Ultraljud Filter-Aided Sample Preparation (FASP): Förbättra Proteomics arbetsflöden med avancerad ultraljudsbehandling
Ultraljudsfilterstödd provberedning (FASP) framträder som en mycket effektiv och reproducerbar metod i modern proteomik. Genom att integrera kontrollerad ultraljudsbehandling i etablerade FASP-arbetsflöden kan forskare avsevärt förbättra proteinextraktion, nedbrytningseffektivitet och övergripande datakvalitet. I takt med den ökande efterfrågan på reproducerbar provberedning med hög genomströmning får fokuserade sonikatorer som mikroplattesonikatorn UIP400MTP allt större vetenskaplig och praktisk betydelse.
Vetenskaplig kontext: Varför FASP är viktigt inom proteomik
Filterstödd provberedning (FASP) har blivit en guldstandard inom bottom-up proteomik tack vare dess förmåga att avlägsna detergenter, salter och andra föroreningar samtidigt som den möjliggör effektiv enzymatisk nedbrytning. Klassiska FASP-protokoll möter dock ofta begränsningar relaterade till ofullständig lys, inkonsekvent nedbrytning och provvariabilitet – särskilt när det handlar om komplexa eller elastiska biologiska celler eller vävnader.
Det är här som fokuserad ultraljudsenergi (sonikering) ger en avgörande fördel. Genom att införa mekaniska skjuvkrafter och kavitation förbättrar sonikering flera kritiska steg i FASP-arbetsflödet utan att kompromissa med proteinintegriteten.
Ultraljudsbehandling med flera brunnar för plattor UIP400MTP underlättar filterstödd provberedning (FASP)
De positiva effekterna av ultraljudsbehandling i Ultrasonic FASP
Sonikering introducerar kontrollerad akustisk kavitation – mikroskopisk bubbelbildning och kollaps – vilket ger upphov till lokala skjuvkrafter och mikroströmning.
Sonikering förbättrar både alkylerings- och nedbrytningsstegen i ultraljuds-FASP genom att förbättra massöverföringen och påskynda reaktionskinetiken. Appliceringen av ultraljudsenergi genererar kavitation, vilket leder till lokal mikroströmning och transienta skjuvkrafter som främjar snabb blandning och effektiv penetration av reagenser i proteinmatrisen eller filtermiljön. Under alkylering resulterar detta i mer enhetlig och snabbare modifiering av cysteinrester med jodacetamid. I matsmältningssteget ökar ultraljudsbehandlingen tillgängligheten av proteolytiska klyvningsställen och förbättrar enzym-substratinteraktioner, vilket påskyndar trypsinaktiviteten och förbättrar matsmältningseffektiviteten. Sammantaget minskar ultraljudsbehandlingen behandlingstiden samtidigt som reaktionsfullständigheten och reproducerbarheten bibehålls eller förbättras.
Vid provberedning för proteomik översätts FASP med ultraljud till:
- Effektivare celldelning och proteinextraktion, även i svåra vävnader eller mikrobiella prover
- Förbättrad solubilisering av proteiner
- Förbättrad enzymtillgänglighet under matsmältningen
- Minskad bearbetningstid och ökad reproducerbarhet
Till skillnad från konventionella mekaniska eller kemiska lyseringsmetoder är ultraljudsbehandling mycket kontrollerbar och skalbar, vilket gör den särskilt lämplig för standardiserade arbetsflöden för proteomik.
Den UIP400MTP är inte ett ultraljudsbad. Det är en högintensiv kopp horn för fokuserad ultraljudsbehandling. Denna kraftfulla beröringsfria sonikator ger en enhetlig ultraljudsbehandling över alla brunnar på din vanliga brunnsplatta. Du har exakt kontroll över amplitud, effekt och pulsering. En inbyggd timer och temperatursond säkerställer konsekventa resultat. Den UIP400MTP plattan ultraljudsbehandling kyler prover med vattenbad (extern kylare som tillval).
Fördelar med FASP med ultraljud jämfört med konventionella metoder
Integreringen av ultraljudsbehandling i FASP-protokollen ger mätbara fördelar som direkt påverkar resultaten av masspektrometri i efterföljande led.
Ultrasonic FASP möjliggör mer fullständig proteinåtervinning, särskilt från utmanande prover som fibrösa vävnader eller biofilmer. Den enhetliga energidistributionen säkerställer konsekvent behandling över replikat, vilket minskar variabiliteten – ett viktigt krav för kvantitativ proteomik.
Dessutom påskyndar ultraljudsbehandling nedbrytningskinetiken genom att förbättra interaktionen mellan enzym och substrat. Detta resulterar ofta i kortare digestionstider och högre peptidutbyte, samtidigt som sekvenstäckningen bibehålls.
Ur ett arbetsflödesperspektiv minskar ultraljudssystem manuella ingrepp och eliminerar behovet av aggressiva kemiska behandlingar, vilket bevarar provets integritet och förenklar protokollstandardisering.
Venndiagram som visar det ökade antalet identifierade proteiner med Ultrasonic FASP jämfört med Over-Night FASP
Bild och studie: ©Carvalho et al., 2020
Sonikator för plattor med flera brunnar UIP400MTP för filterstödd provberedning (FASP)
Protokoll: Ultrasonic FASP med hög genomströmning med UIP400MTP
För laboratorier som bearbetar stora provkohorter möjliggör mikroplattesonikatorn UIP400MTP samtidig sonikering av standardplattor med flera brunnar (t.ex. 96-brunnsplattor), vilket avsevärt ökar genomströmningen och reproducerbarheten.
I detta format bereds prover (vanligtvis 50-200 µL per brunn) direkt i mikroplattor som är kompatibla med ultrafiltrering eller nedströmsbearbetning. Lysisbuffertarna liknar dem som används i standardprotokollen för FASP.
UIP400MTP applicerar enhetlig ultraljudsenergi över alla brunnar. Sonikering utförs vanligtvis vid 60-80% amplitud under 2-4 minuter, beroende på provtyp. Övervaka temperaturen med hjälp av den pluggbara temperatursensorn. Använd pulsad ultraljudsbehandling och eventuellt till en labbkylare.
Exempel på protokoll:
- För alkyleringssteget ultraljudsbehandlas proverna med ultraljudsbehandlaren för mikroplattor (UIP400MTP) vid 40 % amplitud i 7 cykler (30 s PÅ, 15 s AV; total ultraljudsbehandlingstid: 5 min 45 s).
- Efter sonikering avlägsnas jodoacetamidlösningen (IAA) genom centrifugering. Före nedbrytning med trypsin måste proverna tvättas för att avlägsna rester av urea, ett starkt kaotropiskt medel som hämmar enzymatisk aktivitet. Därför tvättas proverna två gånger med 200 μL 25 mM ammoniumbikarbonat (AmBic).
- Därefter tillsätts 100 μL trypsinlösning (1:30 enzym-till-protein-förhållande) beredd i 12,5 mM ammoniumbikarbonat. Proteinuppslutningen utförs sedan med UIP400MTP under samma sonikeringsförhållanden (40 % amplitud, 7 cykler, 30 s PÅ / 15 s AV; total tid: 5 min 45 s).
- Efter sonikering överförs proverna till filterplattor eller bearbetas med plattbaserade FASP-system. Reduktions- och alkyleringsstegen utförs i plattan, vilket ger ett strömlinjeformat arbetsflöde.
- Trypsinsmältning utförs under kontrollerade förhållanden (t.ex. 37°C, 4-16 timmar), med möjlighet till kort ultraljudsstimulering för att påskynda enzymatisk aktivitet och förbättra peptidutbytet.
- Peptiderna återvinns genom centrifugering och är klara för LC-MS/MS-analys.
Den största fördelen med detta system är dess förmåga att leverera identiska bearbetningsförhållanden i alla brunnar, vilket minimerar batcheffekter och möjliggör robusta kvantitativa jämförelser i storskaliga proteomikstudier.
VialTweeter Sonicator med flera rör påskyndar och förbättrar filterstödd provberedning (FASP) inom proteomik
Vetenskaplig relevans
Integrationen av ultraljudsbehandling i FASP-arbetsflöden är inte bara en teknisk finess – representerar det ett metodologiskt framsteg inom proteomikprovberedning. När fältet rör sig mot högre genomströmning, automatisering och reproducerbarhet, hanterar ultraljudsteknologier grundläggande flaskhalsar i provbearbetningen.
Nya studier belyser alltmer vikten av konsekvent provberedning för tillförlitlig biomarkör upptäckt och kvantitativ proteomik. Ultraljud FASP bidrar direkt till detta mål genom att förbättra extraktionseffektivitet, matsmältning konsistens, och övergripande arbetsflöde robusthet.
Dessutom är skalbarheten hos ultraljudssystem – från enskilda flaskor med VialTweeter till hela mikroplattor med UIP400MTP – är i linje med den växande efterfrågan på både explorativa och stora proteomikstudier.
Skaffa en Sonicator för att underlätta ditt FASP-arbetsflöde!
Ultraljudsfilterstödd provberedning kombinerar de beprövade styrkorna hos FASP med de fysiska fördelarna med ultraljudsbehandling. Genom att förbättra lysis, förbättra matsmältningen och standardisera arbetsflöden erbjuder ultraljudssystem en kraftfull lösning för modern proteomik.
Multi-Tube Sonicator VialTweeter och Microplate Sonicator UIP400MTP exemplifierar hur fokuserad ultraljudsenergi kan omvandla rutinmässig provberedning till en mer effektiv, reproducerbar och vetenskapligt robust process – vilket i slutändan leder till proteomiska data av högre kvalitet och djupare biologiska insikter.
Välj den mest lämpliga sonatorn för din filterstödda provberedning
| Sonicator modell | Förmåner för FASP | Bästa användning |
| UIP400MTP ultraplatta ultraljudsapparat | Enhetlig ultraljudsbehandling över hela mikroplattor; mycket reproducerbar energitillförsel; påskyndar alkylering och enzymatisk nedbrytning i arbetsflöden med hög genomströmning; kompatibel med automatiserad provberedning. | FASP-arbetsflöden med hög genomströmning i 96-brunnar eller liknande plattformat, inklusive screeningapplikationer för proteomik. |
| VialTweeter Multi-Tube Ultraljudsapparat | Samtidig, enhetlig ultraljudsbehandling av flera slutna rör; minimerar korskontaminering och provförlust; förbättrar reagenspenetration och blandning, vilket förbättrar alkylerings- och digestionseffektiviteten. | Parallell bearbetning av flera FASP-prover med måttlig genomströmning och hög reproducerbarhet. |
| Kopparhorn (indirekt ultraljudsbehandling “högintensivt bad” för förseglade rör) | Högintensiv indirekt ultraljudsbehandling för slutna kärl; utmärkt temperaturkontroll och kontaminationsfri bearbetning; främjar effektiv massöverföring utan direkt sondkontakt. | Bearbetning av prov i olika provbehållare / känsliga eller farliga prov som kräver slutna behållare och konsekvent energidistribution. |
| Sonicatorer av sondtyp för labb (direkt ultraljudsbehandling) | Maximal ultraljudsintensitet och energiöverföring; snabb sönderdelning och reaktionsacceleration; effektiv för svårsmälta eller mycket komplexa proteinprover. | Bearbetning av enstaka prover, större prover eller utmanande matriser där maximal kraft och hastighet krävs. |
Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.
Vanliga frågor och svar
Vad används filterassisterad provberedning till?
Filter-Aided Sample Preparation (FASP) används för beredning av proteinprover för masspektrometribaserad proteomisk analys. Den möjliggör effektiv borttagning av detergenter, salter och andra föroreningar med låg molekylvikt samtidigt som proteinerna hålls kvar på ett filter med molekylviktsgräns, där de kan denatureras, reduceras, alkyleras och enzymatiskt brytas ned till peptider som är lämpliga för LC-MS/MS-analys.
Vilka är fördelarna med FASP inom proteomik?
De främsta fördelarna med FASP inom proteomik är dess förmåga att hantera komplexa och detergentrika prover och samtidigt producera mycket rena peptidblandningar som är kompatibla med masspektrometri. Den förbättrar digestionseffektiviteten och reproducerbarheten genom att utföra reaktioner i en begränsad filtermiljö, minskar provförlusten jämfört med utfällningsbaserade metoder och möjliggör effektivt buffertbyte. Sammantaget förbättrar FASP peptidåtervinning, datakvalitet och proteomtäckning, vilket gör det till ett robust och allmänt antaget arbetsflöde inom bottom-up proteomik.
Litteratur / Referenser
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Den beröringsfria sonikatorn UIP400MTP underlättar FASP i 96-brunnsplattor
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från labb till industriell storlek.