Sonicação para lise celular: Desorganização e extração de células
A lise ultra-sónica de células é uma técnica de preparação de amostras amplamente aplicada nos modernos laboratórios de biotecnologia. O seu principal objetivo é romper as membranas celulares ou células inteiras para libertar componentes intracelulares, como proteínas, ácidos nucleicos ou organelos. No trabalho diário de laboratório, isto significa que a sonicação é um método padrão para a rutura controlada de células e a extração eficiente de biomoléculas. A principal vantagem dos sonicadores reside na sua capacidade de modular com precisão os parâmetros críticos do processo, incluindo a intensidade dos ultra-sons, a pulsação e o controlo da temperatura. Este controlo permite aos investigadores obter uma lise fiável, minimizando os danos térmicos ou mecânicos nas biomoléculas sensíveis, o que resulta num processo de extração suave mas altamente eficiente.
Lise celular com Sonicadores
A lise ultra-sónica de células utiliza a cavitação acústica para romper as membranas celulares e libertar moléculas intracelulares. A Hielscher Ultrasonics oferece o sonicador clássico do tipo sonda, bem como sonicadores de várias amostras para processamento estéril: o VialTweeter para vários tubos e frascos e o 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP para microplacas padrão.
A Hielscher Ultrasonics fornece potentes sonicadores sem contacto para a preparação de amostras e análises clínicas. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP, O VialTweeter, o CupHorn e o sonicador de caudal GDmini2 processar as amostras em condições estéreis.
Homogeneizadores ultra-sónicos UP100H (100 watts) e UP400St (400 watts): Sonicação para lise e extração de células.
Homogeneizadores ultra-sónicos para lise e extração de células
| Tipo de dispositivo ultrassónico | Foco na aplicação | Volume da amostra | Caso de utilização típico | Vantagens | Modelos de exemplo |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicadores de tipo sonda | Sonicação de uma única amostra | 0.1 mL a ~1000 mL | Lise celular, extração de proteínas, fragmentação de ADN/ARN | Controlo preciso da energia; vários sonotrodos; ideal para amostras pequenas e médias | UP100H, UP200St, UP400ST |
| VialTweeter / CupHorn | Processamento paralelo de vários frascos selados | 8-10 frascos (~1-20 mL cada) | Lise normalizada de suspensões de células múltiplas | Sonicação uniforme; evita a contaminação cruzada; resultados reprodutíveis | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicador de placas de 96 poços | Sonicação de placas multipoços e de microtitulação | Formato da microplaca | Rastreio de elevado rendimento, proteómica, ensaios celulares | Sonicação simultânea e uniforme em todos os poços; ideal para fluxos de trabalho com várias amostras | UIP400MTP |
| reactores de célula de fluxo | Sonicação contínua para volumes mais elevados | >1 L, escalável | Desorganização celular à escala industrial, produção de extractos | Processamento contínuo; escalável; controlo total do processo (amplitude, pressão, temperatura) | UIP1000hdt, UIP2000hdT + célula de fluxo |
| Sistemas de Sonicação Esterilizados / Indirectos | Processamento de amostras sem contaminação | Dependente de frasco/tubo/microplaca | Amostras sensíveis, ambientes estéreis, ambientes regulamentares | Sem contacto com a sonda; evita a contaminação; esforço mínimo de limpeza | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Vantagens da utilização da Sonicação para a Lise Celular
Em comparação com outros métodos de lise e extração celular, a lise celular por ultra-sons tem várias vantagens:
- Velocidade: A lise e extração ultra-sónica de células é um método rápido que pode quebrar as células abertas numa questão de segundos. Este método é muito mais rápido do que outros métodos, como a homogeneização, a congelação-descongelação ou a moagem de esferas.
- Eficiência: A lise e extração ultra-sónica de células pode ser utilizada para tratar amostras pequenas, grandes ou múltiplas de uma só vez, tornando-a mais eficiente do que outros métodos que requerem o processamento individual de amostras pequenas.
- Sem químicos: A lise e extração de células por ultra-sons é um método não invasivo que não requer a utilização de produtos químicos ou enzimas agressivos. Isto torna-o ideal para aplicações em que a integridade do conteúdo celular tem de ser mantida. A contaminação indesejada das amostras pode ser evitada.
- Alto rendimento: A lise e extração de células por ultra-sons pode extrair um elevado rendimento de conteúdos celulares, incluindo ADN, ARN e proteínas. Isto deve-se ao facto de as ondas sonoras de alta frequência abrirem as paredes celulares e libertarem o conteúdo para a solução circundante.
- Controlo da temperatura: Os ultra-sons sofisticados permitem um controlo preciso da temperatura da amostra. Os sonicadores digitais da Hielscher estão equipados com um sensor de temperatura conectável e software de monitorização da temperatura.
- Reprodutível: Os protocolos para a lise ultra-sónica de células podem ser facilmente reproduzidos e mesmo adaptados a diferentes volumes de amostras maiores ou menores através de um simples aumento de escala linear.
- Versátil: A lise e extração de células por ultra-sons pode ser utilizada para extrair uma vasta gama de tipos de células, incluindo bactérias, leveduras, fungos, plantas e células de mamíferos. Também pode ser utilizada para extrair diferentes tipos de moléculas, incluindo proteínas, ADN, ARN e lípidos.
- Preparação simultânea de numerosas amostras: A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para processar confortavelmente várias amostras sob as mesmas condições de processo. Isto torna a etapa de preparação de amostras de lise e extração altamente eficiente e economiza tempo.
- Fácil de utilizar: O equipamento de lise e extração de células por ultra-sons é fácil de utilizar e requer uma formação mínima. O equipamento é também económico, uma vez que se trata de um investimento único, sem necessidade de re-compra ou de eliminação. Isto torna-o atrativo para uma vasta gama de investigadores e laboratórios.
Globalmente, a lise e extração ultra-sónica de células é um método rápido, eficiente, controlável com precisão e versátil para a extração de conteúdos celulares. As suas vantagens em relação a métodos alternativos tornam-no uma escolha atractiva para uma vasta gama de aplicações industriais e de investigação.
Princípio de funcionamento da lise celular por ultra-sons
A lise e extração ultra-sónica de células utiliza ondas sonoras de alta frequência para romper as células e extrair o seu conteúdo. As ondas sonoras criam alterações de pressão no líquido circundante, provocando a formação e o colapso de pequenas bolhas num processo conhecido como cavitação. Estas bolhas geram forças mecânicas localizadas altamente intensas que podem romper as células e libertar o seu conteúdo para a solução circundante.
A lise celular utilizando um ultrassom envolve normalmente os seguintes passos:
- A amostra é colocada num tubo ou recipiente com um tampão líquido.
- Uma sonda ultra-sónica é inserida na amostra e são aplicadas ondas sonoras de alta frequência com cerca de 20-30 kHz.
- As ondas de ultrassom causam oscilação e cavitação no líquido circundante, gerando forças localizadas que rompem as células e liberam seu conteúdo.
- A amostra é centrifugada ou filtrada para remover quaisquer detritos celulares e o conteúdo extraído é recolhido para análise a jusante.
Desvantagens dos métodos de lise comuns
Durante o seu trabalho em laboratórios, pode já ter experimentado o incómodo da lise celular utilizando protocolos tradicionais de lise mecânica ou química.
- Lise mecânica: Os métodos de lise mecânica, como a trituração com almofariz e pilão ou a homogeneização utilizando uma prensa francesa, moinho de esferas ou sistema rotor-estator, carecem frequentemente de controlo preciso e de opções de ajuste. Isto significa que a utilização de moagem e trituração pode gerar rapidamente calor e forças de cisalhamento que podem danificar a amostra e desnaturar as proteínas. Podem também ser demorados e exigir grandes quantidades de material de partida.
- Lise química: Os métodos de lise química, como a lise à base de detergentes, podem danificar a amostra ao romper a bicamada lipídica e desnaturar as proteínas. Podem também exigir vários passos e deixar contaminantes residuais que interferem com as aplicações a jusante. Encontrar a dosagem ideal de detergente é um desafio adicional.
- Ciclos de congelação-descongelação: Os ciclos de congelação-descongelação podem provocar a rutura das membranas celulares, mas os ciclos repetidos podem também provocar a desnaturação e a degradação das proteínas. Este método pode também exigir múltiplos ciclos, o que pode ser moroso e resulta frequentemente em rendimentos mais baixos.
- Lise enzimática: Os métodos de lise enzimática podem ser específicos para determinados tipos de células e requerem várias etapas, o que os torna morosos. Também geram resíduos e requerem uma otimização cuidadosa para evitar a degradação da amostra. Os kits de lise enzimática são frequentemente dispendiosos. Se o procedimento de lise enzimática atual não der resultados suficientes, pode aplicar-se a sonicação como método sinérgico para intensificar a rutura celular.
Em contraste com os métodos convencionais de lise celular mecânica e química, a sonicação é uma ferramenta muito eficiente e fiável para a desintegração celular que permite um controlo completo dos parâmetros de sonicação. Isso garante uma alta seletividade na liberação de materiais e pureza do produto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
É adequado para todos os tipos de células e facilmente aplicável em pequena e grande escala – sempre em condições controladas. Os ultrassons são fáceis de limpar. Um homogeneizador ultrassónico possui sempre a função de limpeza no local (CIP) e esterilização no local (SIP). O sonotrodo consiste num corno maciço de titânio que pode ser limpo ou lavado com água ou solvente (dependendo do meio de trabalho). Devido à sua robustez, a manutenção dos ultrassons é praticamente negligenciável.
Lise ultra-sónica e rutura celular
Geralmente, a lise das amostras no laboratório demora entre 15 segundos e 2 minutos. Uma vez que a intensidade da sonicação é muito fácil de ajustar através da definição da amplitude e do tempo de sonicação, bem como através da escolha do equipamento adequado, é possível romper as membranas celulares de forma muito suave ou muito abrupta, dependendo da estrutura celular e do objetivo da lise (por exemplo, a extração de ADN requer uma sonicação mais suave, a extração completa de proteínas de bactérias requer um tratamento de ultra-sons mais intenso). A temperatura durante o processo pode ser monitorizada por um sensor de temperatura integrado e pode ser facilmente controlada por arrefecimento (banho de gelo ou células de fluxo com camisas de arrefecimento) ou por sonicação em modo pulsado. Durante a sonicação em modo pulsado, os ciclos curtos de sonicação de 1-15 segundos de duração permitem a dissipação do calor e o arrefecimento durante os períodos intermitentes mais longos.
Todos os processos conduzidos por ultra-sons são completamente reprodutíveis e linearmente escaláveis.
O VialTweeter é um homogeneizador ultrassónico para a preparação simultânea, uniforme e rápida de numerosas amostras.
- Preparação da suspensão celular: Os pellets de células devem ser completamente suspensos numa solução-tampão por homogeneização (escolher uma solução-tampão compatível com a análise seguinte, por exemplo, método cromatográfico específico). Adicionar lisozimas e/ou outros aditivos, se necessário (devem também ser compatíveis com os meios de separação/purificação). Misturar/homogeneizar a solução suavemente com uma ligeira sonicação até obter uma suspensão completa.
Leia mais sobre as sinergias das lisozimas combinadas com a sonicação! - Lise por ultra-sons: Colocar a amostra num banho de gelo. Para romper as células, sonicar a suspensão em rajadas de 60-90 segundos (utilizando o modo de impulso do sonicador).
- Separação: Centrifugar o lisado (por exemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separar cuidadosamente o sobrenadante do pellet de células. O sobrenadante é o lisado celular total. Após filtração do sobrenadante, obtém-se um líquido clarificado de proteínas celulares solúveis.
As aplicações mais comuns dos ultrassons em biologia e biotecnologia são:
- Preparação do extrato celular
- Perturbação de leveduras, bactérias, células vegetais, tecidos celulares moles ou duros, material nucleico
- Extração de proteínas
- Preparação e isolamento de enzimas
- Produção de antigénios
- Extração de ADN e/ou fragmentação orientada
- preparação de lipossomas
A rutura de células com um ultrassom de tipo sonda é um método eficiente de preparação de amostras.
As múltiplas aplicações dos ultra-sons ramificam-se nos sectores da biotecnologia, da bioengenharia, da microbiologia, da biologia molecular, da bioquímica, da imunologia, da bacteriologia, da virologia, da proteómica, da genética, da fisiologia, da biologia celular, da hematologia e da botânica.
Lise: Quebrando as estruturas celulares
As células são protegidas por uma membrana plasmática semi-permeável que consiste numa bicamada fosfo-lipídica (também bicamada proteico-lipídica; formada por lípidos hidrofóbicos e moléculas de fósforo hidrofílicas com moléculas de proteínas incorporadas) e cria uma barreira entre o interior das células (citoplasma) e o meio extracelular. As células vegetais e as células procarióticas estão rodeadas por uma parede celular. Devido à espessura da parede celular, constituída por várias camadas de celulose, as células vegetais são mais difíceis de lisar do que as células animais. O interior da célula, como os organelos, o núcleo e as mitocôndrias, é estabilizado pelo citoesqueleto.
Ao lisar as células, o objetivo é extrair e separar os organelos, as proteínas, o ADN, o ARNm ou outras biomoléculas.
Métodos convencionais de lise celular e suas desvantagens
Existem vários métodos para lisar células, que podem ser divididos em métodos mecânicos e químicos, que incluem a utilização de detergentes ou solventes, a aplicação de alta pressão, ou a utilização de um moinho de esferas ou de uma prensa francesa. A desvantagem mais problemática destes métodos é o difícil controlo e ajuste dos parâmetros do processo e, consequentemente, o seu impacto.
O quadro seguinte apresenta as principais desvantagens dos métodos de lise mais comuns:
Tabela: Os métodos convencionais de lise celular têm grandes desvantagens
Procedimento de lise
A lise é um processo sensível. Durante a lise, a proteção da membrana celular é destruída, mas a inativação, desnaturação e degradação das proteínas extraídas por um ambiente não fisiológico (desvio do valor de pH) devem ser evitadas. Por conseguinte, em geral, a lise é efectuada numa solução-tampão. A maior parte das dificuldades advém da rutura descontrolada das células, que resulta numa libertação não orientada de todo o material intracelular e/ou na desnaturação do produto-alvo.
Perguntas frequentes sobre Sonicação e Lise Celular
- É possível lisar células com sonicação? Sim, a sonicação lisa eficazmente as células utilizando ondas ultra-sónicas de alta frequência que induzem a cavitação, um fenómeno em que se formam pequenas bolhas de vapor que colapsam violentamente dentro da suspensão celular. As forças mecânicas resultantes rompem as membranas celulares e facilitam a libertação de componentes intracelulares para o líquido.
- Como utilizar um sonicador para a lise celular? A utilização de um sonicador para a lise de células envolve a imersão da sonda do sonicador numa suspensão de células e o ajuste de parâmetros como a amplitude e a duração do impulso. O processo deve ser monitorizado de perto para otimizar a rutura das células, minimizando a desnaturação das proteínas e a inativação das enzimas.
- Qual é o princípio da sonicação para a lise celular? A sonicação funciona segundo o princípio da cavitação acústica. A energia ultra-sónica é transmitida para o meio líquido, provocando rápidas flutuações de pressão que levam à formação e implosão de microbolhas. Estas implosões geram forças de cisalhamento intensas e altas temperaturas localizadas, rompendo as estruturas celulares e aumentando a homogeneidade do lisado.
- Quanto tempo demora a sonicação da lise celular? A duração da sonicação para lise celular pode variar significativamente, dependendo de factores como o tipo de célula, a densidade celular, a potência do sonicador e o protocolo específico utilizado. Os procedimentos típicos podem variar entre alguns segundos e alguns minutos, sendo frequentemente efectuados em ciclos para gerir a produção de calor e garantir uma rutura uniforme das células.
- Qual é o objetivo da sonicação na extração de proteínas? Na extração de proteínas, a sonicação serve para romper eficazmente as membranas celulares e solubilizar as proteínas. Este método é particularmente útil para libertar proteínas do interior dos compartimentos celulares, o que o torna essencial para preparar lisados a partir dos quais as proteínas vão ser purificadas ou analisadas.
- Porque é que a sonicação é utilizada para a extração? A sonicação é preferida para a extração devido à sua ação rápida e à sua capacidade de aplicar uma energia direcionada, quebrando as estruturas celulares para libertar moléculas bioactivas sem a utilização de tratamentos químicos agressivos, preservando assim a integridade funcional dos compostos extraídos.
- A sonicação perturba as interações proteína-proteína? Embora a sonicação possa efetivamente romper as membranas celulares, pode também romper as interações proteína-proteína. O nível de perturbação depende da intensidade da sonicação e da duração da exposição, podendo levar à desnaturação ou dissociação de complexos proteicos, o que pode afetar estudos analíticos ou funcionais subsequentes.
- A sonicação pode ser utilizada para lisar a E. coli? Os sonicadores Hielscher são particularmente eficazes para lisar células bacterianas, como a E. coli, que têm paredes celulares robustas. A técnica fornece um método físico para cisalhar a parede celular e a membrana, tornando-a um método preferido para preparar lisados bacterianos em laboratórios de biologia molecular e bioquímica.
- Quais são os processos subsequentes ao passo de sonicação?
As etapas a jusante após a lise ultra-sónica incluem normalmente o fracionamento do lisado, o isolamento específico de organelos e a extração ou purificação adicional de proteínas.
O lisado processado é então separado e preparado para aplicações analíticas ou funcionais, tais como proteómica de alta resolução, transcriptómica ou estudos de ligação a receptores.
Literatura/Referências
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.