Ultrazvukové aplikácie pri víruse opičích kiahní
Ultrazvuk je dôležitou metódou spracovania na izoláciu vírusu opičích kiahní (MPXV) z analytických vzoriek, na fragmentáciu DNA vírusu, ako aj pri výrobe vakcín proti opičím kiahňam. Na prípravu vzoriek pred diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atď.) sa používa ultrazvuk na lýzu buniek s cieľom uvoľniť vírus opičích kiahní z vnútra bunky a / alebo fragmentovať DNA. Pri výrobe vakcín sa aplikácie pohybujú od prípravy vírusových častíc / DNA, zapuzdrenia do nosičov liečiv a formulovania inokulácie.
Nižšie nájdete podrobné informácie o ultrazvukovej príprave vzoriek vírusu opičích kiahní, ako aj o ultrasonicky asistovanej výrobe vakcíny MPXV.
Čo nájdete na tejto stránke:
- Ultrazvuková lýza na extrakciu vírusu opičích kiahní
- Ultrazvuková fragmentácia DNA vírusu opičích kiahní
- Ultrazvukové aplikácie pri výrobe vakcín MPXV
Tento systém 2x 1kW ultrazvukových prístrojov pre nepretržitú prevádzku je inštalovaný v zariadení na výrobu vakcín.
Ultrazvuková lýza a fragmentácia DNA pred polymerázovou reťazovou reakciou (PCR)
Infekcia vírusom opičích kiahní sa zisťuje testovaním amplifikácie nukleových kyselín (NAAT) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase alebo konvenčnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) na detekciu jedinečných sekvencií vírusovej DNA. Vzorka (napr. z výmeny nosohltanu alebo kožných biopsií) obsahuje vírus v bunkách.
Na analýzu musí byť vírus uvoľnený z buniek a vírusová DNA musí byť fragmentovaná na PCR.
Ultrazvuková lýza:
Ultrazvukové narušenie / lýza buniek je spoľahlivá a účinná metóda na izoláciu vírusov zo vzoriek buniek, a tým výhodná technika pred chemickými látkami, ako je lyzozým, proteináza K a rôzne detergenty, ktoré sa alternatívne používajú na dosiahnutie lýzy buniek a uvoľnenia DNA.
Použitie takýchto chemických činidiel si však vyžaduje časovo náročnú prípravu vzoriek v niekoľkých krokoch pred analýzou PCR, aby sa zabránilo inhibícii reakcie PCR. Keďže inhibítory PCR ovplyvňujú účinnosť amplifikácie, malé odchýlky v množstve inhibítorov, ktoré nie sú odstránené, môžu viesť k veľkým rozdielom v amplifikácii produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou ultrazvuku na lýzu je, že je žiaduce úplné narušenie bunkových štruktúr a uvoľnenie DNA bez potreby lyzujúcich činidiel a časovo náročnej prípravy vzoriek. (porovnaj Fykse et al., 2003)
Ultrazvuková fragmentácia DNA:
Ultrazvuková fragmentácia DNA je jednoduchá a spoľahlivá, pretože vytvára fragmenty DNA laditeľné na dĺžku (páry báz, bp). Pomocou ultrazvuku je možné DNA účinne fragmentovať na cieľovú dĺžku DNA. Presné ovládanie ultrazvukových parametrov a sofistikované možnosti chladenia zabraňujú degradácii DNA.
Prečítajte si viac o ultrazvukovej fragmentácii DNA!
Ultrazvukové aplikácie vo vakcíne proti vírusu opičích kiahní
Vakcíny používané proti vírusu opičích kiahní sú v súčasnosti živé vírusové vakcíny. Novo vyvinuté vakcíny môžu využívať iné platformy, ako napríklad na báze DNA V súčasnosti obsahuje modifikovaný Vaccinia Ankara viurs, oslabený, nereplikujúci sa ortopoxvírus. Obsahuje tiež Tris (tris-aminometán) a chlorid sodný. Vakcína môže obsahovať aj malé množstvá DNA a bielkovín z fibroblastových buniek kuracieho embrya, ktoré sa používajú na pestovanie vakcinačného vírusu, benzonázy a antibiotických zlúčenín, ako je gentamicín a ciprofloxacín.
Ultrazvuková homogenizácia sa používa pri výrobe živých oslabených vírusových vakcín, DNA vakcín, multivalentných DNA koktailov, mRNA vakcín, rekombinantných proteínových vakcín, vírusom podobných časticových vakcín atď.
- Rozptyl vírusových častíc a činidiel
- emulgácia
- inaktivácia vírusov
- formulácia nosiča liečiva (NLC, SLN)
- zapuzdrenie
- rozpúšťanie látok
- Príprava adjuvans
- Odplyňovanie / odvzdušňovanie
Môžete nájsť podrobnejšie informácie o ultrazvukových aplikáciách na zlepšenie výroby vakcín!
Protokol pre ultrazvukovú izoláciu vírusu opičích kiahní
Výskumný tím Stittelaar (2005) použil ultrazvukovú lýzu na uvoľnenie vírusu opičích kiahní z kultúry rastových hostiteľských buniek, ako aj z buniek získaných výmenou hrdla z infikovaných primátov.
Príprava vakcíny proti opičím kiahňam:
Vírusy opičích kiahní boli pestované na fibroblastových bunkách kuracích embryí bez špecifických patogénov. Po inkubácii trvajúcej 1 až 2 dni sa suspenzia vírusových buniek odobrala jedným kolom mrazenia a rozmrazovania a potom sa koncentrovala centrifugáciou. Peleta bola resuspendovaná a podrobená niekoľkým kolám ultrazvukovej homogenizácie.
Izolácia vírusu opičích kiahní od očkovaných makakov:
Vzorky boli trikrát zmrazené a sonikované v ultrazvukovom CupHorn. Dve riedenia (1:10 a 1:100) v transportnom médiu doplnenom o 1% fetálne hovädzie sérum boli použité na naočkovanie monovrstiev Vero buniek v šesťjamkových platniach. Po 1 hodine inkubácie pri 37 °C boli inokuly odstránené a nahradené kultivačným médiom doplneným 1% fetálnym hovädzím sérom. Monovrstvy boli kultivované 5 dní pri 37 °C a zafarbené roztokom kryštálovej fialovej žiary.
(porovnaj Stittelaar et al., 2005)
Ultrazvukové prístroje na analýzu vírusov a výrobu vakcín
Široké portfólio produktov spoločnosti Hielscher Ultrasonics ponúka ideálny ultrazvuk pre výskumné a analytické laboratóriá, ako aj pre priemyselnú výrobu vakcín.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics sa špecializuje na návrh, výrobu a distribúciu vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov a sono-bioreaktorov na použitie vo výskumných a analytických laboratóriách, ako aj na implementáciu v priemyselnej výrobe vakcín (napr. vakcíny, Api).
Sonikáciu je možné aplikovať na otvorené nádoby, uzavreté reaktory s kontinuálnym miešaním a nepretržité prietokové reaktory. Všetky časti ultrazvukových systémov, ktoré prichádzajú do styku s kvapalným médiom, sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, titánu alebo skla. Autoklávovateľné diely a sanitárne armatúry zabezpečujú výrobu pod farmaceutické podmienky.
Automatické zaznamenávanie údajov: Inteligentný softvér automaticky zaznamenáva parametre procesu sonikácie na integrovanú pamäťovú kartu SD. Presná kontrola všetkých parametrov procesu zaisťuje reprodukovateľnosť, Štandardizácia výrobya uľahčuje plnenie noriem bezpečnosti farmaceutických výrobkov.
Hielscher Ultrasonics’ Ultrazvukové procesory sú vysoko spoľahlivé a dajú sa presne ovládať. Všetky priemyselné ultrazvuky je možné nastaviť tak, aby poskytovali celý rozsah od nižších po veľmi vysoké amplitúdy. Robustnosť ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni v náročných podmienkach a v náročných prostrediach.
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov:
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané zariadenia |
|---|---|---|
| viacjamkové / mikrotitračné platne | Nedostupný | UIP400MTP |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml/min | UP100H |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20 l | 00,2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000hdT |
| Nedostupný | 10 až 100 l/min | UIP16000 |
| Nedostupný | väčší | Zhluk UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Ultrazvukové strihanie DNA
Prevzaté z Jkwchui pod CC-BY-SA.03
Literatúra / Referencie
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
Vírus opičích kiahní
Opičie kiahne (MPV, MPXV alebo hMPXV) sú druh dvojvláknového vírusu DNA, ktorý spôsobuje vírusové zoonotické ochorenie. Toto ochorenie je známe ako infekcia opičími kiahňami a môže sa vyskytnúť u ľudí a zvierat. Patrí do rodu Orthopoxvirus z čeľade Poxviridae. Vírus opičích kiahní je jedným z ľudských ortopoxvírusov spolu s vírusmi varioly (VARV), kravských kiahní (CPX) a vakcinie (VACV). Orthopoxvírusy sú charakterizované veľkými vírusovými časticami v tvare tehly, ktoré obsahujú dvojvláknový genóm DNA približne 200 000 bp.
Test ELISA
ELISA je skratka pre Enzyme-Linked ImmunoSorbent Test a je to označený imunotest, ktorý sa považuje za zlatý štandard imunotestov. ELISA je imunologický test, ktorý je cenený pre svoju vysokú diagnostickú citlivosť, používa sa na detekciu a kvantifikáciu molekúl vrátane protilátok, antigénov, proteínov, glykoproteínov a hormónov. Princíp ELISA je založený na interakcii antigén-protilátka. Touto interakciou antigén-protilátka sa špecifické protilátky viažu na jeho cieľový antigén. Až keď dôjde k interakcii, substrát sa môže naviazať na enzým a je možné pozorovať následnú konverziu substrátu, čo znamená, že sa získa pozitívny výsledok.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.