopartiklar. Vissa Streptomyces-arter är lovande för produktionen av vitamin B12.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)

Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från labb till industriell storlek.