Proteomiska arbetsflöden med proteinnedbrytning med hög provgenomströmning

Proteomik är ett centralt område för förståelsen av biologiska processer och system, och proteinnedbrytning utgör ett avgörande steg i dess arbetsflöden. Traditionellt utförs proteinnedbrytning i lösning med proteolytiska enzymer som trypsin, som specifikt hydrolyserar peptidbindningar vid lysin- och argininrester. Denna process genererar peptider som är väl lämpade för jonisering och fragmentering i masspektrometriska (MS) tillämpningar. Konventionella nedbrytningsmetoder kräver dock 12–24 timmar för att slutföras, vilket skapar betydande flaskhalsar i proteomiska arbetsflöden.
Ultraljudsbehandling erbjuder ett kraftfullt alternativ som dramatiskt förkortar nedbrytningstiderna från timmar till bara några minuter. I kombination med avancerade ultraljudsapparater för flera prover, såsom Hielscher CupHorn, VialTweeter och ultraljudsapparaten UIP400MTP för 96-brunnsplattor, möjliggör ultraljudsbehandling snabbare proteomik med hög provgenomströmning. Dessa tekniker effektiviserar arbetsflödena, minskar provberedningstiden och ökar effektiviteten utan att kompromissa med reproducerbarheten eller datakvaliteten.

Ultraljudsenergins roll vid proteinnedbrytning

Ultraljudsbehandling använder fokuserade ultraljudsvågor för att skapa kavitation – lokala mikrobubblor som kollapsar och genererar intensiva skjuvkrafter. Detta fenomen förbättrar massöverföringen, främjar blandningen av enzymer med substrat och vecklar ut proteinstrukturer, vilket exponerar klyvningsställen för proteolytiska enzymer som trypsin.
Resultatet? En betydande minskning av nedbrytningstiden utan att kompromissa med effektiviteten eller reproducerbarheten.

Ultraljudsförstärkt proteolytisk nedbrytning: metodik och resultat

Protokoll för snabbare nedbrytning

Ultraljudsassisterad nedbrytning kombinerar proteolytiska enzymer och ultraljudsenergi för att påskynda arbetsflöden. Vid användning av exempelvis Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) sker nedbrytningen enligt följande arbetsflöde:

1. Reduktion: Proteinprover (0,5 mg/mL, 20 µL) behandlas med DTT (2 µL, 110 mM) i ammoniumvätekarbonatbuffert (12,5 mM). Ultraljudsbehandling utförs vid 50% amplitud i 5 minuter.
2. Alkylering: Efter tillsats av IAA (2 µL, 400 mM) upprepas ultraljudsbehandlingen under samma förhållanden.
3. Nedbrytning: Proverna späds och inkuberas med nanopartiklar med immobiliserat trypsin. En sista omgång ultraljudsbehandling (5 minuter) slutför nedbrytningen. Peptiderna separeras, torkas och förvaras för MS-analys.

Denna ultraljudsmetod minskar den totala beredningstiden från 12 timmar till under 30 minuter. Trots den snabbare processen förblir peptidutbytet och kvaliteten jämförbara med traditionella metoder som pågår över natten.

Effektivitet vid proteinnedbrytning med ultraljud

I jämförande studier med E. coli-proteom:

• Proteinidentifiering: I ultraljudsbehandlade prover identifierades 777 proteiner på 5 minuter, jämfört med 817 på 12 timmar. Andelen gemensamma proteinidentifieringar översteg 70%.
• Reproducerbarhet: Upprepade analyser visade korrelationsvärden över 98% inom varje metod, vilket visar på tillförlitlighet.
• Selektivitet: Vissa proteiner bröts företrädesvis ned med respektive metod, där ultraljudsnedbrytning gynnade 65 proteiner och nedbrytning över natten 54 proteiner. Sådana nyansskillnader understryker ultraljudsbehandlingens unika potential för specifika tillämpningar.

Resultat från märkningsfri proteinkvantifiering av sju proteiner som tillsatts till ett E. coli-
prov. Följande proteiner tillsattes vid två olika nivåer enligt vad som anges i kolumnen
med namnet ”Theo Ratio”. Theo Ratio är det teoretiska förhållandet mellan de två nivåer som användes i detta
experiment. Bovint serumalbumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1-kasein (CASA1),
α-S2-kasein (CASA2), cytokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) och karbanhydras 2
(CAH2). Förhållandena beräknades med hjälp av LFQ-proteinintensiteter som erhölls från MaxQuant-
analys. Students t-test användes för att jämföra de värden som erhölls med respektive metod (p>0,01, n=3, t-teoretiskt=4,6).
Studie och grafik: © Martins et al., 2019)

Trypsin immobiliserat på nanopartiklar

Integreringen av nanopartiklar med immobiliserat trypsin (t.ex. T-FMNPs) med ultraljudsbehandling förbättrar proteomikens arbetsflöden ytterligare. Dessa nanopartiklar ger en stor yta för interaktioner mellan enzym och substrat, vilket ökar effektiviteten. När den kombinerade metoden tillämpas på komplexa proteom, såsom proteomet hos E. coli, uppnås följande:

• Snabbhet: Fullständig spjälkning inom 5 minuter.
• Noggrannhet: Proteinkvantifiering jämförbar med traditionella metoder (p > 0,01, n=3).
• Skalbarhet: Anpassning till flerbrunnsplattformar som UIP400MTP möjliggör bearbetning med hög provgenomströmning.

Klicka här för det detaljerade protokollet med stegvisa instruktioner!
(jfr Martins et al., 2019)

Proteolytisk spjälkning med hög hastighet och hög provgenomströmning med Hielschers ultraljudsapparater

De bästa ultraljudsmodellerna för proteomik

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika modeller av ultraljudsapparater för samtidig beredning av flera prover, vilket underlättar arbetsflöden med hög provgenomströmning. Oavsett om du arbetar med vialer, provrör, flerbrunnsplattor (t.ex. plattor med 6, 24 eller 96 brunnar) eller petriskålar – erbjuder vi de idealiska ultraljudsapparaterna för dina experiment.

UIP400MTP ultraljudsapparat för flerbrunnsplattor

För maximal provgenomströmning ger UIP400MTP möjlighet att behandla 96-brunnsplattor med ultraljud. UIP400MTP är kompatibel med alla standardmikroplattor, kräver inga dyra tillverkarspecifika engångsartiklar och ger dig friheten att välja den bästa flerbrunnsplattan för din forskning. Genom att tillföra jämn energi över hela plattan möjliggör den snabb reduktion, alkylering och spjälkning av upp till 200 komplexa proteom på bara 1 timme. Denna nivå av automatisering och effektivitet är avgörande för proteomik med hög provgenomströmning och kliniska tillämpningar. Läs mer om ultraljudsapparaten för flerbrunnsplattor!

VialTweeter

VialTweeter är anpassad för laboratorier som behöver ultraljudsbehandla upp till 10 vialer eller provrör samtidigt. Dess icke-invasiva metod eliminerar risken för korskontaminering och säkerställer samtidigt reproducerbar proteinspjälkning. Denna apparat är idealisk för forskare som arbetar med begränsade provvolymer eller varierande provtyper.
Läs mer om VialTweeter, ultraljudsapparaten för flera provrör!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ultraljudsapparaten CupHorn är en kraftfull apparat utformad för samtidig bearbetning av flera prover i förslutna behållare. Den säkerställer jämn fördelning av ultraljudsenergin och exakt temperaturkontroll. Möjligheten att bearbeta upp till fem prover samtidigt, i kombination med dess kompatibilitet med arbetsflöden som omfattar reduktion, alkylering och spjälkning, gör CupHorn till ett tillförlitligt verktyg för MS-baserad proteomik.
Läs mer om CupHorn SonoReactor!

Stegvis protokoll för ultraljudsassisterad proteolytisk spjälkning med nanopartikelimmobiliserat trypsin

Detta protokoll av Martins et al. (2019) är optimerat för snabb proteinspjälkning med ultraljudsenergi och nanopartikelimmobiliserat trypsin (T-FMNPs). De beskrivna stegen säkerställer effektiv reduktion, alkylering och proteolys som lämpar sig för tillämpningar inom masspektrometri (MS).
Protokollets steg

1. Reduktion av disulfidbindningar
   • Tillsätt 2 µL DTT-lösning (110 mM) till proteinprovet på 20 µL (0,5 mg/mL) i AmBic-buffert.
   • Placera provröret i sonoreaktorn UP200St-CupHorn.
   • Ultraljudsbehandla provet i 2,5 minuter vid 50% amplitud (200 W, 26 kHz).
   • Gör ett kort uppehåll för att låta provet svalna och ultraljudsbehandla sedan i ytterligare 2,5 minuter under samma förhållanden.
2. Alkylering av reducerade cysteinrester
   • Tillsätt 2 µL IAA-lösning (400 mM) till det reducerade proteinprovet.
   • Ultraljudsbehandla i 2,5 minuter vid 50% amplitud för att underlätta alkyleringen.
   • Gör ett uppehåll för kylning och ultraljudsbehandla sedan i ytterligare 2,5 minuter.

   Obs: Minimera det alkylerade provets exponering för ljus för att förhindra nedbrytning av IAA.

3. Spädning av provet
   • Späd det alkylerade proteinprovet till en slutvolym på 100 µL med 25 mM AmBic-buffert som innehåller 4% acetonitril (v/v).
   • Blanda noggrant genom försiktig pipettering.
4. Proteolytisk spjälkning med nanopartikelimmobiliserat trypsin
   • Tillsätt 20 µL T-FMNP-lösning (3 mg/mL) till det spädda proteinprovet.
   • Ultraljudsbehandla blandningen i sonoreaktorn i 2,5 minuter vid 50% amplitud.
   • Gör en paus för kylning och ultraljudsbehandla sedan i ytterligare 2,5 minuter under samma förhållanden.
5. Separation av trypsinnanopartiklar
   • Använd en magnet för att separera T-FMNP:erna från supernatanten som innehåller spjälkade peptider.
   • Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
6. Beredning av peptider för MS-analys
   • Torka supernatanten som innehåller peptider i en vakuumcentrifug.
   • Förvara de torkade peptiderna vid -20°C fram till vidare analys med masspektrometri.