Ultraljudsassisterad filterstödd provberedning (FASP): Förbättrade proteomiska arbetsflöden med avancerad sonikering
Ultraljudsassisterad filterstödd provberedning (FASP) håller på att etableras som en mycket effektiv och reproducerbar metod inom modern proteomik. Genom att integrera kontrollerad sonikering i etablerade FASP-arbetsflöden kan forskare avsevärt förbättra proteinextraktionen, spjälkningseffektiviteten och den övergripande datakvaliteten. Med en ökande efterfrågan på reproducerbar provberedning med hög provgenomströmning får fokuserade sonikatorer som mikroplattesonikatorn UIP400MTP allt större vetenskaplig och praktisk relevans.
Vetenskapligt sammanhang: Varför FASP är viktigt inom proteomik
Filterstödd provberedning (FASP) har blivit en guldstandard inom bottom-up-proteomik tack vare sin förmåga att avlägsna detergenter, salter och andra föroreningar samtidigt som den möjliggör effektiv enzymatisk spjälkning. Klassiska FASP-protokoll har dock ofta begränsningar kopplade till ofullständig lys, ojämn spjälkning och variation mellan prover – särskilt vid hantering av komplexa eller motståndskraftiga biologiska celler eller vävnader.
Här ger fokuserad ultraljudsenergi (sonikering) en avgörande fördel. Genom att tillföra mekaniska skjuvkrafter och kavitation förbättrar sonikering flera kritiska steg i FASP-arbetsflödet utan att äventyra proteinernas integritet.
Sonikatorn UIP400MTP för flerbrunnsplattor underlättar filterstödd provberedning (FASP)
Sonikeringens positiva effekter vid ultraljudsassisterad FASP
Sonikering ger upphov till kontrollerad akustisk kavitation – bildning och kollaps av mikroskopiska bubblor – som genererar lokala skjuvkrafter och mikroströmningar.
Sonikering förbättrar både alkylerings- och spjälkningsstegen vid ultraljudsassisterad FASP genom att förbättra massöverföringen och påskynda reaktionskinetiken. Tillförseln av ultraljudsenergi genererar kavitation, vilket leder till lokala mikroströmningar och övergående skjuvkrafter som främjar snabb blandning och effektiv inträngning av reagenser i proteinmatrisen eller filtermiljön. Under alkyleringen leder detta till en jämnare och snabbare modifiering av cysteinrester med jodacetamid. I spjälkningssteget ökar sonikering tillgängligheten till proteolytiska klyvningsställen och förbättrar enzym–substratinteraktionerna, vilket påskyndar trypsinets aktivitet och förbättrar spjälkningseffektiviteten. Sammantaget minskar ultraljudsbehandling bearbetningstiden samtidigt som reaktionernas fullständighet och reproducerbarhet bibehålls eller förbättras.
Vid provberedning inom proteomik innebär ultraljudsassisterad FASP:
- Effektivare cellupplösning och proteinextraktion, även i svårbearbetade vävnader eller mikrobiella prover
- Förbättrad solubilisering av proteiner
- Förbättrad tillgänglighet för enzymer under spjälkningen
- Kortare bearbetningstid och ökad reproducerbarhet
Till skillnad från konventionella mekaniska eller kemiska lysmetoder är ultraljudsbearbetning mycket kontrollerbar och skalbar, vilket gör den särskilt lämplig för standardiserade arbetsflöden inom proteomik.
Fördelar med ultraljudsassisterad FASP jämfört med konventionella metoder
Integreringen av sonikering i FASP-protokoll ger mätbara fördelar som direkt påverkar resultaten från efterföljande masspektrometri.
Ultraljudsassisterad FASP möjliggör mer fullständig återvinning av proteiner, särskilt från svårbearbetade prover som fibrösa vävnader eller biofilmer. Den jämna energifördelningen säkerställer enhetlig behandling av replikat och minskar därmed variationen – ett grundläggande krav inom kvantitativ proteomik.
Dessutom påskyndar sonikering spjälkningskinetiken genom att förbättra enzym–substratinteraktionen. Detta leder ofta till kortare spjälkningstider och högre peptidutbyte, samtidigt som sekvenstäckningen bibehålls.
Ur ett arbetsflödesperspektiv minskar ultraljudssystem behovet av manuella ingrepp och eliminerar behovet av aggressiva kemiska behandlingar, vilket bevarar provets integritet och förenklar standardiseringen av protokoll.
Venndiagram som visar det ökade antalet identifierade proteiner med ultraljudsassisterad FASP jämfört med FASP över natten
Bild och studie: ©Carvalho et al., 2020
Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor för filterassisterad provberedning (FASP)
Protokoll: Ultraljudsassisterad FASP med hög provgenomströmning med UIP400MTP
För laboratorier som bearbetar stora provkohorter möjliggör ultraljudsapparaten UIP400MTP för mikroplattor samtidig ultraljudsbehandling av flerbrunnsplattor av standardtyp (t.ex. 96-brunnsplattor), vilket avsevärt ökar provgenomströmningen och reproducerbarheten.
I detta format bereds prover (vanligtvis 50–200 µL per brunn) direkt i mikroplattor som är kompatibla med ultrafiltrering eller efterföljande bearbetning. Lysbuffertarna liknar dem som används i standardprotokoll för FASP.
UIP400MTP tillför jämn ultraljudsenergi till alla brunnar. Ultraljudsbehandlingen utförs vanligtvis vid 60–80% amplitud i 2–4 minuter, beroende på provtyp. Övervaka temperaturen med den anslutningsbara temperatursensorn. Använd pulserad ultraljudsbehandling och eventuellt en laboratoriekylare.
Exempel på protokoll:
- Under alkyleringssteget ultraljudsbehandlas proverna med ultraljudsapparaten för mikroplattor (UIP400MTP) vid 40% amplitud under 7 cykler (30 s PÅ, 15 s AV; total ultraljudsbehandlingstid: 5 min 45 s).
- Efter ultraljudsbehandlingen avlägsnas jodacetamidlösningen (IAA) genom centrifugering. Före trypsinnedbrytningen måste proverna tvättas för att avlägsna kvarvarande urea, ett starkt kaotropt ämne som hämmar enzymaktiviteten. Därför tvättas proverna två gånger med 200 μL 25 mM ammoniumvätekarbonat (AmBic).
- Därefter tillsätts 100 μL trypsinlösning (enzym–protein-förhållande 1:30) beredd i 12,5 mM ammoniumvätekarbonat. Proteinnedbrytningen utförs sedan med UIP400MTP under samma ultraljudsbehandlingsförhållanden (40% amplitud, 7 cykler, 30 s PÅ / 15 s AV; total tid: 5 min 45 s).
- Efter ultraljudsbehandlingen överförs proverna till filterplattor eller bearbetas med plattbaserade FASP-system. Reduktions- och alkyleringsstegen utförs i plattan, vilket bibehåller ett effektivt arbetsflöde.
- Trypsinnedbrytningen utförs under kontrollerade förhållanden (t.ex. 37°C, 4–16 timmar), med möjlighet till kortvarig ultraljudsstimulering för att påskynda enzymaktiviteten och förbättra peptidutbytet.
- Peptiderna utvinns genom centrifugering och är redo för LC-MS/MS-analys.
Den främsta fördelen med detta system är dess förmåga att ge identiska bearbetningsförhållanden i alla brunnar, vilket minimerar batcheffekter och möjliggör robusta kvantitativa jämförelser i storskaliga proteomikstudier.
Ultraljudsapparaten VialTweeter för flera provrör påskyndar och förbättrar filterassisterad provberedning (FASP) inom proteomik
Vetenskaplig relevans
Integreringen av ultraljudsbehandling i FASP-arbetsflöden är inte enbart en teknisk förbättring – den utgör ett metodologiskt framsteg inom provberedning för proteomik. När området utvecklas mot högre provgenomströmning, automatisering och reproducerbarhet bidrar ultraljudstekniker till att lösa grundläggande flaskhalsar i provbearbetningen.
Nya studier framhåller i allt högre grad vikten av enhetlig provberedning för tillförlitlig identifiering av biomarkörer och kvantitativ proteomik. Ultraljudsassisterad FASP bidrar direkt till detta mål genom att förbättra extraktionseffektiviteten, nedbrytningens jämnhet och arbetsflödets övergripande robusthet.
Dessutom motsvarar ultraljudssystemens skalbarhet – från enskilda provflaskor med VialTweeter till hela mikroplattor med UIP400MTP – den växande efterfrågan på både explorativa proteomikstudier och proteomikstudier med stora kohorter.
Skaffa en ultraljudsapparat som underlättar ditt FASP-arbetsflöde!
Ultraljudsassisterad filterassisterad provberedning kombinerar de beprövade styrkorna hos FASP med ultraljudsbehandlingens fysikaliska fördelar. Genom att förbättra lys och nedbrytning samt standardisera arbetsflöden erbjuder ultraljudssystem en kraftfull lösning för modern proteomik.
Ultraljudsapparaten VialTweeter för flera provrör och ultraljudsapparaten UIP400MTP för mikroplattor visar hur fokuserad ultraljudsenergi kan omvandla rutinmässig provberedning till en effektivare, mer reproducerbar och vetenskapligt robustare process – vilket i slutändan leder till proteomikdata av högre kvalitet och djupare biologiska insikter.
Välj den lämpligaste ultraljudsbehandlaren för din filterassisterade provberedning
| Modell av ultraljudsbehandlare | Fördelar för FASP | Lämpligaste användning |
| UIP400MTP ultraljudsbehandlare för mikroplattor | Jämn ultraljudsbehandling över hela mikroplattor; mycket reproducerbar energitillförsel; påskyndar alkylering och enzymatisk digerering i arbetsflöden med hög provgenomströmning; kompatibel med automatiserad provberedning. | FASP-arbetsflöden med hög provgenomströmning i plattformat med 96 brunnar eller liknande, inklusive screeningtillämpningar inom proteomik. |
| VialTweeter ultraljudsbehandlare för flera provrör | Samtidig, jämn ultraljudsbehandling av flera slutna provrör; minimerar korskontaminering och provförlust; förbättrar reagensens inträngning och blandningen, vilket förbättrar effektiviteten vid alkylering och digerering. | Parallell bearbetning av flera FASP-prover med måttlig provgenomströmning och hög reproducerbarhet. |
| CupHorn (indirekt ultraljudsbehandling i ett ”högintensivt bad” för förslutna provrör) | Högintensiv indirekt ultraljudsbehandling för förslutna kärl; utmärkt temperaturkontroll och kontamineringsfri bearbetning; främjar effektiv massöverföring utan direkt kontakt med sonden. | Bearbetning av prov i olika provbehållare / känsliga eller farliga prover som kräver slutna behållare och jämn energifördelning. |
| Ultraljudsbehandlare av sondtyp för laboratorier (direkt ultraljudsbehandling) | Maximal ultraljudsintensitet och energiöverföring; snabb sönderdelning och accelererade reaktioner; effektiv för svårdigererade eller mycket komplexa proteinprover. | Bearbetning av enskilda prover, större prover eller krävande matriser där maximal effekt och hastighet krävs. |
Konstruktion, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielschers ultraljudsbehandlare är välkända för sina högsta kvalitets- och konstruktionsstandarder. Robusthet och enkel användning möjliggör smidig integrering av våra ultraljudsbehandlare i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsbehandlare klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsbehandlare med den senaste tekniken och hög användarvänlighet. Hielschers ultraljudsbehandlare uppfyller naturligtvis CE-kraven och kraven enligt UL, CSA och RoHs.
Vanliga frågor
Vad används filterassisterad provberedning till?
Filterassisterad provberedning (FASP) används för beredning av proteinprover för masspektrometribaserad proteomikanalys. Metoden möjliggör effektiv avlägsning av detergenter, salter och andra föroreningar med låg molekylvikt samtidigt som proteinerna hålls kvar på ett filter med en molekylviktsgräns, där de kan denatureras, reduceras, alkyleras och digereras enzymatiskt till peptider som är lämpliga för LC–MS/MS-analys.
Vilka är fördelarna med FASP inom proteomik?
De främsta fördelarna med FASP inom proteomik är metodens förmåga att hantera komplexa och detergentrika prover samtidigt som den ger mycket rena peptidblandningar som är kompatibla med masspektrometri. Metoden förbättrar digereringens effektivitet och reproducerbarhet genom att reaktionerna utförs i en avgränsad filtermiljö, minskar provförlusten jämfört med utfällningsbaserade metoder och möjliggör effektivt buffertbyte. Sammantaget förbättrar FASP peptidutbytet, datakvaliteten och proteomtäckningen, vilket gör det till ett robust och allmänt använt arbetsflöde inom bottom-up-proteomik.
Litteratur / referenser
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Den kontaktfria ultraljudsbehandlaren UIP400MTP underlättar FASP i plattor med 96 brunnar
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från laboratoriestorlek till industristorlek.