Ultraljudslys av biotekniskt modifierade celler i industriell produktion

Biotekniskt modifierade bakteriearter såsom E. coli samt genetiskt modifierade celltyper från däggdjur och växter används i stor utsträckning inom bioteknik för att uttrycka molekyler. För att frigöra dessa syntetiserade biomolekyler krävs en tillförlitlig teknik för cellsönderdelning. Högpresterande ultraljudsbehandling är en beprövad metod för effektiv och tillförlitlig cellys – som enkelt kan skalas upp till hög genomströmningskapacitet. Hielscher Ultrasonics erbjuder högpresterande ultraljudsutrustning för effektiv cellys för att producera stora volymer av högkvalitativa biomolekyler.

Extraktion av molekyler från cellfabriker

För produktion av ett brett spektrum av biomolekyler kan olika modifierade mikroorganismer och växtceller användas som mikrobiella cellfabriker, däribland Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cyanobakterier, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana och alger, bland många andra. Dessa cellfabriker kan producera proteiner, lipider, biokemikalier, polymerer, biobränslen och oleokemikalier, som används som livsmedel eller råmaterial för industriella tillämpningar. Celler som används som cellfabriker odlas i slutna bioreaktorer, där de kan uppnå hög effektivitet, specificitet och låga energibehov.
För att isolera målmolekylerna från de biotekniskt modifierade cellkulturerna måste cellerna sönderdelas så att det intracellulära materialet frigörs. Cellsönderdelning med ultraljud är en väletablerad, mycket tillförlitlig och effektiv teknik för celldesintegration och frigörande av föreningar.

Mikrobiella cellfabriker är celler vars metabolism har modifierats för syntes av olika värdefulla föreningar. Cellsönderdelning med ultraljud är en effektiv och tillförlitlig metod för att frigöra de värdefulla föreningarna från cellernas inre.
studie och grafik: ©Villaverde, 2010.

Fördelar med ultraljudsbaserade cellsönderdelare

Som en icke-termisk, skonsam men ändå mycket effektiv teknik används ultraljudsbaserade cellsönderdelare inom laboratorier och industri för att lysera celler och producera högkvalitativa extrakt, exempelvis för isolering av molekyler från cellfabriker.

Effektultraljud för effektiv sönderdelning av mikrobiella cellfabriker

Mekanism och effekter hos ultraljudsbaserade cellsönderdelare:
Vid cellupplösning med ultraljud utnyttjas ultraljudsvågornas kraft. Ultraljudshomogenisatorn / cellupplösaren är utrustad med en sond (även kallad sonotrod) av titanlegering som oscillerar med en hög frekvens på cirka 20 kHz. Detta innebär att ultraljudssonden kopplar in 20 000 vibrationer per sekund i den sonikerade vätskan. Ultraljudsvågorna som kopplas in i vätskan kännetecknas av växlande högtrycks- / lågtryckscykler. Under en lågtryckscykel expanderar vätskan och mycket små vakuumbubblor uppstår. Dessa mycket små bubblor växer under flera växlande tryckcykler tills de inte kan absorbera mer energi. Då imploderar kavitationsbubblorna våldsamt och skapar lokalt en utomordentligt energität miljö. Detta fenomen kallas akustisk kavitation och kännetecknas av lokalt mycket höga temperaturer, mycket höga tryck och skjuvkrafter. Dessa skjuvspänningar bryter effektivt sönder cellväggar och ökar massöverföringen mellan cellens inre och det omgivande lösningsmedlet. Som en rent mekanisk teknik används ultraljudsgenererade skjuvkrafter i stor utsträckning och är den rekommenderade metoden för upplösning av bakterieceller samt för proteinisolering. Som en enkel och snabb metod för cellupplösning är sonikering idealisk för isolering i små, medelstora och stora volymer. Hielschers digitala ultraljudsapparater är utrustade med en överskådlig inställningsmeny för exakt styrning av sonikeringen. Alla sonikeringsdata lagras automatiskt på ett inbyggt SD-kort och är lättillgängliga. Avancerade möjligheter till värmeavledning, såsom extern kylning, sonikering i pulsläge med mera under ultraljudsupplösningsprocessen, säkerställer att den idealiska processtemperaturen bibehålls och därmed att de extraherade värmekänsliga föreningarna förblir intakta.

Forskning understryker styrkorna hos cellupplösning och extraktion med ultraljud

Prof. Chemat et al. (2017) sammanfattar i sin studie att ”ultraljudsassisterad extraktion är ett miljövänligt och ekonomiskt hållbart alternativ till konventionella tekniker för livsmedel och naturprodukter. De främsta fördelarna är kortare extraktions- och bearbetningstid, minskad förbrukning av energi och lösningsmedel, färre enhetsoperationer samt minskade CO₂ -utsläpp.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) använde en högtryckshomogenisator och en ultraljudscellupplösare i sin studie för att lysera sporer i syfte att frigöra DNA. Vid en jämförelse av de båda metoderna för cellupplösning drar forskargruppen följande slutsats om celllys för spor-DNA: ”Analysen har utförts med celllysat från högtryckshomogeniseringen. Därefter insåg vi att cellupplösning med ultraljud har enastående fördelar för detta ändamål. Den är ganska snabb och kan utföras med små provvolymer.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekyler från cellfabriker för livsmedelsproduktion

Mikrobiella cellfabriker är en genomförbar och effektiv produktionsmetod som använder mikrobiella organismer för att producera höga utbyten av naturligt förekommande och icke naturligt förekommande metaboliter genom metabolisk bioteknisk modifiering av mikroorganismer såsom bakterier, jästsvampar, andra svampar etc. Enzymer i bulk produceras till exempel med hjälp av mikroorganismer såsom Aspergillus oryzae, svampar och bakterier. Dessa enzymer i bulk används för livsmedels- och dryckesproduktion samt inom jordbruk, bioenergi och hushållsrengöring.
Vissa bakterier såsom Acetobacter xylinum och Gluconacetobacter xylinus producerar cellulosa under fermenteringsprocessen, där nanofibrer syntetiseras genom en process som bygger upp dem från mindre beståndsdelar. Bakteriell cellulosa (även känd som mikrobiell cellulosa) är kemiskt likvärdig med växtcellulosa, men har hög kristallinitetsgrad och hög renhet (fri från lignin, hemicellulosa, pektin och andra biogena komponenter) samt en unik struktur bestående av ett tredimensionellt (3D) nätverk vävt av cellulosananofibrer. (jfr Zhong, 2020) Jämfört med växtbaserad cellulosa är bakteriell cellulosa mer hållbar, och den producerade cellulosan är ren och kräver inga komplexa reningssteg. Ultraljudsbehandling och lösningsmedelsextraktion med NaOH eller SDS (natriumdodecylsulfat) är mycket effektiva för att isolera bakteriell cellulosa från bakteriecellerna.

Biomolekyler från cellfabriker för läkemedels- och vaccinproduktion

En av de mest framträdande läkemedelsprodukterna som framställs från cellfabriker är humant insulin. För bioteknisk insulinproduktion används främst E. coli och Saccharomyces cerevisiae. Eftersom biosyntetiserade molekyler i nanostorlek har hög biokompatibilitet är biologiska nanopartiklar såsom ferritin fördelaktiga för många tillämpningar inom biologisk tillverkning. Dessutom är produktionen i metaboliskt modifierade mikrober ofta betydligt effektivare när det gäller de utbyten som erhålls. Till exempel har produktionen av artemisininsyra, resveratrol och lykopen ökat tiofaldigt till flera hundrafaldigt och är redan etablerad eller under utveckling för produktion i industriell skala. (jfr Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Till exempel är proteinbaserade biomolekyler i nanostorlek med självorganiserande egenskaper, såsom ferritin och virusliknande partiklar, särskilt intressanta för vaccinutveckling eftersom de efterliknar både storleken och strukturen hos patogener och möjliggör konjugering av antigener till ytan för att främja interaktionen med immunceller. Sådana molekyler uttrycks i så kallade cellfabriker (t.ex. modifierade E. coli-stammar), som producerar en viss målmolekyl.

Protokoll för ultraljudslys av E. coli BL21 för frisättning av ferritin

Ferritin är ett protein vars primära funktion är att lagra järn. Ferritin uppvisar lovande egenskaper som självorganiserande nanopartiklar i vacciner, där det används som bärare för vaccinkomponenter (t.ex. SARS-Cov-2-spikproteiner). Den vetenskapliga forskningen av Sun et al. (2016) visar att rekombinant ferritin kan frisättas i löslig form från Escherichia coli vid låga NaCl-koncentrationer (≤50 mmol/L). För att uttrycka ferritin i E. coli BL21 och frisätta ferritinet användes följande protokoll med framgång. Den rekombinanta plasmiden pET-28a/ferritin transformerades in i stammen E coli BL21 (DE3). De ferritinproducerande E coli BL21 (DE3)-cellerna odlades i LB-odlingsmedium med 0,5% kanamycin vid 37°C och inducerades vid ett OD600 på 0,6 med 0,4% isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid i 3 timmar vid 37°C. Den slutliga kulturen skördades sedan genom centrifugering vid 8000g i 10 minuter vid 4°C, och pelleten samlades upp. Därefter resuspenderades pelleten i LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% jästextrakt)/lysbuffert (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) respektive NaCl-lösningar med olika koncentrationer (0, 50, 100, 170 och 300 mmol/L). För lys av bakterieceller användes ultraljudsbehandling i pulsläge: t.ex. med ultraljudsapparaten UP400St vid 100% amplitud med en pulssekvens på 5 sekunder PÅ, 10 sekunder AV, under 40 cykler) och därefter centrifugerades vid 10 000g i 15 minuter vid 4°C. Supernatanten och fällningen analyserades med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Alla geler som färgats med natriumdodecylsulfat skannades med en högupplöst skanner. Gelbilderna analyserades med programvaran Magic Chemi 1D. För optimal tydlighet detekterades proteinbanden genom justering av parametrar. Data för banden genererades från tekniska triplikat. (jfr Sun et al., 2016)

Ultraljudscelldisruptorer för industriell lysering av cellfabriker

Lysering och extraktion med ultraljud är en tillförlitlig och bekväm metod för att frigöra metaboliter från cellfabriker och därigenom bidra till en effektiv produktion av målmolekyler. Ultraljudscelldisruptorer finns i storlekar från laboratorieutrustning till industriutrustning, och processerna kan skalas upp helt linjärt.
Hielscher Ultrasonics är din kompetenta partner för högpresterande ultraljudsdisruptorer och har lång erfarenhet av att installera ultraljudssystem i bänkskala och industriella miljöer.
När det gäller avancerad maskinvara och programvara uppfyller Hielscher Ultrasonics system för cellsönderdelning alla krav på optimal processtyrning, enkel hantering och användarvänlighet. Kunder och användare av Hielschers ultraljudsapparater uppskattar att Hielschers ultraljudscelldisruptorer och extraktorer möjliggör exakt processövervakning och processtyrning – via digital pekskärm och fjärrstyrning via webbläsare. Alla viktiga data för ultraljudsbehandlingen (t.ex. nettoenergi, total energi, amplitud, varaktighet, temperatur och tryck) lagras automatiskt som en CSV-fil på ett inbyggt SD-kort. Detta bidrar till reproducerbara och repeterbara resultat och underlättar processstandardisering samt efterlevnad av god tillverkningssed (cGMP).
Hielschers ultraljudsprocessorer är självklart byggda för drift dygnet runt under full belastning och kan därför användas tillförlitligt i industriella produktionsmiljöer. Tack vare hög robusthet och lågt underhållsbehov är ultraljudsutrustningens stilleståndstid mycket kort. Funktionerna CIP (rengöring på plats) och SIP (sterilisering på plats) minimerar arbetskrävande rengöring, särskilt eftersom alla medieberörda delar har släta metallytor (inga dolda öppningar eller munstycken).

Tabellen nedan ger en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: