Ультразвуковая дезагрегация клеток в бактериальных образцах
Бактериальные образцы редко поступают в виде подлинных одноклеточных суспензий. Культуры растут цепочками и хлопьями, изоляты из окружающей среды образуют агрегаты, связанные внеклеточными полимерными веществами, а центрифугированные осадки часто не поддаются ресуспендированию даже при тщательном перемешивании на вортексе. Подсчет жизнеспособных микроорганизмов, измерение оптической плотности, проточная цитометрия и профилирование микробиома — все эти методы основаны на допущении, что одна частица равна одной клетке. Ультразвуковая дезагрегация клеток устраняет это противоречие: короткие контролируемые импульсы ультразвука разделяют агрегаты на отдельные клетки, не разрушая их.
Почему агрегация клеток влияет на достоверность результатов
Агрегация является биологической особенностью, а не ошибкой при подготовке проб. Стафилококки, стрептококки, лактобактерии, актиномицеты и многие виды микроорганизмов из окружающей среды размножаются в виде цепочек, скоплений или фрагментов биопленки, а внеклеточная ДНК и полисахариды склеивают клетки в осадки и элюаты мазков. Это влечет за собой систематические последствия для анализа:
- Число колоний занижается, поскольку один скопление клеток считается одной колонией, независимо от того, сколько клеток оно содержит.
- Приборы для измерения оптической плотности и счетчики частиц фиксируют агрегаты вместо клеток, что приводит к искажению кривых роста.
- При проточной цитометрии и сортировке клеток агрегированные события подсчитываются неверно и исключаются из анализа.
- Извлечение ДНК и белков охватывает лишь клетки, расположенные на поверхности агрегата, что приводит к искажению данных о микробиоме и омических данных.
Традиционные методы являются медленными, неполноценными или приводят к химическим изменениям. Интенсивное пипетирование и перемешивание на вортексе оставляют микроагрегаты. Ферментативная дисперсия или дисперсия с использованием хелаторов изменяет поверхность клеток, которую вы, возможно, намереваетесь проанализировать. Механическая дезагрегация посредством контролируемой кавитации происходит в течение нескольких секунд и не требует использования добавок.
Один агрегат равен одной колонии – и один неверный результат. Убедитесь, как ультразвуковая дезагрегация позволяет получать настоящие одноклеточные суспензии без лизиса, образования аэрозолей и использования зондов. Запросите дополнительную информацию!
Многотрубный звукосниматель VialTweeter для бесконтактной подготовки образцов: разбивайте скопления клеток в герметичных пробирках
Как ультразвуковая обработка разрушает агрегаты клеток, не вызывая их лизиса
Ультразвуковая дезагрегация клеток основана на разнице в механической прочности. Бактериальные агрегаты удерживаются вместе за счёт относительно слабых межклеточных связей и внеклеточной матрицы, в то время как неповреждённая клеточная оболочка выдерживает значительно более высокие сдвиговые нагрузки. Когда откалиброванный ультразвук попадает в суспензию, акустическая кавитация генерирует микротечения, импульсы давления и сдвиговые силы, которые в первую очередь воздействуют на границы раздела агрегатов. Сгустки, цепочки и фрагменты биопленки разрываются под действием сдвига (деаггломерация) до того, как достигается уровень энергии, при котором происходит разрыв мембран (лизис).
Ультразвуковое разбивание скоплений бактериальных клеток
Дезагрегация или лизис – Почему параметры ультразвуковой обработки имеют значение
Практически это означает, что дезагрегация и лизис представляют собой один и тот же прибор, работающий с разными параметрами. При умеренной амплитуде, коротких импульсных циклах и контролируемой температуре получается жизнеспособная суспензия одиночных клеток. Увеличение амплитуды, времени воздействия или температуры образца смещает процесс в сторону полного разрушения клеток для доступа к внутриклеточным мишеням. Генераторы Hielscher позволяют точно настраивать амплитуду, мощность, импульс и подаваемую энергию, а также сохранять настройки метода, благодаря чему этап дезагрегации остается воспроизводимым независимо от образцов, операторов и циклов обработки.
Эффективная бесконтактная ультразвуковая обработка
Ультразвуковая обработка в ваннах не может сравниться с таким контролем. Ультразвуковые очистительные ванны и резервуары обеспечивают лишь низкий уровень ультразвуковой энергии, что приводит к неполной подготовке образцов, а кавитация протекает неравномерно, в результате чего каждая пробирка обрабатывается в зависимости от своего положения в ванне. Устройство VialTweeter передает интенсивные, сфокусированные ультразвуковые волны непосредственно через стенку сосуда одновременно в 10 герметичных проб. Процедуры, требующие длительного воздействия с переменной интенсивностью в ванне, выполняются по стандартизированной импульсной схеме.
Бесконтактные ультразвуковые устройства компании Hielscher обеспечивают воздействие интенсивного сфокусированного ультразвука через стенки закрытых пробирок. Устройство VialTweeter позволяет одновременно обрабатывать до 10 пробирок с одинаковой интенсивностью без погружения датчика в образец, исключая перекрестное загрязнение и образование аэрозолей. В случаях, когда требуется высокая пропускная способность, ультразвуковые устройства для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP обеспечивают такую же контролируемую передачу энергии для многолуночных планшетов.
Виалтвитер Одновременно сонирует до 10 небольших пробирок и до 5 больших пробирок.
Преимущества бесконтактной ультразвуковой дезагрегации
- Полное отсутствие перекрестного загрязнения: Поскольку пробирки остаются постоянно закрытыми, а зонд не погружается в образец, полностью исключаются перекрёстное загрязнение и потери образца. Между анализами не требуется стерилизация каких-либо элементов, и один цикл анализа не может повлиять на следующий.
- Защита от аэрозолей: Ультразвуковая обработка с открытым зондом приводит к образованию инфекционных аэрозолей и загрязнению поверхностей оборудования. При ультразвуковой обработке в герметичной пробирке образец находится внутри собственной пробирки, что имеет важное значение при работе с патогенными бактериями, такими как Mycobacterium tuberculosis, и другими возбудителями, относящимися к уровням биологической безопасности BSL-2 или BSL-3.
- Отсутствие потери чаевых: Титановые зонды могут выделять небольшое количество микрочастиц в образец во время работы. Эти частицы влияют на оптическую плотность и количество частиц в последующих участках конвейера. Непрямая ультразвуковая обработка через стенку емкости полностью устраняет этот источник твердых частиц.
- Равномерная пропускная способность: VialTweeter обеспечивает одинаковую интенсивность ультразвука для каждого из 10 пробирок, благодаря чему результаты ультразвуковой обработки получаются равномерными и воспроизводимыми. Исчезают эффекты, связанные с расположением пробирок, которые характерны для ультразвуковых ванн и зондирования отдельных проб, а базовые показатели остаются сопоставимыми во всех повторных опытах.
- Целостность образца: пробирки остаются закрытыми на протяжении всего процесса обработки, поэтому образец не может быть загрязнён, испорчен или улетучиться. Небольшие объёмы обрабатываются без разбавления, в том числе ценные клинические осадки, для которых недопустим дополнительный этап переноса.
- Управление технологическим процессом: Амплитуда регулируется в диапазоне от 20 до 100 %, импульсный режим — от 0 до 100 %, а системы поддерживают контроль температуры, благодаря чему термочувствительные штаммы и белки не превышают пороговых значений, приводящих к повреждению.
Типовые применения
- Анализ микробиома и содержимого кишечника: диспергирование бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium, а также образцов кала перед посевом на чашки или секвенированием, чтобы скопления не приводили к занижению результатов подсчёта.
- Микробиология пищевых продуктов и воды: расщепление флокул в мазках, промывных растворах и обогащающих бульонах для точного определения количества колоний и жизнеспособности микроорганизмов.
- Исследования биопленок: извлечение клеток с носителей и поверхностей в виде суспензий отдельных клеток без ферментативной обработки, которая привела бы к удалению поверхностных белков.
- Клиническая диагностика: ресуспендирование мокроты, гноя и элюатов мазков в условиях биологической защиты.
- Культура клеток: разбиение скоплений клеток млекопитающих, насекомых и клеток линии CHO перед подсчётом и пассажированием.
- Подготовка всего рабочего процесса: тот же прибор, который осуществляет дезагрегацию при низкой амплитуде, при более высоких настройках обеспечивает полное разрушение клеток, благодаря чему лизис, экстракция белков и фрагментация ДНК происходят без переливания из пробирки в пробирку.
Ультразвуковой анализатор многолуночных планшетов UIP400MTP для высокопроизводительной деагломерации скоплений клеток
Модели ультразвуковых аппаратов для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP предназначены не только для многолуночных планшетов, но и для обработки стоек с пробирками.
Подберите подходящий ультразвуковой аппарат для вашей технологии дезагрегации
VialTweeter Многоламповый ультразвуковой аппарат
Оптимальный метод дезагрегации в стерильных герметичных пробирках. Благодаря 200-ваттному процессору UP200St, работающему на частоте 26 кГц с автоматической настройкой, VialTweeter косвенно передает ультразвук через стенки до 10 закрытых пробирок одновременно, с мощностью до 10 Вт на каждую пробирку, обеспечивая равномерные и воспроизводимые результаты без перекрестного загрязнения и потери образца. Титановый сонотрод VialTweeter поддаётся автоклавированию, а амплитуда и длительность импульса регулируются и сохраняются в памяти, что обеспечивает необходимый диапазон регулировки для протокола деагломерации. Стандартный 10-позиционный сонотрод подходит для пробирок автоподачи, пробирок для микроцентрифуг, а также пробирок Eppendorf или Nunc объемом от 1 до 5 мл. Зажимное устройство VialPress позволяет обрабатывать до 5 более крупных сосудов диаметром до 20 мм.
Доступны специализированные однотрубные модели VialTweeter, предназначенные для трубок Falcon, а также для отдельных пробирок, изготовленных по индивидуальным размерам сосудов. При демонтаже блочного сонотрода базовый блок UP200St работает как обычный зондовый ультразвуковой аппарат для непосредственной обработки проб малого и среднего размера.
Ультразвуковые аппараты для микропланшетов
Переход к высокопроизводительной подготовке проб с помощью ультразвуковой обработки в многолуночных планшетах: для рабочих процессов на основе планшетов ультразвуковые устройства для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP позволяют расширить область бесконтактной и равномерной ультразвуковой обработки с десяти пробирок до всего планшета.
Устройство UIP400MTP мощностью 400 Вт предназначено для обработки стандартных микротитровальных и многолуночных планшетов, в том числе 96-луночных, и оснащено системой точного регулирования амплитуды, мощности и импульсного режима, а также таймером, датчиком температуры и системой охлаждения с помощью водяной бани. Удаление биопленки и обработка бактериальных культур являются традиционными областями применения ультразвукового обработчика микропланшетов UIP400MTP.
Модель UIP550MTP мощностью 550 Вт является более мощным вариантом – идеально подходит для более сложных задач.
Обе системы бесконтактной ультразвуковой обработки надежно обрабатывают 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, а также стойки для пробирок и чашки Петри. Ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов работают с любыми стандартными планшетами, что позволяет обойтись без дорогостоящих фирменных расходных материалов. Благодаря программируемым температурным ограничениям ультразвуковая обработка автоматически приостанавливается при достижении максимальной температуры образца и возобновляется после охлаждения, что обеспечивает сохранность жизнеспособности клеток при многократных циклах. Интеллектуальная и надёжная высокопроизводительная подготовка образцов для получения воспроизводимых результатов.
В приведенной ниже таблице представлены приблизительные характеристики производительности наших лабораторных ультразвуковых аппаратов, применяемых в биологических науках, геномике, протеомике и диагностике:
| Рекомендуемые устройства | Объем партии | Расход |
|---|---|---|
| VialTweeter Многоламповый ультразвуковой аппарат | 0флаконы объемом от 0,5 до 1,5 мл | н.а. |
| Ультразвуковой аппарат для многолуночных планшетов UIP400MTP (440 Вт) | Многолуночные / микротитровальные планшеты | н.а. |
| Ультразвуковой аппарат для многолуночных планшетов UIP550MTP (550 Вт) | Многолуночные / микротитровальные планшеты | н.а. |
| Ультразвуковой чашечный рожок | CupHorn для флаконов или стакана | н.а. |
| UP100H — ультразвуковой аппарат зондового типа мощностью 100 Вт | от 1 до 500 мл | От 10 до 200 мл/мин |
| УП200Хт, УП200Ст Модели ультразвуковых аппаратов зондового типа мощностью 200 Вт | От 10 до 1000 мл | от 20 до 200 мл/мин |
| UP400St — ультразвуковой аппарат зондового типа мощностью 400 Вт | от 10 до 2000 мл | от 20 до 400 мл/мин |
| ГДмини2 | стерильный ультразвуковой микропоточный реактор | н.а. |
| Ультразвуковая встряхиватель для сит | н.а. | н.а. |
Часто задаваемые вопросы об ультразвуковой дезагрегации клеток
В чём заключается разница между дезагрегацией клеток и лизисом клеток?
Деагрегация, также называемая деагломерацией, позволяет разделить слипшиеся клетки на одноклеточную суспензию, при этом клетки остаются целыми и жизнеспособными. Лизис приводит к разрушению клеточной оболочки и высвобождению внутриклеточного содержимого. Оба процесса вызываются кавитационным сдвигом, а разница заключается в затрачиваемой энергии. При оптимизированных настройках амплитуды, частоты импульсов и температуры ультразвуковая обработка обеспечивает дезагрегацию ниже порога лизиса.
Почему ультразвуковые ванны не подходят для стандартизированного разбиения агрегатов?
В ваннах подается лишь небольшое количество ультразвуковой энергии, что приводит к неполной обработке, а кавитация развивается по всей емкости крайне неравномерно, в результате чего каждый образец подвергается различной обработке в зависимости от своего положения. Микробиологические анализы и сравнительные исследования зависят от сопоставимости результатов. Бесконтактные ультразвуковые устройства, такие как многопробочный ультразвуковой процессор VialTweeter, а также модели ультразвуковых процессоров для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP, обрабатывают все пробирки в условиях, настроенных под ультразвуковое воздействие, что повышает воспроизводимость результатов между повторными измерениями.
Может ли ультразвуковая обработка повредить клетки?
Да, если параметры не контролируются. Чрезмерная ультразвуковая обработка или неконтролируемое нагревание могут повредить клетки, а высвободившаяся ДНК делает образцы вязкими и способствует повторной агрегации. Именно поэтому процесс следует разрабатывать тщательно: умеренная амплитуда, импульсные циклы, охлаждение и приборы с ограничением температуры позволяют удерживать обработку в той части кривой, где происходит дезагрегация.
Все цифровые ультразвуковые аппараты компании Hielscher оснащены функцией точного регулирования параметров, съемными датчиками температуры, программируемыми настройками и автоматической регистрацией данных, что обеспечивает надежную подготовку образцов.
Нужно ли перелить образец в другую посуду?
Нет. Пробирки и планшеты обрабатываются в оригинальной закрытой таре. Непрямая ультразвуковая обработка позволяет избежать как потерь при переносе, так и переноса загрязнений, связанного с манипуляциями с датчиком.
Какие форматы флаконов может обрабатывать VialTweeter?
Стандартный 10-позиционный сонотрод подходит для пробирок автопробоотборника, пробирок для микроцентрифуги, а также пробирок Eppendorf или Nunc объемом от 1 до 5 мл. Приспособление VialPress позволяет разместить до 5 более крупных емкостей диаметром до 20 мм. Доступны специализированные модели VialTweeter для работы с одной пробиркой, предназначенные для пробирок Falcon, а также для индивидуальных пробирок или пробирок большего размера.
Можно ли провести дезагрегацию и лизис с помощью одного прибора?
Да. Та же установка, которая обеспечивает деагрегацию при умеренной амплитуде, при более высокой амплитуде и более длительном воздействии осуществляет полное разрушение клеток, благодаря чему подготовку суспензии одиночных клеток и последующую экстракцию можно проводить последовательно без смены платформ.
Используется ли ультразвуковая обработка в анализах MBEC?
Ультразвуковая обработка является устоявшимся и в значительной степени стандартным компонентом. В анализе MBEC с использованием штифтов и крышек после выращивания биопленок на полистироловых штифтах и их воздействия антибиотиком штифты переносят в свежую среду и подвергают вихревой перемешивании и ультразвуковой обработке для отрыва и деагрегации прикрепленных клеток биопленки в планктонную суспензию перед серийным разведением и подсчетом жизнеспособных клеток (MBEC определяется как наименьшая концентрация, при которой количество выделенных жизнеспособных клеток снижается на ≥3 log10 по сравнению с необработанной биопленкой). Ультразвуковая обработка значительно улучшает качество дисперсии: неполное высвобождение встроенных клеток из матрицы EPS приводит к занижению оценки степени эрадикации и завышению значений MBEC. Целевая ультразвуковая обработка лунок с держателями штифтов на всех анализируемых планшетах с помощью микропланшетного ультразвукового аппарата UIP400MTP устраняет традиционные недостатки ультразвуковой обработки в ванне – а именно: неравномерное распределение энергии, нагрев и риск аэрозольного загрязнения или перекрестного загрязнения.
Узнайте, как бесконтактный ультразвуковой процессор для микропланшетов UIP400MTP облегчает проведение анализов MBEC!
Используется ли ультразвуковая обработка при определении минимального ингибирующего концентрации (МИК)?
Ультразвуковая обработка применяется на различных этапах рабочего процесса, связанных с определением МИК, для повышения эффективности и воспроизводимости результатов:
- микобактериология, где мокрота и другие вязкие образцы перед проведением тестирования на чувствительность к антибиотикам обычно подвергаются деконтаминации и гомогенизации, иногда с использованием ультразвуковой обработки, а для получения точных значений МИК обогащающие культуры микобактерий, образующие скопления, подвергаются кратковременной дисперсии;
- организмы, склонные к образованию агрегатов (например, стрептококки, стафилококки в виде гранул), у которых микроагрегаты искажают плотность инокулята; и
- комплексная диагностика, такая как ультразвуковое исследование имплантата и культуральное исследование жидкости с последующим определением чувствительности к антибиотикам при инфекции протеза сустава (метод, аналогичный MBEC, а не классическому определению МИК).
Литература / Литература
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Выберите себе тарелку! Ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP550MTP разделяет бактериальные образцы в любой стандартной многолуночной планшете.
Модели звуковых колонок Hielscher Multi-Sample Sonicator UIP400MTP для микропланшетов, VialTweeter и горн: высокоскоростная и высокопроизводительная пробоподготовка