Biosyntetisk produktion av oligosackarider i humanmjölk

Biosyntes av oligosackarider i humanmjölk (HMO) genom fermentering eller enzymatiska reaktioner är en komplex, resurskrävande process som ofta ger lågt utbyte. Ultraljudsbehandling ökar massöverföringen mellan substrat och cellfabriker och stimulerar celltillväxt och metabolism. Därigenom intensifierar ultraljudsbehandling fermentering och biokemiska processer, vilket leder till snabbare och effektivare produktion av HMO.

Oligosackarider i humanmjölk

Oligosackarider i humanmjölk (HMO), även kända som humanmjölksglykaner, är sockermolekyler som tillhör gruppen oligosackarider. Framträdande exempel på HMO är 2’-fukosyllaktos (2′-FL), lakto-N-neotetraos (LNnT), 3’-galaktosyllaktos (3′-GL) och difukosyllaktos (DFL).
Även om human bröstmjölk innehåller fler än 150 olika HMO-strukturer är det för närvarande endast 2′-fukosyllaktos (2′-FL) och lakto-N-neotetraos (LNnT) som produceras kommersiellt och används som näringstillsatser i modersmjölksersättning.
Oligosackarider i humanmjölk (HMO) är kända för sin betydelse för spädbarns nutrition. Oligosackarider i humanmjölk är en unik typ av näringsämnen som fungerar som prebiotika, antiadhesiva antimikrobiella ämnen och immunmodulatorer i spädbarnets tarm och bidrar väsentligt till hjärnans utveckling. HMO finns uteslutande i human bröstmjölk; mjölk från andra däggdjur (t.ex. kor, getter, får, kameler osv.) innehåller inte denna specifika form av oligosackarider.
Oligosackarider i humanmjölk är den tredje vanligaste fasta beståndsdelen i humanmjölk och kan förekomma i löst, emulgerad eller suspenderad form i vatten. Laktos och fettsyror är de vanligaste fasta beståndsdelarna i humanmjölk. HMO förekommer i en koncentration på 0,35–0,88 uns (9,9–24,9 g)/ L. Ungefär 200 strukturellt olika oligosackarider i humanmjölk är kända. Den dominerande oligosackariden hos 80% av alla kvinnor är 2′-fukosyllaktos, som förekommer i human bröstmjölk i en koncentration på cirka 2,5 g/ L.
Eftersom HMO inte spjälkas bidrar de inte med kalorier till näringen. Som osmältbara kolhydrater fungerar de som prebiotika och fermenteras selektivt av önskvärd tarmmikroflora, särskilt bifidobakterier.

Biosyntes av oligosackarider i humanmjölk

Cellfabriker och enzymatiska / kemoenzymatiska system är tekniker som i dag används för syntes av HMO. För produktion av HMO i industriell skala är fermentering med mikrobiella cellfabriker, biokemisk syntes och olika enzymatiska reaktioner genomförbara metoder för bioproduktion av HMO. Av ekonomiska skäl är biosyntes med mikrobiella cellfabriker för närvarande den enda teknik som används för industriell produktion av HMO.

Fermentering av HMO med mikrobiella cellfabriker

E.coli, Saccharomyces cerevisiae och Lactococcus lactis är vanligt förekommande cellfabriker som används för bioproduktion av biologiska molekyler såsom HMO. Fermentering är en biokemisk process där mikroorganismer används för att omvandla ett substrat till de önskade biologiska molekylerna. Mikrobiella cellfabriker använder enkla sockerarter som substrat och omvandlar dem till HMO. Eftersom enkla sockerarter (t.ex. laktos) är ett billigt substrat som finns i riklig mängd, hålls biosyntesprocessen kostnadseffektiv.
Tillväxt- och biokonversionshastigheten påverkas främst av masstransporten av näringsämnen (substrat) till mikroorganismerna. Masstransporthastigheten är en av de viktigaste faktorerna som påverkar produktsyntesen under fermentering. Ultraljudsbehandling är välkänd för att främja masstransport.
Under fermenteringen måste förhållandena i bioreaktorn ständigt övervakas och regleras så att cellerna kan växa så snabbt som möjligt för att sedan producera de önskade biomolekylerna (t.ex. oligosackarider såsom HMO; insulin; rekombinanta proteiner). Teoretiskt sett börjar produktbildningen så snart cellkulturen börjar växa. Särskilt i genetiskt modifierade celler, såsom genmodifierade mikroorganismer, induceras den dock vanligtvis senare genom att en kemisk substans tillsätts till substratet, vilket uppreglerar uttrycket av den önskade biomolekylen. Ultraljudsbioreaktorer (sonobioreaktorer) kan styras exakt och möjliggör specifik stimulering av mikrober. Detta resulterar i en snabbare biosyntes och högre utbyten.
Ultraljudslys och ultraljudsextraktion: Fermentering av komplexa HMO kan begränsas av låga produkttitrar vid fermenteringen och av att produkterna förblir intracellulära. Ultraljudslys och ultraljudsextraktion används för att frigöra intracellulärt material före rening och efterföljande processteg.

Ultraljudsfrämjad fermentering

Tillväxthastigheten hos mikrober såsom Escherichia coli, genmodifierad E.coli, Saccharomyces cerevisiae och Lactococcus lactis kan ökas genom att masstransporthastigheten och cellväggens permeabilitet ökas med hjälp av kontrollerad lågfrekvent ultraljudsbehandling. Som en skonsam, icke-termisk bearbetningsteknik tillför ultraljudsbehandling rent mekaniska krafter till fermenteringsbuljongen.
Akustisk kavitation: Ultraljudsbehandlingens funktionsprincip bygger på akustisk kavitation. Ultraljudssonden (sonotroden) kopplar in lågfrekventa ultraljudsvågor i mediet. Ultraljudsvågorna färdas genom vätskan och skapar omväxlande högtryckscykler (kompression) / lågtryckscykler (förtunning). Genom att vätskan komprimeras och sträcks ut i omväxlande cykler uppstår mycket små vakuumbubblor. Dessa små vakuumbubblor växer under flera cykler tills de når en storlek där de inte kan absorbera mer energi. Vid denna punkt av maximal tillväxt imploderar vakuumbubblan våldsamt och skapar lokalt extrema förhållanden, ett fenomen som kallas kavitation. I kavitationens ”hotspot” kan stora tryck- och temperaturskillnader samt intensiva skjuvkrafter med vätskestrålar på upp till 280m/sec observeras. Genom dessa kavitationseffekter uppnås omfattande masstransport och sonoporation (perforering av cellväggar och cellmembran). Näringsämnena i substratet transporteras till och in i de levande hela cellerna, så att cellfabrikerna får optimal näring och såväl tillväxt- som omvandlingshastigheterna ökar. Ultraljudsbioreaktorer är en enkel men mycket effektiv strategi för att bearbeta biomassa i en biosyntesprocess i ett enda reaktionskärl.
Exakt styrd, skonsam ultraljudsbehandling är välkänd för att intensifiera fermenteringsprocesser.
Ultraljudsbehandling förbättrar ”produktiviteten i många bioprocesser som involverar levande celler genom förbättrat substratupptag, ökad produktion eller tillväxt genom ökad cellporositet och potentiellt ökad frisättning av cellkomponenter.” (Naveena et al. 2015)
Läs mer om ultraljudsassisterad fermentering!

Naveena et al. (2015) fann att ultraljudsintensifiering erbjuder flera fördelar vid bioprocessning, bland annat låga driftskostnader jämfört med andra behandlingsalternativ som förbättrar processen, enkel användning och måttliga effektbehov.

Högpresterande ultraljudsreaktorer för fermentering

Fermenteringsprocesser omfattar levande mikroorganismer såsom bakterier eller jäst, vilka fungerar som cellfabriker. När ultraljudsbehandling används för att främja massöverföring och öka mikroorganismernas tillväxt och omvandlingshastighet är det avgörande att styra ultraljudsintensiteten exakt för att undvika att cellfabrikerna förstörs.
Hielscher Ultrasonics är specialist på konstruktion, tillverkning och distribution av högpresterande ultraljudsapparater som kan styras och övervakas exakt för att säkerställa överlägsna fermenteringsutbyten.

Processtyrning är inte bara avgörande för höga utbyten och överlägsen kvalitet, utan gör det även möjligt att upprepa och reproducera resultat. Särskilt vid stimulering av cellfabriker är cellspecifik anpassning av ultraljudsparametrarna avgörande för att uppnå höga utbyten och förhindra cellnedbrytning. Därför är alla digitala modeller av Hielschers ultraljudsapparater utrustade med intelligent programvara som gör det möjligt att justera, övervaka och revidera ultraljudsparametrarna. Ultraljudsprocessparametrar såsom amplitud, temperatur, tryck, behandlingstid, arbetscykler och energitillförsel är avgörande för att främja HMO-produktion genom fermentering.
Den smarta programvaran i Hielschers ultraljudsapparater registrerar automatiskt alla viktiga processparametrar på det integrerade SD-kortet. Den automatiska dataregistreringen av ultraljudsprocessen utgör grunden för processtandardisering och reproducerbarhet / repeterbarhet, vilket krävs för god tillverkningssed (GMP).

Ultraljudsreaktorer för fermentering

Hielscher erbjuder ultraljudssonder i olika storlekar, längder och geometrier som kan användas för såväl satsvisa behandlingar som kontinuerliga genomflödesbehandlingar. Ultraljudsreaktorer, även kallade sonobioreaktorer, finns tillgängliga för alla volymer och täcker ultraljudsbaserad bioprocessning från små laboratorieprover till pilotproduktion och full kommersiell produktion.
Det är välkänt att ultraljudssonotrodens placering i reaktionskärlet påverkar fördelningen av kavitation och mikroströmningar i mediet. Sonotroden och ultraljudsreaktorn bör väljas utifrån den volym odlingsbuljong som ska bearbetas. Även om ultraljudsbehandling kan utföras både satsvis och kontinuerligt rekommenderas en anläggning med kontinuerligt flöde för stora produktionsvolymer. När hela odlingsmediet passerar genom en ultraljudsflödescell utsätts det för exakt samma ultraljudsexponering, vilket säkerställer den mest effektiva behandlingen. Hielscher Ultrasonics breda sortiment av ultraljudssonder och flödescellsreaktorer gör det möjligt att sätta samman den idealiska utrustningen för ultraljudsbaserad bioprocessning.

Hielscher Ultrasonics – från laboratorium till pilotproduktion och produktion

Hielscher Ultrasonics täcker hela spektrumet av ultraljudsutrustning och erbjuder allt från kompakta handhållna ultraljudshomogenisatorer för provberedning till bänk- och pilotsystem samt kraftfulla industriella ultraljudsenheter som enkelt bearbetar hela lastbilslaster per timme. Tack vare mångsidiga och flexibla installations- och monteringsalternativ kan Hielschers ultraljudsapparater enkelt integreras i alla typer av satsreaktorer, matade satsprocesser eller system med kontinuerligt genomflöde.
Olika tillbehör och specialanpassade delar gör det möjligt att optimalt anpassa ditt ultraljudssystem till dina processkrav.
Hielschers ultraljudsprocessorer är byggda för drift dygnet runt under full belastning och hård drift under krävande förhållanden. De är tillförlitliga och kräver endast lite underhåll.
Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: