Peptidsyntes i fast fas – Effektivare med ultraljudsbehandling
Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) är den vanliga metoden för peptidsyntes. Ultraljud är ett pålitligt verktyg för att intensifiera fastfas peptidsyntes vilket resulterar i högre utbyten, förbättrad renhet, ingen racemisering och betydligt accelererad reaktionshastighet. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för peptidsyntes, klyvning och upplösning.
Ultraljudsbaserad peptidsyntes i fast fas
Ultraljud används redan i stor utsträckning som intensifierande metod i organisk syntes och är välkänd för sina fördelar såsom drastiskt minskade reaktionstider, högre avkastning, mindre biprodukter, initiering av vägar, som inte kunde uppnås på andra sätt, och / eller bättre selektivitet. Stora fördelar kan också erhållas, när ultraljudsbehandling kopplas till peptidsyntes reaktioner. Forskningsresultat har visat att ultraljudsassisterad peptidsyntes uppnår optimerat utbyte av peptider med hög renhet, utan racemisering inom en kort reaktionstid.
- Höga peptidutbyten
- Betydligt snabbare syntes
- Högre peptidrenhet
- Ingen racemisering
- Parallell syntes av olika peptider
- Kan skalas upp till valfri volym
Ultraljud cuphorn för enhetlig ultraljudsbehandling av flera reaktorkärl för förbättrad peptidsyntes.
Illustration som visar Merrifields fastfaspeptidsyntes. Ultraljud används för att påskynda och förbättra syntesreaktionen samt för att frigöra de syntetiserade peptiderna från hartset.
Grafik: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studie | Undersökta peptider | Reaktionstid (klassisk metod jämfört med US-SPPS) | Råolans renhet (klassisk metod jämfört med US-SPPS) | Racemisering och sidoreaktioner | Viktiga slutsatser |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański m.fl. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfiner | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | Inget observerades för Cys/His, inte ens vid 70 °C | ~7–12 gånger snabbare syntes; betydande förbättringar av renheten, särskilt för sekvenser som lätt bildar aggregat, såsom TAT. |
| Silva m.fl. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (endast USA) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Ej testat; en liten minskning av renheten i Pep2 har konstaterats | 14-faldig tidsbesparing för Pep1; utbytet av råprodukt ökade avsevärt. |
| Merlino m.fl. (2019) | Modellpentapeptider, peptider med upp till 44 aminosyror, “Svåra sekvenser” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modell) | 84 % → 93 % (modell); betydligt högre än vid termisk uppvärmning (~45 °C) | Ingen signifikant ökning för Cys/His-enantiomererna | Mycket effektivt för svåra sekvenser eller sekvenser som lätt bildar aggregat; möjliggör minskat överskott av reagens samtidigt som hög renhet bibehålls. |
Solidfaspeptidsyntesen förbättras med ultraljud
Fastfaspeptidsyntes (SPPS) är en kemisk reaktion som möjliggör montering av en peptidkedja genom successiva reaktioner av aminosyraderivat på ett olösligt poröst stöd. Den traditionella peptidsyntesen i fast fas är dock en relativt ineffektiv och långsam process. Därför är ultraljud intensifiering av peptidsyntes ett högt ansett verktyg för en mer effektiv och snabb syntes av peptider.
Silva m.fl. (2021) jämförde “klassisk” fluorenylmetoxikarbonyl (Fmoc)-peptidsyntes i fast fas (SPPS) med ultraljud (US)-assisterad SPPS baserad på framställningen av tre peptider, nämligen den fibroblasttillväxtfaktorreceptor 3 (FGFR3)-specifika peptiden Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) och de nya peptiderna Pep2 (RQMATADEA-NH2) och Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS med hjälp av US ledde till en 14-faldig (Pep1) respektive 4-faldig tidsbesparing (Pep2) vid peptidsammansättningen jämfört med “klassisk” metoden. Intressant nog gav ultraljudsassisterad SPPS Pep1 med högre renhet (82 %) än “klassisk” SPPS (73 %). Den betydande tidsbesparingen i kombination med den höga renheten hos den råa peptiden fick forskarteamet att tillämpa ultraljudsassisterad SPPS på den stora peptiden Pep3, som uppvisar ett stort antal hydrofoba aminosyror och homooligosekvenser. Anmärkningsvärt nog kunde syntesen av denna 25-mer-peptid genomföras på mindre än 6 timmar (347 minuter) med måttlig renhet (ca 49 %).
Snabbare peptidsyntes via fastfaspeptidsyntes med hjälp av ultraljudsomrörning.
(Studie och analys: Wołczański et al., 2019)
Merlino m.fl. (2019) genomförde också en omfattande studie av ultraljudets effekter på Fmoc-baserad peptidsyntes i fast fas, vilket möjliggjorde syntes av olika biologiskt aktiva peptider (upp till 44-mer) med en betydande besparing av material och reaktionstid. De visade att ultraljudsbehandlingen inte förvärrade de viktigaste sidoreaktionerna och förbättrade syntesen av peptider med “Svåra sekvenser”, vilket placerar den ultraljudsfrämjade fastfaspeptidsyntesen (US-SPPS) bland de nuvarande högeffektiva peptidsyntesstrategierna.
Tillgången till högpresterande system för ultraljud (sonisk) syntes av peptider möjliggör avsevärt förbättrade synteshastigheter och en ökning av renheten hos råvaror. (jfr Wołczański et al., 2019)
Utredning av racemisering. Jämförelse av signifikanta 1H NMR-spektra av modeller peptider syntetiserade manuellt med hjälp av den klassiska metoden vid rumstemperatur vs ultraljudsmetod vid förhöjd temperatur. Kemiska förändringar av Hans och Cys α-protoner och metylengruppen av Acm (vänster paneler), ɣ-metylprotoner av Val (höger paneler) visar att ultraljudsbehandling vid 70 ° C inte orsakar racemisering.
(Studie och analys: Wołczański et al., 2019)
Ultraljud klyvning av peptider
Efter peptidsyntes i fast fas (SPPS) måste syntetiserade peptider klyvas från de polymera hartserna. Det här steget kallas även för avskydd. När vanlig skakning och ultraljud för peptidklyvning från harts jämförs, kräver skakningsmetoden ca 1 timme, medan ultraljudsklyvning kan åstadkommas på 15 till 20 minuter. Ultraljudspeptidklyvningen kan appliceras på klyvningen av skyddade aminosyror och peptider kopplade till polystyrenhartser genom bensylesterbindningar.
Ultraljudsklyvning av peptider från polystyrenharts ger höga utbyten av peptider i hög renhet, utan racemisering, inom ett snabbt förfarande.
(studie och grafik: ©Anuradha och Ravindranath, 1995)
Ultraljudsomrörd reaktor för förbättrad och accelererad peptidsyntes. Bilden visar ultraljudsapparat UP200St i en omrörd glasreaktor.
Högpresterande ultraljudsapparater för peptidsyntes
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för direkt och indirekt ultraljudsbehandling. Kraftfulla och exakt kontrollerbara ultraljudsprocessorer levererar exakt rätt mängd ultraljudsenergi till reaktionskärlet. Oavsett om du använder sprutor, rör, multibrunnsplattor eller glasreaktorer som synteskärl, erbjuder Hielscher Ultrasonics den mest lämpliga ultraljudsapparaten för din peptidapplikation.
- Anpassade peptider
- Storskalig peptidproduktion
- Peptid bibliotek
Många peptidsynteser utförs i sprutor (t.ex. frittade sprutreaktorer). Hielschers ultraljudsspruta omrörare sonikerar peptidlösningen och kopplar ultraljudsvågorna genom sprutväggen in i vätskan. Ultraljudssprutans omrörare är en av de mest populära ultraljudslösningarna för ultraljudsassisterad syntes av peptider.
Ultraljudskopphornet är ett lämpligt verktyg för att sonikera upp till 5 reaktorkärl, medan VialTweeter kan hålla upp till tio reaktionsrör plus ytterligare fem större kärl via klämtillbehör.
För andra reaktortyper, såsom Merrifield- eller Kamysz-fastfasreaktorer samt andra behållare och reaktorer av polypropen eller borosilikat, erbjuder Hielscher ultraljudsapparater för indirekt och direkt ultraljudsbehandling med skräddarsydda klämfästen eller flänsar.
Naturligtvis kan större omrörda glasreaktorer, t.ex. för syntes i lösningsfas, enkelt utrustas med ultraljudssonder (även kallade sonotroder eller ultraljudshorn) i valfri storlek.
- olika typer av ultraljudsapparater
- Direkt och indirekt ultraljudsbehandling
- Exakt intensitetskontroll
- Exakt temperaturkontroll
- Kontinuerligt eller pulserande ultraljud
- Smarta funktioner, programmerbara enheter
- Tillgänglig för alla volymer
- Linjär skalbarhet
För peptidsyntes i fast fas i flerhåls-/mikrotiterplattor är UIP400MTP den perfekta apparaten. Ultraljudskavitationen överförs indirekt och jämnt till de många provbrunnarna, vilket ger enastående massöverföring och syntesreaktion. Titta på videon nedan för att se Mikroplattsonikatorn UIP400MTP i drift!
Kontakta oss! / Fråga oss!
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer för blandningsapplikationer, dispersion, emulgering och extraktion i labb-, pilot- och industriell skala.
Viktiga fakta om peptidsyntes med ultraljud
Vad är peptider?
Peptider är föreningar där flera aminosyror är kopplade via amidbindningar, så kallade peptidbindningar. När den är bunden i komplexa strukturer – Vanligtvis består de av 50 eller fler aminosyror - dessa stora peptidstrukturer kallas proteiner. Peptider är en viktig byggsten i livet och fyller många funktioner i kroppen.
Hur fungerar peptidsyntes?
Inom organisk kemi, molekylärbiologi och biovetenskap är peptidsyntes processen att producera peptider. Peptider syntetiseras kemiskt via kondensationsreaktion mellan karboxylgruppen i en aminosyra och aminogruppen i en annan aminosyra. Strategier för att skydda grupper (även skyddande grupper) används vanligtvis för att undvika oönskade sidoreaktioner med de olika aminosyrasidokedjorna.
Kemisk (in-vitro) peptidsyntes börjar oftast med att koppla karboxylgruppen i den inkommande aminosyran (C-terminalen) till N-terminalen i den växande peptidkedjan. I motsats till denna C-till-N-syntes sker naturlig proteinbiosyntes av långa peptider i levande organismer i motsatt riktning. Detta innebär att i biosyntesen är N-terminalen för den inkommande aminosyran kopplad till C-terminalen i proteinkedjan (N-till-C).
De flesta forsknings- och utvecklingsprotokoll för peptidsyntes är baserade på fastfasmetoder, medan metoder för syntes i lösningsfas kan hittas i storskalig industriell produktion av peptider.
Vad är det senaste inom peptidsyntes?
SUS-SPPS (Hållbar ultraljudsassisterad SPPS) har visat sig kunna förenkla processen till endast två steg per cykel (kombinerad koppling/capping/avskyddning + en enda tvätt), vilket avsevärt minskar både lösningsmedelsförbrukningen och tidsåtgången. (jfr. Mottola et al., 2025)
Ultraljudsassisterad TAPS är en ny kombination som visat sig vara framgångsrik vid totalsynteser (t.ex. lipobactin) och som för närvarande utvärderas av CDMO-företag för tillverkning av aktiva läkemedelssubstanser (API).
Upptäck fördelarna med ultraljudsassisterad TAGGING-peptidsyntes!
kontinuerlig bearbetning undersöks som en ytterligare förbättring – Plattformar för kontinuerlig ”one-pot”-syntes med hjälp av silylerade taggar har beskrivits.
Området utvecklas i riktning mot principerna för grön kemi, där både ultraljud och TAPS bidrar till minskad användning av lösningsmedel, lägre reagensförbrukning och ökad hållbarhet.
Litteratur / Referenser
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från labb till industriell storlek.