Ультразвуковая дезагрегация клеток в бактериальных образцах
Бактериальные образцы редко поступают в виде истинных суспензий отдельных клеток. Культуры растут в виде цепочек и хлопьев, изоляты из окружающей среды образуют агрегаты, связанные внеклеточными полимерными веществами, а осадки после центрифугирования часто трудно ресуспендировать даже после тщательного перемешивания на вортексе. Подсчёт жизнеспособных клеток, измерение оптической плотности, проточная цитометрия и профилирование микробиома предполагают, что одна частица соответствует одной клетке. Ультразвуковая дезагрегация клеток устраняет это противоречие: короткие контролируемые импульсы обработки ультразвуком разделяют агрегаты на отдельные клетки, не вызывая их лизиса.
Почему агрегация клеток искажает ваши результаты
Агрегация – биологическая особенность, а не ошибка пробоподготовки. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces и многие виды из окружающей среды растут в виде цепочек, скоплений или фрагментов биоплёнок, а внеклеточная ДНК и полисахариды склеивают клетки в осадках и элюатах с тампонов. Последствия для анализа носят систематический характер:
- Число колоний занижается, поскольку одно скопление образует одну колонию независимо от количества клеток в нём.
- Измерения оптической плотности и счётчики частиц учитывают агрегаты вместо клеток, искажая кривые роста.
- При проточной цитометрии и сортировке клеток события, соответствующие скоплениям клеток, подсчитываются неверно и исключаются из анализа.
- При экстракции ДНК и белков представлены только клетки на поверхности агрегата, что искажает данные о микробиоме и данные омиксных исследований.
Традиционные способы устранения этой проблемы действуют медленно, дают неполный результат или вызывают химические изменения. Интенсивное пипетирование и перемешивание на вортексе не устраняют микроагрегаты. Диспергирование с помощью ферментов или хелаторов изменяет поверхность клеток, которую вы, возможно, намерены анализировать. Механическая дезагрегация посредством контролируемой кавитации действует за считанные секунды и не требует добавок.
Один агрегат соответствует одной колонии – и одному неверному результату. Узнайте, как ультразвуковая дезагрегация позволяет получать истинные суспензии отдельных клеток без лизиса, образования аэрозолей и манипуляций с зондом. Запросите дополнительную информацию!
Ультразвуковой прибор VialTweeter для одновременной обработки нескольких пробирок для бесконтактной пробоподготовки: разделяйте скопления клеток в герметично закрытых пробирках
Как обработка ультразвуком разделяет агрегаты клеток, не вызывая их лизиса
Ультразвуковая дезагрегация клеток использует различие в механической прочности. Бактериальные агрегаты удерживаются относительно слабыми межклеточными связями и внеклеточным матриксом, тогда как неповреждённая клеточная оболочка выдерживает значительно более высокие сдвиговые нагрузки. Когда ультразвук с калиброванными параметрами поступает в суспензию, акустическая кавитация создаёт микропотоки, импульсы давления и сдвиговые силы, которые сначала действуют на границах агрегатов. Скопления, цепочки и фрагменты биоплёнок разделяются под действием сдвига (деагломерация) до достижения уровня энергии, при котором происходит разрыв мембран (лизис).
Ультразвуковая дезагрегация скоплений бактериальных клеток
Дезагрегация или лизис – значение параметров обработки ультразвуком
На практике это означает, что дезагрегацию и лизис выполняют одним и тем же прибором при разных параметрах. При умеренной амплитуде, коротких импульсных циклах и контролируемой температуре вы получаете жизнеспособную суспензию отдельных клеток. Повышение амплитуды, продолжительности воздействия или температуры образца смещает процесс в сторону полного разрушения клеток для получения внутриклеточных целевых компонентов. Генераторы Hielscher позволяют точно задавать амплитуду, мощность, параметры импульсов и подводимую энергию, а также сохранять методику, благодаря чему этап дезагрегации воспроизводим для разных образцов, операторов и циклов обработки.
Эффективная бесконтактная обработка ультразвуком
Обработка ультразвуком в ванне не обеспечивает такого уровня контроля. Ультразвуковые очистительные ванны и резервуары обеспечивают лишь низкую ультразвуковую энергию, что приводит к неполной пробоподготовке, а кавитация возникает неравномерно, поэтому обработка каждой пробирки зависит от её положения в ванне. VialTweeter передаёт интенсивные сфокусированные ультразвуковые силы непосредственно через стенку сосуда одновременно в до 10 герметично закрытых образцов. Обработки, требующие длительного и варьирующегося воздействия в ванне, выполняются по стандартизированной последовательности импульсов.
Бесконтактные ультразвуковые приборы Hielscher воздействуют интенсивным сфокусированным ультразвуком через стенки закрытых флаконов. VialTweeter одновременно обрабатывает до 10 флаконов с одинаковой интенсивностью, без погружения зонда в образец, без перекрёстного загрязнения и без выделения аэрозолей. Если этого требует производительность обработки образцов, ультразвуковые приборы для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP обеспечивают такую же контролируемую передачу энергии в многолуночные планшеты.
VialTweeter одновременно обрабатывает ультразвуком до 10 флаконов меньшего размера и до 5 пробирок большего размера.
Преимущества бесконтактной ультразвуковой дезагрегации
- Полное отсутствие перекрёстного загрязнения: Поскольку флаконы постоянно остаются закрытыми и зонд не погружается в образец, перекрёстное загрязнение и потери образца полностью исключены. Между обработками образцов ничего не требуется стерилизовать, и один цикл обработки не может повлиять на следующий.
- Защита от аэрозолей: Обработка ультразвуком с помощью зонда в открытом сосуде образует инфекционные аэрозоли и загрязняет поверхности прибора. При обработке ультразвуком в герметично закрытом флаконе образец остаётся внутри собственной пробирки, что имеет значение при работе с патогенными бактериями, такими как Mycobacterium tuberculosis, и другими агентами уровней биологической безопасности BSL-2 или BSL-3.
- Отсутствие эрозии наконечника: Во время работы титановые зонды могут выделять в образец небольшое количество микрочастиц. Эти частицы изменяют оптическую плотность и результаты подсчёта частиц на последующих этапах. Непрямая обработка ультразвуком через стенку сосуда полностью устраняет этот источник твёрдых частиц.
- Равномерная обработка образцов: VialTweeter обеспечивает одинаковую интенсивность ультразвука в каждом из обрабатываемых флаконов (до 10), поэтому результаты обработки ультразвуком однородны и воспроизводимы. Влияние положения образцов, характерное для ванн и обработки отдельных образцов зондом, исчезает, а исходные показатели остаются сопоставимыми между повторностями.
- Сохранность образца: пробирки остаются закрытыми на протяжении всей обработки, поэтому образец не может загрязниться, испортиться или испариться. Малые объёмы обрабатываются без разбавления, в том числе ценные осадки клинических образцов, для которых недопустим дополнительный этап переноса.
- Контроль процесса: Амплитуда регулируется от 20 до 100%, импульсный режим – от 0 до 100%, а системы поддерживают мониторинг температуры, чтобы термочувствительные штаммы и белки оставались ниже температурных порогов повреждения.
Типичные области применения
- Анализ микробиома и кишечного содержимого: диспергирование Lactobacillus, Bifidobacterium и фекальных образцов перед посевом или секвенированием, чтобы скопления клеток не приводили к занижению результатов подсчёта.
- Микробиология пищевых продуктов и воды: дезагрегация хлопьев в пробах с тампонов, смывах и средах обогащения для точного определения числа колоний и жизнеспособности.
- Исследования биоплёнок: извлечение клеток с носителей и поверхностей в виде суспензий отдельных клеток без ферментативной обработки, которая удаляла бы поверхностные белки.
- Клиническая диагностика: ресуспендирование мокроты, гноя и элюатов с тампонов в условиях изоляции материала.
- Клеточные культуры: разделение агрегатов слипшихся клеток млекопитающих, насекомых и CHO перед подсчётом и пассированием.
- Подготовка для всего рабочего процесса: тот же прибор, который выполняет дезагрегацию при низкой амплитуде, обеспечивает полное разрушение клеток при более высоких настройках, поэтому лизис, экстракция белков и фрагментация ДНК выполняются последовательно без переноса между пробирками.
Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP400MTP для высокопроизводительной деагломерации скоплений клеток
Ультразвуковые приборы для микропланшетов моделей UIP400MTP и UIP550MTP обрабатывают не только многолуночные планшеты, но и штативы с пробирками.
Подберите подходящий ультразвуковой прибор для вашего процесса дезагрегации
Ультразвуковой прибор VialTweeter для одновременной обработки нескольких пробирок
Метод выбора для стерильной дезагрегации в герметично закрытых флаконах. VialTweeter, приводимый в действие процессором UP200St мощностью 200 Вт на частоте 26 kHz с автоматической настройкой, одновременно передаёт ультразвук непрямым способом через стенки до 10 закрытых флаконов с мощностью до 10 W на пробирку, обеспечивая однородные и воспроизводимые результаты без перекрёстного загрязнения и потерь образца. Титановый сонотрод VialTweeter допускает автоклавирование, а амплитуда и параметры импульсов регулируются и могут быть сохранены, что обеспечивает диапазон управления, необходимый для протокола деагломерации. Стандартный сонотрод на 10 позиций подходит для флаконов автосамплера, микроцентрифужных пробирок и пробирок Eppendorf или Nunc объёмом от 1 до 5 mL. Зажимное устройство VialPress вмещает до 5 сосудов большего размера диаметром до 20 mm.
Доступны специализированные модели VialTweeter для обработки одной пробирки Falcon, а также отдельных флаконов с адаптацией под размер сосуда. После демонтажа блочного сонотрода основной блок UP200St работает как обычный зондовый ультразвуковой прибор для прямой обработки образцов малого и среднего объёма.
Ультразвуковые приборы для микропланшетов
Переход к высокопроизводительной пробоподготовке с помощью ультразвуковой обработки многолуночных планшетов: для рабочих процессов с планшетами ультразвуковые приборы для микропланшетов UIP400MTP и UIP550MTP расширяют возможности бесконтактной равномерной обработки ультразвуком с десяти пробирок до целого планшета.
UIP400MTP мощностью 400 Вт обрабатывает стандартные микротитрационные и многолуночные планшеты, включая 96-луночные форматы, с точным управлением амплитудой, мощностью и импульсами, а также оснащён таймером, температурным датчиком и охлаждением в водяной ванне. Отделение биоплёнок и обработка бактериальных культур – устоявшиеся области применения ультразвукового прибора для микропланшетов UIP400MTP.
UIP550MTP мощностью 550 Вт – более мощный вариант, идеально подходящий для более требовательных задач.
Обе системы бесконтактной обработки ультразвуком надёжно обрабатывают 6-, 12-, 24-, 48-, 96- и 384-луночные планшеты, а также штативы с пробирками и чашки Петри. Ультразвуковые приборы Hielscher для микропланшетов работают с любым стандартным планшетом, позволяя избежать использования дорогих фирменных расходных материалов. Благодаря программируемым температурным пределам обработка ультразвуком автоматически приостанавливается при достижении максимальной температуры образца и возобновляется после охлаждения, сохраняя жизнеспособность при повторных циклах. Умная и надёжная высокопроизводительная пробоподготовка для воспроизводимых результатов.
В таблице ниже представлен обзор приблизительной производительности наших лабораторных ультразвуковых приборов для обработки образцов, используемых в науках о жизни, геномике, протеомике и диагностике:
| Рекомендуемые устройства | Объём партии | Расход |
|---|---|---|
| Ультразвуковой прибор VialTweeter для одновременной обработки нескольких пробирок | флаконы объёмом от 0,5 до 1,5mL | не применимо |
| Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP400MTP (440 Вт) | многолуночные / микротитрационные планшеты | не применимо |
| Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP550MTP (550 Вт) | многолуночные / микротитрационные планшеты | не применимо |
| Ультразвуковой CupHorn | CupHorn для флаконов или лабораторного стакана | не применимо |
| Зондовый ультразвуковой прибор UP100H мощностью 100 Вт | от 1 до 500mL | от 10 до 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St модели зондовых ультразвуковых приборов мощностью 200 Вт | от 10 до 1000mL | от 20 до 200mL/min |
| Зондовый ультразвуковой прибор UP400St мощностью 400 Вт | от 10 до 2000mL | от 20 до 400mL/min |
| GDmini2 | стерильный ультразвуковой микропроточный реактор | не применимо |
| Ультразвуковой ситовой встряхиватель | не применимо | не применимо |
Часто задаваемые вопросы об ультразвуковой дезагрегации клеток
В чём разница между дезагрегацией клеток и лизисом клеток?
Дезагрегация, также называемая деагломерацией, разделяет слипшиеся клетки, образуя суспензию отдельных клеток, при этом клетки остаются неповреждёнными и жизнеспособными. Лизис разрывает клеточную оболочку и высвобождает внутриклеточное содержимое. Оба процесса обусловлены кавитационным сдвигом, а различие заключается в подводимой энергии. При оптимизированных настройках амплитуды, импульсов и температуры обработка ультразвуком обеспечивает дезагрегацию ниже порога лизиса.
Почему ультразвуковые ванны не подходят для стандартизированной дезагрегации?
Ванны обеспечивают лишь низкую ультразвуковую энергию, что приводит к неполной пробоподготовке, а кавитация развивается в резервуаре крайне неравномерно, поэтому каждый образец получает различную обработку в зависимости от своего положения. Микробиологический подсчёт и сравнительные исследования зависят от сопоставимости результатов. Бесконтактные ультразвуковые приборы, такие как VialTweeter для одновременной обработки нескольких пробирок, а также ультразвуковые приборы для микропланшетов моделей UIP400MTP и UIP550MTP обрабатывают все сосуды при заданных условиях ультразвукового воздействия, что улучшает воспроизводимость между повторностями.
Может ли обработка ультразвуком повредить клетки?
Да, если параметры не контролируются. Чрезмерная обработка ультразвуком или неконтролируемый нагрев могут повредить клетки, а высвобождаемая ДНК делает образцы вязкими и способствует повторной агрегации. Поэтому процесс следует разрабатывать продуманно: умеренная амплитуда, импульсные циклы, охлаждение и приборы с ограничением температуры удерживают обработку в области дезагрегации на кривой процесса.
Все цифровые ультразвуковые приборы Hielscher предлагают точно управляемые параметры, подключаемые температурные датчики, программируемые настройки и автоматизированную регистрацию данных для надёжной пробоподготовки.
Нужно ли переносить образец в другой сосуд?
Нет. Флаконы и планшеты обрабатываются в своих исходных закрытых ёмкостях. Непрямая обработка ультразвуком позволяет избежать как потерь при переносе, так и переноса загрязнений, связанного с манипуляциями с зондом.
Какие форматы флаконов может обрабатывать VialTweeter?
Стандартный сонотрод на 10 позиций подходит для флаконов автосамплера, микроцентрифужных пробирок и пробирок Eppendorf или Nunc объёмом от 1 до 5 mL. Принадлежность VialPress вмещает до 5 сосудов большего размера диаметром до 20 mm. Доступны специализированные модели VialTweeter для обработки одной пробирки Falcon, а также для индивидуально адаптированных форматов отдельных флаконов или сосудов большего размера.
Можно ли выполнять дезагрегацию и лизис одним прибором?
Да. Та же установка, которая выполняет дезагрегацию при умеренной амплитуде, обеспечивает полное разрушение клеток при более высокой амплитуде и более длительном воздействии, поэтому получение суспензии отдельных клеток и последующая экстракция могут выполняться последовательно без смены оборудования.
Применяется ли обработка ультразвуком в анализах MBEC?
Обработка ультразвуком является устоявшимся и в значительной степени стандартным компонентом. В анализе MBEC с крышкой со штырьками после выращивания биоплёнок на полистирольных штырьках и воздействия антибиотика штырьки переносят в свежую среду и подвергают перемешиванию на вортексе и обработке ультразвуком, чтобы отделить и дезагрегировать прикреплённые клетки биоплёнки в планктонную суспензию перед последовательными разведениями и подсчётом жизнеспособных клеток (MBEC определяют как наименьшую концентрацию, снижающую число извлечённых жизнеспособных клеток на ≥3 log10 относительно необработанной биоплёнки). Обработка ультразвуком значительно улучшает качество диспергирования: неполное высвобождение клеток, заключённых в матриксе EPS, приводит к недооценке эрадикации и завышению значений MBEC. Целенаправленная обработка ультразвуком лунок, вмещающих штырьки, по всей площади аналитических планшетов с помощью ультразвукового прибора для микропланшетов UIP400MTP преодолевает традиционные недостатки обработки ультразвуком в ванне – а именно неравномерное распределение энергии, нагрев и риск образования аэрозолей/перекрёстного загрязнения.
Узнайте, как бесконтактный ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP облегчает проведение анализов MBEC!
Применяется ли обработка ультразвуком в анализах MIC?
Обработка ультразвуком применяется в различных рабочих процессах, связанных с определением MIC, для повышения эффективности и воспроизводимости:
- микобактериология, где мокроту и другие вязкие образцы перед тестированием чувствительности регулярно деконтаминируют и гомогенизируют, иногда с помощью обработки ультразвуком, а кратковременное диспергирование инокулятов микобактерий, образующих скопления, способствует точному определению MIC;
- организмы, склонные к агрегации (например, стрептококки, стафилококки в осадках), у которых микроагрегаты искажают плотность инокулята; и
- комбинированная диагностика, например посев жидкости, полученной при ультразвуковой обработке имплантата, с последующим тестированием чувствительности при инфекции протезированного сустава (применение, аналогичное MBEC, а не классическому MIC).
Узнайте о применении обработки ультразвуком для анализов MIC!
Литература / Ссылки
- FactSheet VialTweeter — Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Выбирайте свой планшет! Ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP550MTP выполняет дезагрегацию бактериальных образцов в любом стандартном многолуночном планшете.
Модели ультразвуковых приборов Hielscher для одновременной обработки нескольких образцов UIP400MTP для микропланшетов, VialTweeter и CupHorn: высокоскоростная и высокопроизводительная пробоподготовка