Ultrazvukové aplikácie pri vírusu opičích kiahní
Ultrazvuková sonikácia je dôležitou metódou spracovania na izoláciu vírusu opičích kiahní (MPXV) z analytických vzoriek, na fragmentáciu vírusovej DNA, ako aj pri výrobe vakcíny proti opičím kiahňam. Pri príprave vzoriek pred diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atď.) sa ultrazvuková sonikácia používa na lýzu buniek s cieľom uvoľniť vírus opičích kiahní z vnútra buniek a/alebo na fragmentáciu DNA. Vo výrobe vakcín sa aplikácie pohybujú od prípravy vírusových častíc/DNA, enkapsulácie do nosičov liečiv až po formuláciu inokulátov.
Nižšie nájdete podrobné informácie o ultrazvukovej príprave vzoriek vírusu opičích kiahní, ako aj o ultrazvukom podporovanej výrobe vakcíny MPXV.
Čo nájdete na tejto stránke:
- Ultrazvuková lýza na extrakciu vírusu opičích kiahní
- Ultrazvuková fragmentácia DNA vírusu opičích kiahní
- Ultrazvukové aplikácie vo výrobe vakcíny MPXV
Tento systém 2x 1kW ultrazvukových procesorov na prevádzku s kontinuálnym prietokom je nainštalovaný vo výrobnom zariadení na vakcíny.
Ultrazvuková lýza a fragmentácia DNA pred polymerázovou reťazovou reakciou (PCR)
Infekcia vírusom opičích kiahní sa deteguje testom amplifikácie nukleových kyselín (NAAT) pomocou reálneho času alebo konvenčnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) na detekciu unikátnych sekvencií vírusovej DNA. Vzorka (napr. z nazofaryngeálneho steru alebo kožnej biopsie) obsahuje vírus v bunkách.
Pre analýzu musí byť vírus uvoľnený z buniek a vírusová DNA musí byť fragmentovaná pre PCR.
Ultrazvuková lýza:
Ultrazvukové rozrušenie buniek / lýza je spoľahlivou a účinnou metódou na izoláciu vírusov z bunkových vzoriek, a tým je uprednostňovanou technikou pred chemickými činidlami, ako sú lyzozým, proteináza K a rôzne detergenty, ktoré sa alternatívne používajú na dosiahnutie lýzy buniek a uvoľnenia DNA.
Použitie takýchto chemických činidiel však vyžaduje časovo náročnú prípravu vzoriek v niekoľkých krokoch pred analýzou PCR, aby sa zabránilo inhibícii reakcie PCR. Keďže inhibítory PCR ovplyvňujú účinnosť amplifikácie, malé variácie množstva inhibítorov, ktoré nie sú odstránené, môžu viesť k veľkým variáciám v amplifikácii produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou ultrazvukovej sonikácie pre lýzu je, že úplné rozrušenie bunkových štruktúr a uvoľnenie DNA bez potreby lyzačných činidiel a časovo náročnej prípravy vzoriek sú žiaduce. (pozri Fykse et al., 2003)
Ultrazvuková fragmentácia DNA:
Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednoduchá a spoľahlivá, pretože produkuje fragmenty DNA s nastaviteľnou dĺžkou (páry báz, bp). Pomocou ultrazvuku možno DNA účinne fragmentovať na cieľovú dĺžku DNA. Presná kontrola ultrazvukových parametrov a sofistikované možnosti chladenia zabraňujú degradácii DNA.
Prečítajte si viac o ultrazvukovej fragmentácii DNA!
Ultrazvukové aplikácie vo vakcíne proti vírusu opičích kiahní
Vakcíny používané proti vírusu opičích kiahní sú v súčasnosti vakcíny s živým vírusom. Novovyvinuté vakcíny môžu používať iné platformy, ako napr. DNA-based The currently contains a modified Vaccinia Ankara viurs, attenuovaný, nereplikujúci ortopoxvírus. Obsahuje tiež Tris (tris-aminomethane) a chlorid sodný. Vakcína môže tiež obsahovať malé množstvá DNA a proteínu z buniek Chicken Embryo Fibroblast, ktoré sa používajú na pestovanie vírusu vakcíny, benzonázu a antibiotické zlúčeniny, ako je gentamicín a ciprofloxacín.
Ultrazvuková homogenizácia sa používa pri výrobe vakcín s živým attenuovaným vírusom, DNA vakcín, multivalentných DNA koktailov, mRNA vakcín, rekombinantných proteínových vakcín, vakcín s vírusopodobnými časticami atď.
- disperzie vírusových častíc a činidiel
- emulgovania
- inaktivácie vírusov
- formulácie nosičov liečiv (NLC, SLN)
- enkapsulácie
- rozpúšťania činidiel
- prípravy adjuvantov
- odplynenia / odvzdušnenia
Podrobnejšie informácie o ultrazvukových aplikáciách na zlepšenie výroby vakcín nájdete tu!
Protokol na ultrazvukovú izoláciu vírusu opičích kiahní
Výskumný tím Stittelaar (2005) použil ultrazvukovú lýzu na uvoľnenie vírusu opičích kiahní z kultúry hostiteľských buniek, ako aj z buniek získaných prostredníctvom hrdelných sterov od infikovaných primátov.
Príprava vakcíny proti opičím kiahňam:
Vírusy opičích kiahní sa pestovali na špecificky patogénovo voľných bunkách fibroblastov kuracích embryí. Po inkubácii 1 až 2 dni bola suspenzia vírus-bunka zozbieraná jedným cyklom zmrazenia-rozmrazenia a následne koncentrovaná centrifugáciou. Pelet bol resuspendovaný a podrobený niekoľkým cyklom ultrazvukovej homogenizácie.
Izolácia vírusu opičích kiahní z vakcinovaných makakov:
Vzorky boli trikrát zmrazené-rozmrazené a sonikované v ultrazvukovom CupHorn. Dva riedenia (1:10 a 1:100) v transportnom médiu doplnenom o 1% fetálneho hovädzieho séra sa použili na inokuláciu monovrstiev Vero buniek v šesťjamkových miskách. Po 1 h inkubácie pri 37°C boli inokulá odstránené a nahradené kultivačným médiom doplneným o 1% fetálneho hovädzieho séra. Monovrstvy sa kultivovali 5 dní pri 37°C a sfarbili roztokom kryštálovej violetovej.
(pozri Stittelaar et al., 2005)
Ultrazvukové procesory na analýzu vírusov a výrobu vakcín
Široké produktové portfólio Hielscher Ultrasonics ponúka ideálny ultrazvukový procesor pre výskumné a analytické laboratóriá, ako aj pre priemyselnú výrobu vakcín.
Hielscher Ultrasonics sa špecializuje na návrh, výrobu a distribúciu vysokovýkonných ultrazvukových procesorov a sono-bioreaktorov na použitie vo výskumných a analytických laboratóriách, ako aj na implementáciu do priemyselnej výroby vakcín (napr. vakcíny, API).
Sonikácia sa môže aplikovať na otvorené nádoby, uzavreté kontinuálne miešané reaktory a kontinuálne prietokové reaktory. Všetky časti ultrazvukových systémov, ktoré prichádzajú do kontaktu s kvapalným médiom, sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, titánu alebo skla. Autoklavovateľné diely a sanitárne armatúry zabezpečujú výrobu za podmienok farmaceutickej kvality.
Automatický záznam údajov: Inteligentný softvér automaticky zaznamenáva parametre procesu sonikácie na integrovanej SD pamäťovej karte. Presná kontrola všetkých procesných parametrov zabezpečuje reprodukovateľnosť, štandardizáciu výrobya uľahčuje plnenie noriem bezpečnosti farmaceutických produktov.
Ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics sú vysoko spoľahlivé a možno ich presne ovládať. Všetky priemyselné ultrazvukové procesory možno nastaviť tak, aby dodávali celý rozsah od nižších po veľmi vysoké amplitúdy. Robustnosť ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje prevádzku 24/7 pod ťažkým zaťažením a v náročných prostrediach.
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje predstavu o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových procesorov:
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| viacjamkové / mikrotitračné platne | n/a | UIP400MTP |
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 až 20L | 0,2 až 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 až 100L/min | UIP16000 |
| n/a | väčšie | zhluk UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Ultrazvukové strihanie DNA
Upravené od Jkwchui pod licenciou CC-BY-SA.03
Literatúra / Referencie
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakty, ktoré stojí za to poznať
Vírus opičích kiahní
Opičie kiahne (MPV, MPXV alebo hMPXV) sú druhom dvojvláknovej DNA vírusu, ktorý spôsobuje vírusové zoonotické ochorenie. Toto ochorenie je známe ako infekcia opičích kiahní a môže sa vyskytovať u ľudí a zvierat. Patrí do rodu Orthopoxvirus v čeľadi Poxviridae. Vírus opičích kiahní je jedným z ľudských ortopoxvírusov spolu s vírusmi variola (VARV), kravské kiahne (CPX) a vaccinia (VACV). Ortopoxvírusy sú charakterizované veľkými tehličkovitými vírusovými časticami, ktoré obsahujú dvojvláknový genóm DNA s približne 200 000 bp.
Stanovenie ELISA
ELISA znamená Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay a je označený imunoassay, ktorý sa považuje za zlatý štandard imunoassayov. ELISA je imunologický test, cenený pre svoju vysokú diagnostickú citlivosť, používaný na detekciu a kvantifikáciu molekúl, vrátane protilátok, antigénov, proteínov, glykoproteínov a hormónov. Princíp ELISA je založený na interakcii antigén-protilátka. Touto interakciou antigén-protilátka sa špecifické protilátky viažu na svoj cieľový antigén. Iba keď dôjde k interakcii, substrát sa môže viazať na enzým a následná konverzia substrátu môže byť pozorovaná, čo znamená, že sa získa pozitívny výsledok.
Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórneho po priemyselnú veľkosť.