Ултразвучна дезагрегација ћелија у бактеријским узорцима
Бактеријски узорци ретко стижу као праве суспензије појединачних ћелија. Културе расту у ланцима и флокулaма, изолати из животне средине формирају агрегате повезане екстрацелуларним полимерним супстанцама, а центрифугирани талози често се тешко ресуспендују упркос темељном мешању на вортексу. Одређивање броја вијабилних ћелија, мерење оптичке густине, проточна цитометрија и профилисање микробиома заснивају се на претпоставци да једна честица одговара једној ћелији. Ултразвучна дезагрегација ћелија решава тај несклад: кратки, контролисани импулси соникације раздвајају агрегате на појединачне ћелије без њихове лизе.
Зашто агрегација ћелија нарушава ваше резултате
Агрегација је биолошка особина, а не грешка у припреми. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces и многе врсте из животне средине расту у ланцима, групама или фрагментима биофилма, а екстрацелуларна ДНК и полисахариди слепљују ћелије у талозима и елуатима брисева. Последице по анализу су систематске:
- Број колонија се потцењује јер једна накупина даје једну колонију без обзира на то колико ћелија садржи.
- Мерења оптичке густине и бројачи честица региструју агрегате уместо ћелија, што искривљује криве раста.
- Проточна цитометрија и сортирање ћелија погрешно броје догађаје који одговарају слепљеним ћелијама и искључују их из анализе.
- Екстракције ДНК и протеина представљају само ћелије на површини агрегата, што искривљује податке о микробиому и омичке податке.
Уобичајени поступци су спори, непотпуни или изазивају хемијске промене. Снажно пипетирање и мешање на вортексу остављају микроагрегате. Ензимско дисперговање или дисперговање помоћу хелатора мења површину ћелија коју можда намеравате да анализирате. Механичка дезагрегација контролисаном кавитацијом делује у року од неколико секунди и не захтева додатке.
Један агрегат значи једну колонију – и један погрешан резултат. Погледајте како ултразвучна дезагрегација даје праве суспензије појединачних ћелија без лизе, аеросола или руковања сондом. Затражите више информација!
Соникатор за више епрувета VialTweeter за бесконтактну припрему узорака: Раздвојите накупине ћелија у затвореним епруветама
Како соникација раздваја ћелијске агрегате без лизе ћелија
Ултразвучна дезагрегација ћелија користи разлику у механичкој чврстоћи. Бактеријске агрегате на окупу држе релативно слабе међућелијске везе и екстрацелуларни матрикс, док нетакнут ћелијски омотач подноси знатно веће смицање. Када калибрисани ултразвук уђе у суспензију, акустична кавитација ствара микрострујање, импулсе притиска и силе смицања које најпре делују на граничним површинама агрегата. Накупине, ланци и фрагменти биофилма раздвајају се смицањем (деагломерација) пре него што се достигне ниво енергије при којем мембране пуцају (лиза).
Ултразвучна дезагрегација накупина бактеријских ћелија
Дезагрегација или лиза – какав је значај параметара соникације
Практична последица је да се дезагрегација и лиза спроводе истим инструментом који ради при различитим параметрима. При умереној амплитуди, кратким импулсним циклусима и контролисаној температури добијате суспензију појединачних вијабилних ћелија. Повећање амплитуде, времена излагања или температуре узорка усмерава процес ка потпуном разарању ћелија ради добијања унутарћелијских циљних компоненти. Генератори Hielscher омогућавају вам да прецизно подесите амплитуду, снагу, импулсни режим и унос енергије и сачувате методу, тако да је корак дезагрегације поновљив за различите узорке, оператере и циклусе обраде.
Ефикасна бесконтактна соникација
Соникација у купатилу не може да обезбеди овакав ниво контроле. Ултразвучна купатила и резервоари за чишћење обезбеђују само ниску ултразвучну енергију, што доводи до непотпуне припреме, а кавитација се јавља неравномерно, па се свака епрувета третира у зависности од свог положаја у купатилу. VialTweeter преноси интензивне, усмерене ултразвучне силе директно кроз зид посуде у до 10 затворених узорака истовремено. Третмани који у купатилу захтевају дуго излагање променљивог трајања завршавају се применом стандардизованог обрасца импулса.
Hielscher бесконтактни соникатори примењују интензиван, усмерен ултразвук кроз зидове затворених бочица. VialTweeter обрађује до 10 бочица истовремено, при идентичном интензитету, без сонде у узорку, без унакрсне контаминације и без ослобађања аеросола. Када то захтева капацитет обраде узорака, соникатори за микроплоче UIP400MTP и UIP550MTP омогућавају исти контролисани пренос енергије и на плоче са више бунарчића.
VialTweeter истовремено соницира до 10 мањих бочица и до 5 већих епрувета.
Предности бесконтактне ултразвучне дезагрегације
- Без икакве унакрсне контаминације: Пошто бочице остају све време затворене и ниједна сонда се не урања у узорак, унакрсна контаминација и губитак узорка потпуно се избегавају. Између узорака нема ничега што треба стерилисати, а један циклус обраде не може да утиче на следећи.
- Заштита од аеросола: Соникација сондом у отвореној посуди ствара инфективне аеросоле и контаминира површине инструмента. Соникација у затвореним бочицама задржава узорак у његовој сопственој епрувети, што је значајно при руковању патогеним бактеријама као што је Mycobacterium tuberculosis и другим агенсима нивоа биолошке безбедности BSL-2 или BSL-3.
- Без ерозије врха: Титанијумске сонде могу током рада да отпуштају малу количину микрочестица у узорак. Те честице мењају оптичку густину и број честица у наредним мерењима. Индиректна соникација кроз зид посуде у потпуности елиминише овај извор чврстих честица.
- Уједначен капацитет обраде узорака: VialTweeter доводи ултразвук истог интензитета до сваке од највише 10 бочица, па су резултати соникације уједначени и поновљиви. Утицаји положаја који отежавају рад са купатилима и појединачну обраду узорака сондом нестају, а ваше почетне вредности остају упоредиве између репликата.
- Интегритет узорка: Епрувете остају затворене током целокупне обраде, тако да узорак не може да се контаминира, поквари или испари. Мале запремине могу да се обрађују без разблаживања, укључујући драгоцене клиничке талоге код којих додатни корак преношења није прихватљив.
- Контрола процеса: Амплитуда се може подешавати од 20 до 100%, импулсни режим од 0 до 100%, а системи подржавају праћење температуре тако да термоосетљиви сојеви и протеини остају испод прагова при којима долази до оштећења.
Типичне примене
- Анализа микробиома и цревног садржаја: дисперговање бактерија родова Lactobacillus и Bifidobacterium и фекалних узорака пре засејавања на плоче или секвенцирања, како накупине не би довеле до потцењивања броја ћелија.
- Микробиологија хране и воде: дезагрегација флокула у брисевима, течностима од испирања и бујонима за обогаћивање ради тачног одређивања броја колонија и вијабилности.
- Истраживање биофилма: издвајање ћелија са носача и површина у облику суспензија појединачних ћелија, без ензимског третмана који би уклонио површинске протеине.
- Клиничка дијагностика: ресуспендовање спутума, гноја и елуата брисева у условима биолошке изолације.
- Ћелијска култура: раздвајање слепљених агрегата ћелија сисара, инсеката и CHO ћелија пре бројања и пасажирања.
- Припрема током целокупног радног поступка: исти инструмент који врши дезагрегацију при ниској амплитуди обавља потпуно разарање ћелија при вишим подешавањима, тако да лиза, екстракција протеина и фрагментација ДНК следе без преношења узорака из једне епрувете у другу.
Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP за деагломерацију ћелијских накупина уз висок капацитет обраде узорака
Поред плоча са више бунарчића, модели соникатора за микроплоче UIP400MTP и UIP550MTP обрађују и сталке са епруветама.
Пронађите одговарајући соникатор за свој поступак дезагрегације
Соникатор за више епрувета VialTweeter
Метода избора за стерилну дезагрегацију у затвореним бочицама. Уз погон процесора UP200St снаге 200 вати на 26 kHz са аутоматским подешавањем, VialTweeter преноси ултразвук индиректно кроз зидове до 10 затворених бочица истовремено, снагом до 10 W по епрувети, за уједначене и поновљиве резултате без унакрсне контаминације и без губитка узорка. Титанијумска сонотрода VialTweeter може се аутоклавирати, а амплитуда и пулсни режим могу се подешавати и сачувати, што пружа опсег контроле потребан за протокол деагломерације. Стандардна сонотрода са 10 места прихвата бочице за аутоматске узоркиваче, микроцентрифужне епрувете и епрувете Eppendorf или Nunc запремине од 1 до 5 mL. Стезни уређај VialPress прихвата до 5 већих посуда пречника до 20 mm.
Доступни су наменски модели VialTweeter за једну епрувету, намењени епруветама Falcon, као и појединачним бочицама, уз прилагођавање величини посуде. Демонтирајте блок-сонотроду и основна јединица UP200St радиће као конвенционални соникатор са сондом за директну обраду малих до средњих узорака.
Соникатори за микроплоче
Пређите на припрему великог броја узорака соникацијом плоча са више бунарчића: За радне поступке засноване на плочама, соникатори за микроплоче UIP400MTP и UIP550MTP проширују бесконтактну, уједначену соникацију са десет епрувета на целу плочу.
UIP400MTP снаге 400 вати обрађује стандардне микротитарске плоче и плоче са више бунарчића, укључујући формате са 96 бунарчића, уз прецизну контролу амплитуде, снаге и пулсног режима, као и тајмер, температурну сонду и хлађење у воденом купатилу. Одвајање биофилма од подлоге и обрада бактеријских култура утврђене су примене соникатора за микроплоче UIP400MTP.
UIP550MTP снаге 550 вати је снажнија опција – идеална за захтевније примене.
Оба система за бесконтактну соникацију поуздано обрађују плоче са 6, 12, 24, 48, 96 и 384 бунарчића, као и сталке са епруветама и Петријеве шоље. Соникатори за микроплоче Hielscher раде са било којом стандардном плочом, чиме се избегава употреба скупог потрошног материјала специфичног за произвођача. Захваљујући програмабилним температурним границама, соникација се аутоматски паузира при достизању максималне температуре узорка и наставља након хлађења, чиме се очувава вијабилност током поновљених циклуса. Паметна и поуздана припрема великог броја узорака за поновљиве резултате.
Табела у наставку даје преглед приближног капацитета обраде наших соникатора за лабораторијске узорке који се користе у биолошким наукама, геномици, протеомици и дијагностици:
| Препоручени уређаји | Запремина шарже | Проток |
|---|---|---|
| Соникатор за више епрувета VialTweeter | бочице од 0,5 до 1,5mL | n.a. |
| Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP (440 вати) | плоче са више бунарчића / микротитарске плоче | n.a. |
| Соникатор за плоче са више бунарчића UIP550MTP (550 вати) | плоче са више бунарчића / микротитарске плоче | n.a. |
| Ултразвучни CupHorn | CupHorn за бочице или лабораторијску чашу | n.a. |
| Соникатор са сондом UP100H снаге 100 вати | 1 до 500mL | 10 до 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St модели соникатора са сондом снаге 200 вати | 10 до 1000mL | 20 до 200mL/min |
| Соникатор са сондом UP400St снаге 400 вати | 10 до 2000mL | 20 до 400mL/min |
| GDmini2 | стерилни ултразвучни микропроточни реактор | n.a. |
| Ултразвучни тресач сита | n.a. | n.a. |
Често постављана питања о ултразвучној дезагрегацији ћелија
Која је разлика између дезагрегације ћелија и лизе ћелија?
Дезагрегација, која се назива и деагломерација, раздваја слепљене ћелије у суспензију појединачних ћелија, при чему ћелије остају неоштећене и вијабилне. Лиза разара ћелијски омотач и ослобађа унутарћелијски садржај. Оба процеса покрећу силе смицања настале кавитацијом, а разлика је у унетој енергији. Уз оптимизована подешавања амплитуде, пулсног режима и температуре, соникацијом се постиже дезагрегација испод прага лизе.
Зашто ултразвучна купатила нису погодна за стандардизовану дезагрегацију?
Купатила обезбеђују само ниску ултразвучну енергију, што доводи до непотпуне припреме, а кавитација се развија веома неравномерно у резервоару, па се сваки узорак различито третира у зависности од свог положаја. Микробиолошка бројања и упоредне студије зависе од упоредивости. Бесконтактни соникатори, као што су соникатор за више епрувета VialTweeter и модели соникатора за микроплоче UIP400MTP и UIP550MTP, обрађују све посуде под подешеним ултразвучним условима, што побољшава поновљивост међу репликатима.
Може ли соникација оштетити ћелије?
Да, ако се параметри не контролишу. Прекомерна соникација или неконтролисано загревање могу оштетити ћелије, а ослобођена ДНК чини узорке вискозним и подстиче поновну агрегацију. Зато процес треба пажљиво развити: умерена амплитуда, пулсни циклуси, хлађење и инструменти са ограничењем температуре одржавају третман у области криве која одговара дезагрегацији.
Сви дигитални соникатори Hielscher нуде прецизно подесиве параметре, прикључиве температурне сензоре, програмабилна подешавања и аутоматизовано бележење података за поуздану припрему узорака.
Да ли узорак треба пренети у другу посуду?
Не. Бочице и плоче се обрађују у својим оригиналним, затвореним посудама. Индиректном соникацијом избегавају се и губици при преносу и преношење материјала између узорака повезано са руковањем сондом.
Које формате бочица може да обрађује VialTweeter?
Стандардна сонотрода са 10 места прихвата бочице за аутоматске узоркиваче, епрувете за микроцентрифугирање и епрувете Eppendorf или Nunc запремине од 1 до 5 mL. Додатак VialPress прихвата до 5 већих посуда пречника до 20 mm. Наменски модели VialTweeter за једну епрувету доступни су за епрувете Falcon и за прилагођене формате са једном бочицом или веће формате.
Могу ли једним инструментом да вршим дезагрегацију и лизу?
Да. Иста поставка која врши дезагрегацију при умереној амплитуди омогућава потпуно разарање ћелија при вишој амплитуди и дужем излагању, па се припрема суспензије појединачних ћелија и накнадна екстракција могу изводити узастопно без промене платформе.
Да ли се соникација користи у MBEC тестовима?
Соникација је утврђена и у великој мери стандардна компонента. У MBEC тесту са поклопцем са клиновима, након узгоја биофилмова на полистиренским клиновима и излагања антибиотику, клинови се преносе у свеж медијум и подвргавају мешању на вортексу и соникацији како би се приањајуће ћелије биофилма одвојиле и дезагрегирале у планктонску суспензију пре серијског разблаживања и бројања вијабилних ћелија (MBEC се очитава као најнижа концентрација која смањује број издвојених вијабилних ћелија за ≥3 log10 у односу на нетретирани биофилм). Соникација значајно побољшава квалитет дисперговања: непотпуно ослобађање ћелија уграђених у EPS матрикс доводи до потцењивања ерадикације и прецењивања вредности MBEC. Циљана соникација бунарчића који прихватају клинове широм тест-плоча помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP превазилази традиционалне слабости соникације у купатилу – наиме, неравномерну расподелу енергије, загревање и ризик од аеросола и унакрсне контаминације.
Сазнајте како бесконтактни соникатор за микроплоче UIP400MTP олакшава MBEC тестове!
Да ли се соникација користи у MIC тестовима?
Соникација се примењује у различитим радним поступцима повезаним са MIC тестовима ради побољшања ефикасности и поновљивости:
- микобактериологија, у којој се спутум и други вискозни узорци рутински деконтаминирају и хомогенизују, понекад соникацијом, пре испитивања осетљивости, а кратко дисперговање микобактеријских инокулума који формирају накупине доприноси тачном одређивању MIC;
- организми склони агрегацији (нпр. стрептококе, стафилококе у талозима) код којих микроагрегати нарушавају густину инокулума; и
- комбинована дијагностика, као што је култивисање течности добијене соникацијом имплантата, праћено испитивањем осетљивости код инфекције протетског зглоба (примена слична MBEC тесту, а не класичном MIC тесту).
Литература / Референце
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Изаберите сопствену плочу! Соникатор за микроплоче UIP550MTP дезагрегира бактеријске узорке у било којој стандардној плочи са више бунарчића.
Модели соникатора Hielscher за више узорака UIP400MTP за микроплоче, VialTweeter и CupHorn: брза припрема великог броја узорака