Proteomiska arbetsflöden med proteinnedbrytning med hög genomströmning

Proteomik är ett viktigt område för att förstå biologiska processer och system, med proteinnedbrytning som ett kritiskt steg i dess arbetsflöden. Traditionellt utförs proteinnedbrytning i lösning med hjälp av proteolytiska enzymer som trypsin, som specifikt hydrolyserar peptidbindningar vid lysin- och argininrester. Denna process genererar peptider som är väl lämpade för jonisering och fragmentering i masspektrometri (MS) applikationer. Konventionella nedbrytningsmetoder kräver dock 12–24 timmar för att slutföras, vilket skapar betydande flaskhalsar i proteomiska arbetsflöden.
Ultraljud erbjuder ett kraftfullt alternativ, dramatiskt förkorta matsmältningstiderna från timmar till bara några minuter. I kombination med avancerade multi-prov sonikatorer såsom Hielscher CupHorn, VialTweeter, och 96-brunns platta sonikator UIP400MTP, möjliggör ultraljud accelererad, high-throughput proteomik. Dessa tekniker effektiviserar arbetsflöden, minskar provförberedelsetiden och ökar effektiviteten utan att kompromissa med reproducerbarhet eller datakvalitet.

Rollen av ultraljud energi i proteinsmältning

Ultraljud använder fokuserade ultraljudsvågor för att skapa kavitation - lokaliserade mikrobubblor som kollapsar för att generera intensiva skjuvkrafter. Detta fenomen förbättrar massöverföringen, främjar blandningen av enzymer med substrat och utvecklar proteinstrukturer, vilket exponerar klyvningsställen för proteolytiska enzymer som trypsin.
Resultatet? En betydande minskning av matsmältningstiden utan att kompromissa med effektivitet eller reproducerbarhet.

Ultraljudsförstärkt proteolytisk nedbrytning: Metodik och resultat

Protokoll för accelererad nedbrytning

Ultraljudsassisterad matsmältning kombinerar proteolytiska enzymer och ultraljudsenergi för att påskynda arbetsflödena. Till exempel, med hjälp av Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), fortsätter nedbrytningsarbetsflödet enligt följande:

1. Reduktion: Proteinprover (0,5 mg/ml, 20 μL) behandlas med DTT (2 μL, 110 mM) i ammoniumbikarbonatbuffert (12,5 mM). Ultraljudsbehandling tillämpas vid 50% amplitud i 5 minuter.
2. Alkylering: Efter tillsats av IAA (2 μL, 400 mM) upprepas ultraljudsbehandling under samma förhållanden.
3. Digestion: Proverna späds ut och inkuberas med immobiliserade trypsinnanopartiklar. En sista omgång ultraljudsbehandling (5 minuter) slutför matsmältningen. Peptider separeras, torkas och lagras för MS-analys.

Denna ultraljudsmetod minskar den totala förberedelsetiden från 12 timmar till under 30 minuter. Trots den accelererade processen förblir peptidutbytet och kvaliteten konsekvent med traditionella metoder över natten.

Effektiviteten av ultraljud protein digestion

I jämförande studier med E. coli-proteom:

• Identifiering av proteiner: Ultraljudssmälta prover identifierade 777 proteiner på 5 minuter, jämfört med 817 på 12 timmar. Gemensamma proteinidentifieringar översteg 70 %.
• Reproducerbarhet: Replikatanalyser visade korrelationsvärden över 98 % inom varje metod, vilket visar på tillförlitlighet.
• Selektivitet: Vissa proteiner smältes företrädesvis med varje metod, med ultraljudsnedbrytning som gynnade 65 proteiner och matsmältning över natten 54 proteiner. Sådana nyanserade skillnader understryker den unika potentialen för ultraljud för specifika tillämpningar.

Märkningsfri proteinkvantifiering av sju spikade proteiner till en E. coli
prov. Följande proteiner tillsattes på två olika nivåer som anges i kolumnen
benämnd som "Theo Ratio". Theo Ratio är det teoretiska förhållandet mellan de två nivåer som används i denna
experiment. Bovint serumalbumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1-kasein (CASA1),
α-S2-kasein (CASA2), cytokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) och karbanhydras 2
(CAH2). Förhållandena beräknades med hjälp av LFQ-proteinintensiteter erhållna från MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studie och grafik: © Martins et al., 2019)

Nanopartikel-immobiliserad trypsin

Integrationen av immobiliserade trypsinnanopartiklar (t.ex. T-FMNP) med ultraljud förbättrar proteomikarbetsflödena ytterligare. Dessa nanopartiklar ger en hög yta för enzym-substratinteraktioner, vilket ökar effektiviteten. När den tillämpas på komplexa proteom, såsom E. coli, uppnår den kombinerade metoden:

• Hastighet: Fullständig nedbrytning inom 5 minuter.
• Noggrannhet: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalbarhet: Anpassning till plattformar med flera brunnar som UIP400MTP möjliggör bearbetning med hög genomströmning.

Klicka här för ett detaljerat protokoll med steg-för-steg-instruktioner!
(jfr Martins et al., 2019)

Proteolytisk nedbrytning med hög hastighet och hög genomströmning med Hielscher sonikatorer

De bästa sonikatormodellerna för proteomik

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika sonikatormodeller för samtidig förberedelse av flera prover, vilket underlättar arbetsflöden med hög genomströmning. Oavsett om du arbetar med ampuller, provrör, plattor med flera brunnar (t.ex. tallrikar med 6, 24, 96 hål) eller petriskålar – Vi erbjuder dig de perfekta ultraljudsapparaterna för dina experiment.

UIP400MTP ultraljudsbehandling med flera brunnar

För ultimat genomströmning ger UIP400MTP möjlighet att bearbeta 96-brunnars plattor ultraljud. Den UIP400MTP är kompatibel med alla vanliga mikroplattor och kräver inga dyra proprietära engångsartiklar och ger dig friheten att välja den bästa multibrunnsplattan för din forskning. Genom att leverera enhetlig energi över plattan möjliggör den snabb reduktion, alkylering och nedbrytning av upp till 200 komplexa proteom på bara 1 timme. Denna nivå av automatisering och effektivitet är avgörande för proteomik med hög genomströmning och kliniska tillämpningar. Lär dig mer om ultraljudsbehandlingen med flera brunnar!

VialTweeter

VialTweeter är skräddarsydd för laboratorier som kräver samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaskor eller provrör. Dess icke-invasiva tillvägagångssätt eliminerar risken för korskontaminering samtidigt som den säkerställer reproducerbar proteinnedbrytning. Denna enhet är idealisk för forskare som arbetar med begränsade provvolymer eller olika provtyper.
Lär dig mer om VialTweeter multi-tube ultraljudssonik!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonicator är en kraftfull enhet som är utformad för samtidig bearbetning av flera prover i förseglade behållare. Det säkerställer enhetlig ultraljudsenergifördelning och exakt temperaturkontroll. Förmågan att bearbeta upp till fem prover samtidigt, tillsammans med dess kompatibilitet med reducerade, alkylerade och smälta arbetsflöden, gör CupHorn till ett pålitligt verktyg för MS-baserad proteomik.
Lär dig mer om CupHorn SonoReactor!

Steg-för-steg-protokoll för ultraljud-assisterad proteolytisk matsmältning med hjälp av nanopartikel-immobiliserad trypsin

Detta protokoll av Martins et al. (2019) är optimerat för snabb proteinnedbrytning med hjälp av ultraljudsenergi och nanopartikelimmobiliserat trypsin (T-FMNP). De beskrivna stegen säkerställer effektiv reduktion, alkylering och proteolys som är lämplig för masspektrometri (MS) tillämpningar.
Steg för protokoll

1. Minskning av disulfidbindningar
   • Tillsätt 2 μL DTT-lösning (110 mM) till 20 μL proteinprovet (0,5 mg/ml) i AmBic-buffert.
   • Placera provröret i sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Ultraljudsbehandla provet i 2,5 minuter vid 50% amplitud (200 W, 26 kHz).
   • Pausa för ett kort intervall för att tillåta kylning och sonikera sedan i ytterligare 2,5 minuter under samma förhållanden.
2. Alkylering av reducerade cysteinrester
   • Tillsätt 2 μL IAA-lösning (400 mM) till det reducerade proteinprovet.
   • Sonicate i 2,5 minuter vid 50% amplitud för att underlätta alkylering.
   • Pausa för kylning och sonikera sedan i ytterligare 2,5 minuter.

   Notera: Minimera exponeringen av det alkylerade provet för ljus för att förhindra IAA-nedbrytning.

3. Prov Utspädning
   • Späd det alkylerade proteinprovet till en slutlig volym på 100 μL med användning av 25 mM AmBic-buffert innehållande 4 % acetonitril (v/v).
   • Blanda ordentligt genom att pipettera försiktigt.
4. Proteolytisk nedbrytning med nanopartikelimmobiliserat trypsin
   • Tillsätt 20 μl T-FMNP-lösning (3 mg/ml) till det utspädda proteinprovet.
   • Ultraljudsbehandla blandningen i sonoreactor i 2,5 minuter vid 50% amplitud.
   • Pausa för kylning och sonikera sedan i ytterligare 2,5 minuter under samma förhållanden.
5. Separering av trypsinnanopartiklar
   • Använd en magnet för att separera T-FMNP:erna från supernatanten som innehåller nedbrutna peptider.
   • Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
6. Peptidpreparat för MS-analys
   • Torka supernatanten som innehåller peptider i en vakuumcentrifug.
   • Förvara de torkade peptiderna vid -20 °C tills vidare analys med masspektrometri.