Ultrazvukové aplikácie vo víruse MonkeyPox
Ultrazvukom je dôležitou metódou spracovania na izoláciu vírusu opičích kiahní (MPXV) z analytických vzoriek, na fragmentáciu dna vírusu, ako aj na výrobu vakcíny proti opičím kiahňam. Na prípravu vzorky pred diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atď.) sa ultrazvukom používa ultrazvukom na lyzovanie buniek s cieľom uvoľniť vírus opičích kiahní z vnútra bunky a / alebo fragmentovať DNA. Pri výrobe vakcín sa aplikácie pohybujú od prípravy vírusových častíc / DNA, zapuzdrenia v nosičoch liekov a formulovania inokula.
Nižšie nájdete podrobné informácie o ultrazvukovej príprave vzorky vírusu opičích kiahní, ako aj o ultrazvukom asistovanej výrobe vakcín MPXV.
Čo nájdete na tejto stránke:
- Ultrazvuková lýza na extrakciu vírusu opičích kiahní
- Ultrazvuková fragmentácia DNA vírusu opičích kiahní
- Ultrazvukové aplikácie pri výrobe vakcín MPXV
Tento systém 2x 1kW ultrazvukom pre nepretržitú prietokovú prevádzku je inštalovaný v zariadení na výrobu vakcín.
Ultrazvuková lýza a fragmentácia DNA pred polymerázovou reťazovou reakciou (PCR)
Infekcia vírusom opičích kiahní sa zistí testovaním amplifikácie nukleových kyselín (NAAT) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase alebo konvenčnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) na detekciu jedinečných sekvencií vírusovej DNA. Vzorka (napr. z výmeny nosohltanu alebo kožných biopsií) obsahuje vírus v bunkách.
Na analýzu musí byť vírus uvoľnený z buniek a vírusová DNA musí byť fragmentovaná pre PCR.
Ultrazvuková lýza:
Ultrazvukové narušenie buniek / lýza je spoľahlivá a účinná metóda na izoláciu vírusov z bunkových vzoriek, a tým výhodnejšia technika pred chemickými látkami, ako je lyzozým, proteináza K a rôzne detergenty, ktoré sa alternatívne používajú na dosiahnutie lýzy buniek a uvoľňovania DNA.
Použitie takýchto chemických činidiel si však vyžaduje časovo náročnú prípravu vzorky v niekoľkých krokoch pred analýzou PCR, aby sa zabránilo inhibícii reakcie PCR. Pretože inhibítory PCR ovplyvňujú účinnosť amplifikácie, malé zmeny množstva inhibítorov, ktoré nie sú odstránené, môžu viesť k veľkým odchýlkam v amplifikácii produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou ultrazvukom pre lýzu je, že je žiaduce úplné narušenie bunkových štruktúr a uvoľňovanie DNA bez potreby lyzovania činidiel a časovo náročnej prípravy vzoriek. (porov. Fykse a kol., 2003)
Ultrazvuková fragmentácia DNA:
Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednoduchá a spoľahlivá, pretože produkuje fragmenty DNA laditeľné na dĺžku (basepairs, bp). Pomocou ultrazvuku môže byť DNA účinne fragmentovaná na cieľovú dĺžku DNA. Presná kontrola ultrazvukových parametrov a sofistikované možnosti chladenia zabraňujú degradácii DNA.
Prečítajte si viac o fragmentácii ultrazvukovej DNA!
Ultrazvukové aplikácie vo vakcíne proti vírusu monkeypox
Vakcíny používané proti vírusu opičích kiahní sú v súčasnosti živými vakcínami proti vírusu. Novo vyvinuté vakcíny môžu používať iné platformy, ako napríklad na báze DNA V súčasnosti obsahuje modifikované viurs Vaccinia Ankara, oslabený, nereplikujúci sa ortopoxvírus. Obsahuje tiež Tris (tris-aminometán) a chlorid sodný. Vakcína môže tiež obsahovať malé množstvá DNA a proteínu z buniek fibroblastov kuracieho embrya, ktoré sa používajú na pestovanie vakcinačného vírusu, benzonázy a antibiotických zlúčenín, ako je gentamycín a ciprofloxacín.
Ultrazvuková homogenizácia sa používa pri výrobe živých atenuovaných vírusových vakcín, dna vakcín, viacvalentných DNA koktailov, mRNA vakcín, rekombinantných proteínových vakcín, vírusom podobných častíc atď.
- disperzia vírusových častíc a činidiel
- emulgácia
- inaktivácia vírusov
- formulácia nosiča liečiva (NLC, SLN)
- Zapuzdrenia
- rozpustenie činidiel
- príprava adjuvantov
- Odplynenie / oderu
Nájdete podrobnejšie informácie o ultrazvukových aplikáciách na zlepšenie výroby vakcín!
Protokol pre ultrazvukovú izoláciu vírusu opičích kiahní
Výskumný tím spoločnosti Stittelaar (2005) použil ultrazvukovú lýzu na uvoľnenie vírusu opičích kiahní z rastovej hostiteľskej bunkovej kultúry, ako aj z buniek získaných výmenou hrdla z infikovaných primátov.
Príprava vakcíny proti opičím kiahňam:
Vírusy opičích kiahní sa pestovali na fibroblastových bunkách kuracieho embrya bez špecifických patogénov. Po inkubácii počas 1 až 2 dní sa suspenzia vírusových buniek odobrala jedným kolom zmrazovania a rozmrazovania a potom sa koncentrifugáciou koncentrovala. Peleta bola resuspendovaná a podrobená niekoľkým kolám ultrazvukovej homogenizácie.
Izolácia vírusu opičích kiahní z očkovaných makakov:
Vzorky boli trikrát zmrazené a rozmrazené a sonikované v ultrazvukovom CupHorn. Na naočkovanie monovrstiev v šiestich jamkách sa použili dve riedenia (1:10 a 1:100) v transportnom médiu doplnené 1% fetálnym hovädzím sérom. Po 1 hodine inkubácie pri teplote 37 °C sa inokula odstránila a nahradila sa kultivačným médiom doplneným 1% fetálnym hovädzím sérom. Monovrstvá sa kultivovali 5 dní pri teplote 37 °C a zafarbili sa kryštálovo fialovým roztokom.
(porov. Stittelaar a kol., 2005)
Ultrazvukové prístroje na analýzu vírusov a výrobu vakcín
Hielscher Ultrasonics široké portfólio produktov ponúka ideálny ultrazvukový nástroj pre výskumné a analytické laboratóriá, ako aj pre priemyselnú výrobu vakcín.
Hielscher Ultrasonics sa špecializuje na návrh, výrobu a distribúciu vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov a sono-bioreaktorov na použitie vo výskumných a analytických laboratóriách, ako aj na implementáciu do priemyselnej výroby vakcín (napr. Vakcíny, Api).
Sonikáciu je možné aplikovať na otvorené nádoby, uzavreté reaktory s nepretržitým miešaním a kontinuálne prietokové reaktory. Všetky časti ultrazvukových systémov, ktoré sa dostanú do kontaktu s kvapalným médiom, sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, titánu alebo skla. Autoklávovateľné diely a sanitárne armatúry zabezpečujú výrobu pod podmienky farmaceutickej kvality.
Automatické zaznamenávanie údajov: Inteligentný softvér zaznamenáva parametre procesu sonikácie automaticky na integrovanej pamäťovej karte SD. Presná kontrola všetkých procesných parametrov zabezpečuje Reprodukovateľnosti, Štandardizácia výrobya uľahčuje plnenie noriem bezpečnosti farmaceutických výrobkov.
Hielscher Ultrazvuk’ ultrazvukové procesory sú vysoko spoľahlivé a môžu byť presne kontrolované. Všetky priemyselné ultrazvukové prístroje sa môžu nastaviť tak, aby dodávali celý rozsah od nižších až po veľmi vysoké amplitúdy. Robustnosť ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni pri vysokej záťaži av náročných prostrediach.
Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov:
| Objem šarže | prietok | Odporúčané Devices |
|---|---|---|
| viacvrstvové / mikrotiterové platne | Nedostupný | UIP400MTP (UIP400MTP) |
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20L | 02 až 4 l / min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10 l / min | UIP4000hdT |
| Nedostupný | 10 až 100 l / min | UIP16000 |
| Nedostupný | väčšia | strapec UIP16000 |
Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!
Ultrazvukové DNA Strihanie
Upravené od Jkwchui v cc-BY-SA.03
Literatúra/referencie
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakty stojí za to vedieť
Vírus opičích kiahní
Opičie kiahne (MPV, MPXV alebo hMPXV) sú druh dvojvláknového DNA vírusu, ktorý spôsobuje vírusové zoonotické ochorenie. Toto ochorenie je známe ako infekcia opičími kiahňami a môže sa vyskytnúť u ľudí a zvierat. Patrí do rodu Orthopoxvirus v čeľade Poxviridae. Vírus opičích kiahní je jedným z ľudských ortopoxvírusov spolu s vírusmi varioly (VARV), kravských kiahní (CPX) a vaccinia (VACV). Ortopoxvírusy sa vyznačujú veľkými vírusovými časticami v tvare tehál, ktoré obsahujú dvojvláknový genóm DNA približne 200 000 bp.
Skúška ELISA
ELISA je skratka pre Enzým-Linked ImmunoSorbent Assay a je to označený imunotest, ktorý sa považuje za zlatý štandard imunotestov. ELISA je imunologický test, cenený pre svoju vysokú diagnostickú citlivosť, ktorý sa používa na detekciu a kvantifikáciu molekúl vrátane protilátok, antigénov, proteínov, glykoproteínov a hormónov. Princíp ELISA je založený na interakcii medzi antigénom a protilátkou. Touto interakciou medzi antigénom a protilátkou sa špecifické protilátky viažu na cieľový antigén. Iba vtedy, keď dôjde k interakcii, substrát sa môže viazať na enzým a môže sa pozorovať následná konverzia substrátu, čo znamená, že sa získa pozitívny výsledok.
Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizers z laboratórium na priemyselnej veľkosti.