Peptidsyntes i fast fas – effektivare med ultraljudsbehandling
Peptidsyntes i fast fas (SPPS) är den vanliga metoden för peptidsyntes. Ultraljudsbehandling är ett tillförlitligt verktyg för att intensifiera peptidsyntes i fast fas, vilket ger högre utbyten, förbättrad renhet, ingen racemisering och avsevärt ökad reaktionshastighet. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för peptidsyntes, avspjälkning och upplösning.
Ultraljudsassisterad peptidsyntes i fast fas
Ultraljudsbehandling används redan i stor utsträckning som intensifieringsmetod inom organisk syntes och är välkänd för sina fördelar, såsom drastiskt förkortade reaktionstider, högre utbyten, färre biprodukter, initiering av reaktionsvägar som inte skulle kunna uppnås på andra sätt och/eller bättre selektivitet. Stora fördelar kan också uppnås när ultraljud kopplas in i peptidsyntesreaktioner. Forskningsresultat har visat att ultraljudsassisterad peptidsyntes ger optimerat utbyte av peptider med hög renhet, utan racemisering och med kort reaktionstid.
- Höga peptidutbyten
- Avsevärt snabbare syntes
- Högre peptidrenhet
- Ingen racemisering
- Parallell syntes av olika peptider
- Skalbar till valfri volym
Ultraljudshorn av kopptyp för jämn ultraljudsbehandling av flera reaktionskärl för förbättrad peptidsyntes.
Illustration av Merrifields peptidsyntes i fast fas. Ultraljudsbehandling används för att främja och förbättra syntesreaktionen samt för att spjälka av de syntetiserade peptiderna från hartset.
Illustration: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studie | Studerade peptider | Reaktionstid (klassisk syntes jämfört med US-SPPS) | Råproduktens renhet (klassisk syntes jämfört med US-SPPS) | Racemisering och sidoreaktioner | Viktigaste slutsatser |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Inga observerades för Cys/His, även vid 70°C | ~7–12x snabbare syntes; stora förbättringar av renheten, särskilt för aggregationsbenägna sekvenser som TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (endast US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Inte testat; en liten minskning av renheten noterades för Pep2 | 14x kortare tid för Pep1; råutbytena ökade avsevärt. |
| Merlino et al. (2019) | Modellpentapeptider, peptider upp till 44-mer, ”svåra sekvenser” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modell) | 84% → 93% (modell); avsevärt högre än vid termisk uppvärmning (~45°C) | Ingen signifikant ökning av Cys/His-enantiomerer | Mycket effektiv för svåra/aggregationsbenägna sekvenser; möjliggör minskat reagensöverskott med bibehållen hög renhet. |
Peptidsyntes i fast fas förbättrad med ultraljud
Fastfaspeptidsyntes (SPPS) är en kemisk reaktion som gör det möjligt att bygga upp en peptidkedja genom successiva reaktioner mellan aminosyraderivat på ett olösligt poröst bärarmaterial. Traditionell fastfaspeptidsyntes är dock en relativt ineffektiv och långsam process. Därför är intensifiering av peptidsyntes med ultraljud ett högt värderat verktyg för effektivare och snabbare syntes av peptider.
Silva et al. (2021) jämförde ”klassisk” fluorenylmetoxikarbonylbaserad (Fmoc) fastfaspeptidsyntes (SPPS) med ultraljudsassisterad (US) SPPS genom framställning av tre peptider, nämligen den peptid som är specifik för fibroblasttillväxtfaktorreceptor 3(FGFR3), Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), och de nya peptiderna Pep2 (RQMATADEA-NH2) och Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
US-assisterad SPPS minskade tidsåtgången för uppbyggnaden av peptiderna med en faktor 14 (Pep1) respektive 4 (Pep2) jämfört med den ”klassiska” metoden. Intressant nog gav ultraljudsassisterad SPPS Pep1 med högre renhet (82%) än ”klassisk” SPPS (73%). Den avsevärda tidsminskningen i kombination med den uppnådda höga renheten hos råpeptiderna fick forskargruppen att tillämpa US-assisterad SPPS på den stora peptiden Pep3, som innehåller ett stort antal hydrofoba aminosyror och homooligosekvenser. Anmärkningsvärt nog kunde denna 25-merpeptid syntetiseras på mindre än 6 timmar (347 min) med måttlig renhet (cirka 49%).
Snabbare peptidsyntes genom fastfaspeptidsyntes med ultraljudsomrörning.
(Studie och analys: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) genomförde också en omfattande studie av ultraljudets effekter på Fmoc-baserad fastfaspeptidsyntes, som möjliggjorde syntes av olika biologiskt aktiva peptider (upp till 44-mer), med anmärkningsvärda besparingar av material och reaktionstid. De visade att ultraljudsbehandling inte förvärrade de huvudsakliga sidoreaktionerna och förbättrade syntesen av peptider med ”svåra sekvenser”, vilket placerar ultraljudsfrämjad fastfaspeptidsyntes (US-SPPS) bland dagens högeffektiva strategier för peptidsyntes.
Tillgången till högpresterande system för ultraljudssyntes (sonisk syntes) av peptider möjliggör avsevärt högre synteshastigheter och ökad renhet hos råprodukterna. (jfr Wołczański et al., 2019)
Undersökningen av racemisering. Jämförelse av signifikanta 1H-NMR-spektra för modellpeptider som syntetiserats manuellt med den klassiska metoden vid rumstemperatur respektive med ultraljudsmetoden vid förhöjd temperatur. Kemiska skift för α-protonerna i His och Cys och metylengruppen i Acm (vänstra panelerna) samt ɣ-metylprotonerna i Val (högra panelerna) visar att ultraljudsbehandling vid 70°C inte orsakar racemisering.
(Studie och analys: Wołczański et al., 2019)
Avspjälkning av peptider med ultraljud
Efter fastfaspeptidsyntes (SPPS) måste de syntetiserade peptiderna spjälkas av från polymerhartserna. Detta steg kallas även avskyddning. Vid jämförelse mellan vanlig skakning och ultraljudsbehandling för avspjälkning av peptider från harts kräver skakmetoden cirka 1 timme, medan avspjälkning med ultraljud kan genomföras på 15 till 20 min. Avspjälkning av peptider med ultraljud kan tillämpas för att spjälka av skyddade aminosyror och peptider som är bundna till polystyrenhartser via bensylesterbindningar.
Avspjälkning av peptider från polystyrenharts med ultraljud ger höga utbyten av peptider med hög renhet, utan racemisering, i ett snabbt förfarande.
(studie och grafik: ©Anuradha och Ravindranath, 1995)
Ultraljudsomrörd reaktor för förbättrad och snabbare peptidsyntes. Bilden visar ultraljudsapparaten UP200St i en omrörd glasreaktor.
Högpresterande ultraljudsapparater för peptidsyntes
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för direkt och indirekt ultraljudsbehandling. Kraftfulla och exakt reglerbara ultraljudsprocessorer tillför exakt rätt mängd ultraljudsenergi till reaktionskärlet. Oavsett om du använder sprutor, rör, flerbrunnsplattor eller glasreaktorer som synteskärl erbjuder Hielscher Ultrasonics den ultraljudsapparat som är mest lämplig för din peptidtillämpning.
- skräddarsydda peptider
- storskalig peptidproduktion
- peptidbibliotek
Många peptidsynteser utförs i sprutor (t.ex. sprutreaktorer med fritta). Hielschers ultraljudsomrörare för sprutor ultraljudsbehandlar peptidlösningen genom att koppla in ultraljudsvågorna genom sprutväggen till vätskan. Ultraljudsomröraren för sprutor är en av de mest populära ultraljudslösningarna för ultraljudsassisterad syntes av peptider.
Ultraljudskopphornet är ett lämpligt verktyg för att ultraljudsbehandla upp till 5 reaktorkärl, medan VialTweeter kan rymma upp till tio reaktionsrör samt ytterligare fem större kärl med hjälp av ett klämtillbehör.
För andra reaktortyper, såsom Merrifields eller Kamysz fastfasreaktor, och andra kärl och reaktorer av polypropen eller borosilikat erbjuder Hielscher ultraljudsapparater för indirekt och direkt ultraljudsbehandling med skräddarsydd klämmontering eller fläns.
Större omrörda glasreaktorer, t.ex. för syntes i lösningsfas, kan naturligtvis enkelt utrustas med ultraljudssonder (även kallade sonotroder eller ultraljudshorn) av valfri storlek.
- olika typer av ultraljudsapparater
- direkt och indirekt ultraljudsbehandling
- exakt intensitetsreglering
- exakt temperaturreglering
- kontinuerligt eller pulserat ultraljud
- smarta funktioner, programmerbara apparater
- tillgängliga för alla volymer
- linjär skalbarhet
UIP400MTP är den idealiska apparaten för fastfaspeptidsyntes i flerbrunns-/mikrotiterplattor. Ultraljudskavitation kopplas indirekt och jämnt in i de många provbrunnarna för överlägsen massöverföring och syntesreaktion. Titta på videon nedan för att se ultraljudsapparaten för mikroplattor UIP400MTP i drift!
Kontakta oss! / Fråga oss!
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer för blandningstillämpningar, dispergering, emulgering och extraktion i laboratorie-, pilot- och industriskala.
Värt att veta om ultraljudsassisterad peptidsyntes
Vad är peptider?
Peptider är föreningar där flera aminosyror är sammanlänkade via amidbindningar, så kallade peptidbindningar. När de binds samman i komplexa strukturer – som vanligtvis består av 50 eller fler aminosyror – kallas dessa stora peptidstrukturer för proteiner. Peptider är en grundläggande byggsten för livet och fyller många funktioner i kroppen.
Hur fungerar peptidsyntes?
Inom organisk kemi, molekylärbiologi och livsvetenskap är peptidsyntes processen för att framställa peptider. Peptider syntetiseras kemiskt genom en kondensationsreaktion mellan karboxylgruppen hos en aminosyra och aminogruppen hos en annan aminosyra. Strategier med skyddsgrupper används vanligtvis för att undvika oönskade sidoreaktioner med de olika aminosyrasidokedjorna.
Kemisk peptidsyntes (in vitro) börjar oftast med att karboxylgruppen hos den inkommande aminosyran (C-terminalen) kopplas till N-terminalen hos den växande peptidkedjan. Till skillnad från denna C-till-N-syntes sker den naturliga proteinbiosyntesen av långa peptider i levande organismer i motsatt riktning. Det innebär att den inkommande aminosyrans N-terminal vid biosyntes kopplas till proteinkedjans C-terminal (N-till-C).
De flesta forsknings- och utvecklingsprotokoll för peptidsyntes bygger på fastfasmetoder, medan syntesmetoder i lösningsfas förekommer inom storskalig industriell produktion av peptider.
Vilken är den senaste tekniken inom peptidsyntes?
SUS-SPPS (hållbar ultraljudsassisterad SPPS) har visats minska processen till endast två steg per cykel (kombinerad koppling/ändblockering/avskyddning + en enda tvätt), vilket avsevärt minskar lösningsmedelsförbrukningen och tidsåtgången. (jfr Mottola et al., 2025)
Ultraljudsassisterad TAPS är en framväxande kombination med påvisad framgång vid totalsynteser (t.ex. lipobactin) och undersöks av kontraktsutvecklings- och tillverkningsorganisationer (CDMO:er) för tillverkning av aktiva farmaceutiska substanser (API:er).
Upptäck fördelarna med ultraljudsassisterad TAGGING-peptidsyntes!
Kontinuerlig bearbetning undersöks som en ytterligare förbättring – plattformar för kontinuerlig enkärlssyntes med hjälp av silylerade taggar har beskrivits.
Området utvecklas mot principerna för grön kemi, där både ultraljud och TAPS bidrar till minskad lösningsmedelsanvändning, lägre reagenstillsats och förbättrad hållbarhet.
Litteratur / Referenser
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från laboratoriestorlek till industriell storlek.