Sonicação para Lise Celular: Ruptura e Extração Celular
A lise celular ultrassônica é um procedimento de preparação de amostras em laboratórios de biotecnologia. O objetivo é romper as paredes celulares ou células inteiras para liberar moléculas biológicas. A sonicação é comumente usada para lise celular, ruptura celular e extração. A principal vantagem dos sonicadores para lise celular reside no controle preciso dos parâmetros do processo, como intensidade e temperatura, permitindo uma interrupção e extração celular suave, mas eficiente.
Lise celular usando ultrassom
A lise celular ultrassônica usa ondas sonoras de alta frequência para quebrar as células abertas e extrair seu conteúdo. A sonicação é estabelecida e confiável para a ruptura celular e extração de material intracelular, como plasmídeos, ensaios de receptores, proteínas, DNA e RNA. Ao ajustar os parâmetros do processo, a intensidade ultrassônica pode ser ajustada para atender aos requisitos específicos da aplicação, variando de sonicação suave a intensa. As etapas seguintes à lise incluem fracionamento, isolamento de organelas e extração e purificação de proteínas. O lisado resultante deve ser separado para investigações ou aplicações adicionais, como pesquisa proteômica.
Se você quiser saber mais sobre sonicação para lise, ruptura celular e extração, entre em contato conosco. Nossa equipe técnica terá prazer em trabalhar com você em seu projeto de lise celular.
Homogeneizadores ultrassônicos UP100H (100 watts) e UP400St (400 watts): Sonicação para lise e extração celular.
Vantagens de usar a sonicação para lise celular
Em comparação com outros métodos de lise e extração celular, a lise celular ultrassônica tem várias vantagens:
- Velocidade: A lise e extração celular ultrassônica é um método rápido que pode quebrar células abertas em questão de segundos. Isso é muito mais rápido do que outros métodos, como homogeneização, congelamento e descongelamento ou fresagem de contas.
- Eficiência: A lise e extração celular ultrassônica podem ser usadas para tratar amostras pequenas, grandes ou múltiplas de uma só vez, tornando-a mais eficiente do que outros métodos que requerem processamento individual de amostras pequenas.
- Sem produtos químicos: A lise e extração celular ultrassônica é um método não invasivo que não requer o uso de produtos químicos ou enzimas agressivas. Isso o torna ideal para aplicações em que a integridade do conteúdo da célula precisa ser mantida. A contaminação indesejada de amostras pode ser evitada.
- Alto rendimento: A lise e extração celular ultrassônica podem extrair um alto rendimento de conteúdo celular, incluindo DNA, RNA e proteínas. Isso ocorre porque as ondas sonoras de alta frequência abrem as paredes celulares e liberam o conteúdo na solução circundante.
- Controle de temperatura: Ultrasonciadores sofisticados permitem o controle preciso da temperatura da amostra. Os sonicadores digitais Hielscher são equipados com um sensor de temperatura conectável e software de monitoramento de temperatura.
- Reprodutíveis: Os protocolos para lise celular ultrassônica podem ser facilmente reproduzidos e até mesmo combinados com diferentes volumes de amostra maiores ou menores por um simples aumento de escala linear.
- Versátil: A lise e extração celular ultrassônica podem ser usadas para extrair uma ampla gama de tipos de células, incluindo bactérias, leveduras, fungos, células vegetais e de mamíferos. Também pode ser usado para extrair diferentes tipos de moléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA e lipídios.
- Preparação simultânea de várias amostras: A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para processar confortavelmente várias amostras exatamente nas mesmas condições de processo. Isso torna a etapa de preparação da amostra de lise e extração altamente eficiente e economiza tempo.
- Fácil de usar: O equipamento ultrassônico de lise e extração celular é fácil de usar e requer treinamento mínimo. O equipamento também é econômico, pois é um investimento único, sem necessidade de recompra de alienações. Isso o torna atraente para uma ampla gama de pesquisadores e laboratórios.
No geral, a lise e extração celular ultrassônica é um método rápido, eficiente, controlável com precisão e versátil para extrair conteúdo celular. Suas vantagens sobre os métodos alternativos o tornam uma escolha atraente para uma ampla gama de aplicações industriais e de pesquisa.
Princípio de funcionamento da lise celular ultrassônica
A lise e extração celular ultrassônica usa ondas sonoras de alta frequência para interromper as células e extrair seu conteúdo. As ondas sonoras criam mudanças de pressão no líquido circundante, fazendo com que pequenas bolhas se formem e colapsem em um processo conhecido como cavitação. Essas bolhas geram forças mecânicas localizadas altamente intensas que podem quebrar as células abertas e liberar seu conteúdo na solução circundante.
A lise celular usando um ultrassônico geralmente envolve as seguintes etapas:
- A amostra é colocada em um tubo ou recipiente com um tampão líquido.
- Uma sonda ultrassônica é inserida na amostra e ondas sonoras de alta frequência com aprox. 20-30 kHz são aplicadas.
- As ondas de ultrassom causam oscilação e cavitação no líquido circundante, gerando forças localizadas que quebram as células abertas e liberam seu conteúdo.
- A amostra é centrifugada ou filtrada para remover quaisquer detritos celulares e o conteúdo extraído é coletado para análise a jusante.
Poderosas ondas de ultrassom interrompem a matriz celular das estruturas biológicas e liberam os compostos bioativos. A transferência de massa entre o material vegetal e o solvente (por exemplo, tampão) é intensificada. (gráfico: ©Vilkhu et al., 2006)
Desvantagens dos métodos comuns de lise
Durante seu trabalho em laboratórios, você já deve ter experimentado o incômodo da lise celular usando protocolos tradicionais de lise mecânica ou química.
- Lise mecânica: Métodos de lise mecânica, como moagem com almofariz e pilão ou homogeneização usando uma prensa francesa, moinho de esferas ou sistema rotor-estator, muitas vezes carecem de opções de controle e ajuste de precisão. Isso significa que o uso de moagem e moagem pode gerar rapidamente calor e forças de cisalhamento que podem danificar a amostra e desnaturar as proteínas. Eles também podem ser demorados e exigir grandes quantidades de material de partida.
- Lise química: Métodos de lise química, como lise à base de detergente, podem danificar a amostra, interrompendo a bicamada lipídica e desnaturando as proteínas. Eles também podem exigir várias etapas e podem deixar contaminantes residuais que interferem nas aplicações a jusante. Encontrar a dosagem ideal de detergente é um desafio adicional.
- Ciclos de congelamento e descongelamento: Os ciclos de congelamento e descongelamento podem causar a ruptura das membranas celulares, mas ciclos repetidos também podem causar desnaturação e degradação de proteínas. Esse método também pode exigir vários ciclos, o que pode ser demorado e geralmente resulta em rendimentos mais baixos.
- Lise enzimática: Os métodos de lise enzimática podem ser específicos para certos tipos de células e requerem várias etapas, tornando-os demorados. Eles também geram resíduos e requerem otimização cuidadosa para evitar a degradação da amostra. Os kits de lise enzimática costumam ser caros. Se o seu procedimento de lise enzimática atual der resultados insuficientes, a sonicação como método sinérgico pode ser aplicada para intensificar a ruptura celular.
Em contraste com os métodos convencionais de lise celular mecânica e química, a sonicação é uma ferramenta muito eficiente e confiável para a desintegração celular que permite um controle completo sobre os parâmetros de sonicação. Isso garante uma alta seletividade na liberação de materiais e na pureza do produto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
É adequado para todos os tipos de células e facilmente aplicável em pequena e grande escala – sempre sob condições controladas. Os ultrassônicos são fáceis de limpar. Um homogeneizador ultrassônico sempre apresenta a função de limpeza no local (CIP) e esterilização no local (SIP). O sonotrodo consiste em um chifre de titânio maciço que pode ser limpo ou lavado em água ou solvente (dependendo do meio de trabalho). A manutenção dos ultrasonicadores deve-se à sua robustez quase negligenciável.
Lise ultrassônica e ruptura celular
Geralmente, a lise das amostras no laboratório leva entre 15 segundos e 2 minutos. Como a intensidade da sonicação é muito fácil de ajustar definindo a amplitude de um tempo de sonicação, bem como escolhendo o equipamento certo, é possível romper as membranas celulares de forma muito suave ou muito abrupta, dependendo da estrutura celular e da finalidade da lise (por exemplo, a extração de DNA requer uma sonicação mais suave, a extração completa de proteínas de bactérias requer um tratamento de ultrassom mais intenso). A temperatura durante o processo pode ser monitorada por um sensor de temperatura integrado e pode ser facilmente controlada por resfriamento (banho de gelo ou células de fluxo com camisas de resfriamento) ou por sonicação em modo pulsado. Durante a sonicação em modo de pulso, ciclos curtos de explosão de sonicação de 1 a 15 segundos de duração permitem a dissipação de calor e o resfriamento durante os períodos intermitentes mais longos.
Todos os processos orientados por ultrassom são completamente reprodutíveis e linearmente escaláveis.
O VialTweeter é um homogeneizador ultrassônico para preparação estéril simultânea, uniforme e rápida de inúmeras amostras.
Homogeneizadores ultrassônicos para lise e extração celular
Vários tipos de dispositivos ultrassônicos permitem corresponder ao objetivo de preparação da amostra e garantir facilidade de uso e conforto de operação. Os ultrassônicos do tipo sonda são os dispositivos mais comuns no laboratório. Eles são mais adequados para a preparação de amostras pequenas e médias com volumes de 0,1mL até 1000mL. Diferentes tamanhos de potência e sonotrodos permitem adaptar o ultrassônico ao volume da amostra e ao vaso para obter resultados de sonicação mais eficazes e eficientes. O dispositivo de sonda ultrassônica é a melhor escolha quando amostras únicas precisam ser preparadas.
Se mais amostras tiverem que ser preparadas, por exemplo, 8-10 frascos de solução celular, uma sonicação indireta intensa com sistemas ultrassônicos como o VialTweeter ou um cuphorn ultrassônico são o método de homogeneização mais adequado para uma lise eficiente. Vários frascos são sonicados ao mesmo tempo, com a mesma intensidade. Isso economiza não apenas tempo, mas também garante o mesmo tratamento de todas as amostras, o que torna os resultados entre as amostras confiáveis e comparáveis. Além disso, durante a sonicação indireta, evita-se a contaminação cruzada por imersão do sonotrodo ultrassônico (também conhecido como sonda ultrassônica, chifre, ponta ou dedo). Uma vez que são usados frascos combinados individualmente para o tamanho da amostra, a limpeza demorada e a perda de amostras devido à decantação dos recipientes são omitidas. Para a sonicação uniforme de placas multipoços ou microtitulação, a Hielscher oferece o UIP400MTP.
Para volumes maiores, por exemplo, para a produção comercial de extratos celulares, os sistemas ultrassônicos contínuos com um reator de célula de fluxo são os mais adequados. O fluxo contínuo e uniforme do material processado garante uma sonicação uniforme. Todos os parâmetros do processo de desintegração ultrassônica podem ser otimizados e ajustados aos requisitos da aplicação e ao material específico da célula.
Procedimento exemplar para lisagem ultrassônica de células bacterianas:
- Preparação da suspensão celular: Os grânulos celulares devem ser completamente suspensos numa solução tampão por homogeneização (escolha a sua solução tampão compatível com a análise a seguir, por exemplo, método de cromatografia específico). Adicionar lisozimas e/ou outros aditivos, se necessário (devem ser também compatíveis com meios de separação/purificação). Misturar / homogeneizar a solução suavemente sob sonicação suave até obter uma suspensão completa.
- Lise ultrassônica: Coloque a amostra em um banho de gelo. Para interrupção celular, sonice a suspensão em rajadas de 60-90 segundos (usando o modo de pulso do seu sonicador).
- Separação: Centrifugue o lisado (por exemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4°C). Separe cuidadosamente o sobrenadante do pellet celular. O sobrenadante é o lisado celular total. Após a filtração do sobrenadante, obtém-se um fluido clarificado da proteína celular solúvel.
As aplicações mais comuns para ultrassônicos em biologia e biotecnologia são:
- Preparação de extrato celular
- Ruptura de leveduras, bactérias, células vegetais, tecido celular mole ou duro, material nucléico
- extração de proteínas
- Preparação e isolamento de enzimas
- Produção de antigénios
- Extração de DNA e/ou fragmentação direcionada
- Preparação de lipossomas
A ruptura celular com ultrassônico tipo sonda é um método eficiente de preparação de amostras.
A tabela abaixo fornece uma visão geral sobre nossos ultrassônicos para ruptura e extração celular. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador ultrassônico. Nossa equipe técnica bem treinada e experiente terá prazer em ajudá-lo a escolher o ultrassônico mais adequado para suas amostras!
| Volume do lote | Vazão | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| até 10 frascos ou tubos | n.a. | VialTweeter |
| placas multipoços / microtitulação | n.a. | UIP400MTP |
| vários tubos / vasos | n.a. | cuphorn |
| 1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP400St |
As múltiplas aplicações do ultrassom se ramificam nos setores de biotecnologia, bioengenharia, microbiologia, biologia molecular, bioquímica, imunologia, bacteriologia, virologia, proteômica, genética, fisiologia, biologia celular, hematologia e botânica.
Lysis: Quebrando estruturas celulares
As células são protegidas por uma membrana plasmática semipermeável que consiste em uma bicamada fosfolipídica (também bicamada proteína-lipídio; formada por lipídios hidrofóbicos e moléculas de fósforo hidrofílicas com moléculas de proteína incorporadas) e cria uma barreira entre o interior da célula (citoplasma) e o ambiente extracelular. As células vegetais e as células procarióticas são circundadas por uma parede celular. Devido à parede celular espessa de múltiplas camadas de celulose, as células vegetais são mais difíceis de lisar do que as células animais. O interior da célula, como organelas, núcleo, mitocôndria, é estabilizado pelo citoesqueleto.
Ao lisar as células, destina-se a extrair e separar as organelas, proteínas, DNA, mRNA ou outras biomoléculas.
Métodos convencionais de lise celular e suas desvantagens
Existem vários métodos para lisar células, que podem ser divididos em métodos mecânicos e químicos, que incluem o uso de detergentes ou solventes, a aplicação de alta pressão ou o uso de um moinho de esferas ou de uma prensa francesa. A desvantagem mais problemática desses métodos é o difícil controle e ajuste dos parâmetros do processo e, portanto, do impacto.
A tabela abaixo mostra as principais desvantagens dos métodos comuns de lise:
Tabela: Métodos convencionais de lise celular têm grandes desvantagens
Procedimento de lise
A lise é um processo sensível. Durante a lise a proteção da membrana celular é destruída, porém a inativação, desnaturação e degradação das proteínas extraídas por um ambiente não fisiológico (desvio do valor de pH) devem ser evitadas. Portanto, em geral, a lise é realizada em uma solução tampão. A maioria das dificuldades surge da ruptura celular descontrolada, resultando em uma liberação não direcionada de todo o material intracelular ou / e na desnaturação do produto alvo.
Perguntas frequentes sobre sonicação e lise celular
- Você pode lisar células com sonicação? Sim, a sonicação lisa efetivamente as células usando ondas ultrassônicas de alta frequência que induzem a cavitação, um fenômeno em que pequenas bolhas de vapor se formam e colapsam violentamente dentro da suspensão celular. As forças mecânicas resultantes rompem as membranas celulares e facilitam a liberação de componentes intracelulares no líquido.
- Como usar um sonicador para lise celular? A utilização de um sonicador para lise celular envolve a imersão da sonda sonicadora em uma suspensão celular e o ajuste de parâmetros como amplitude e duração do pulso. O processo deve ser monitorado de perto para otimizar a ruptura celular, minimizando a desnaturação de proteínas e a inativação enzimática.
- Qual é o princípio da sonicação para lise celular? A sonicação opera com base no princípio da cavitação acústica. A energia ultrassônica é transmitida para o meio líquido, causando rápidas flutuações de pressão que levam à formação e implosão de microbolhas. Essas implosões geram intensas forças de cisalhamento e altas temperaturas localizadas, interrompendo as estruturas celulares e aumentando a homogeneidade do lisado.
- Quanto tempo leva a sonicação da lise celular? A duração da sonicação para lise celular pode variar significativamente dependendo de fatores como tipo de célula, densidade celular, potência do sonicador e o protocolo específico usado. Os procedimentos típicos podem variar de vários segundos a alguns minutos, geralmente realizados em ciclos para gerenciar a geração de calor e garantir a interrupção uniforme das células.
- Qual é o objetivo da sonicação na extração de proteínas? Na extração de proteínas, a sonicação serve para romper eficientemente as membranas celulares e solubilizar proteínas. Este método é particularmente útil para liberar proteínas de dentro dos compartimentos celulares, tornando-o essencial para a preparação de lisados dos quais as proteínas devem ser purificadas ou analisadas.
- Por que a sonicação é usada para extração? A sonicação é favorecida para extração devido à sua ação rápida e capacidade de aplicar energia direcionada, quebrando estruturas celulares para liberar moléculas bioativas sem o uso de tratamentos químicos agressivos, preservando assim a integridade funcional dos compostos extraídos.
- A sonicação interrompe as interações proteína-proteína? Embora a sonicação possa efetivamente perturbar as membranas celulares, ela também pode interromper as interações proteína-proteína. O nível de interrupção depende da intensidade da sonicação e da duração da exposição, podendo levar à desnaturação ou dissociação de complexos proteicos, o que pode afetar estudos analíticos ou funcionais subsequentes.
- A sonicação pode ser usada para lisar E. coli? Os sonicadores de Hielscher são particularmente eficazes para lisar células bacterianas como E. coli, que possuem paredes celulares robustas. A técnica fornece um método físico para cisalhar a parede celular e a membrana, tornando-se um método preferido para a preparação de lisados bacterianos em laboratórios de biologia molecular e bioquímica.
Literatura/Referências
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.