Sonicação para lise celular: rutura celular e extração

A lise celular ultrassónica é uma técnica de preparação de amostras amplamente utilizada nos laboratórios modernos de biotecnologia. O seu principal objetivo é romper as membranas celulares ou as células inteiras para libertar componentes intracelulares, como proteínas, ácidos nucleicos ou organelos. No trabalho laboratorial diário, isto significa que a sonicação é um método padrão para a rutura celular controlada e a extração eficiente de biomoléculas. A principal vantagem dos sonicadores reside na sua capacidade de modular com precisão parâmetros críticos do processo, incluindo a intensidade dos ultrassons, a pulsação e o controlo da temperatura. Este controlo permite aos investigadores obter uma lise fiável, minimizando os danos térmicos ou mecânicos nas biomoléculas sensíveis, o que resulta num processo de extração suave, mas altamente eficiente.

Lise celular com sonicadores

A lise celular ultrassónica utiliza a cavitação acústica para romper as membranas celulares e libertar moléculas intracelulares. A Hielscher Ultrasonics disponibiliza o sonicador clássico de tipo sonda, bem como sonicadores para múltiplas amostras destinados ao processamento em condições estéreis: o VialTweeter para múltiplos tubos e frascos e o sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP para microplacas padrão.

A Hielscher Ultrasonics fornece sonicadores potentes sem contacto para a preparação de amostras e análises clínicas. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP, o VialTweeter, o CupHorn e o sonicador de fluxo GDmini2 processam as amostras em condições estéreis.

Sonicação com os desintegradores laboratoriais UP100H e UP400St para a preparação de amostras. (homogeneização, lise celular, extração)

Homogeneizadores ultrassónicos UP100H (100 watts) e UP400St (400 watts): sonicação para lise celular e extração.

Homogeneizadores ultrassónicos para lise celular e extração

Tipo de dispositivo ultrassónico	Aplicação principal	Volume da amostra	Utilização típica	Vantagens	Exemplos de modelos
Sonicadores de tipo sonda	Sonicação de uma única amostra	0,1 mL a ~1000 mL	Lise celular, extração de proteínas, fragmentação de DNA/RNA	Controlo preciso da energia; vários sonotrodos; ideal para amostras pequenas a médias	UP100H, UP200St, UP400St
VialTweeter / CupHorn	Processamento em paralelo de múltiplos frascos selados	8–10 frascos (~1–20 mL cada)	Lise padronizada de múltiplas suspensões celulares	Sonicação uniforme; evita a contaminação cruzada; resultados reprodutíveis	VialTweeter, CupHorn
Sonicador de placas de 96 poços	Sonicação de placas multipoços e de microtitulação	Formato de microplaca	Rastreio de elevada capacidade de processamento, proteómica, ensaios celulares	Sonicação simultânea e uniforme em todos os poços; ideal para fluxos de trabalho com múltiplas amostras	UIP400MTP
Reatores com célula de fluxo	Sonicação contínua para volumes maiores	>1 L, escalável	Rutura celular à escala industrial, produção de extratos	Processamento contínuo; escalável; controlo total do processo (amplitude, pressão, temperatura)	UIP1000hdT, UIP2000hdT + célula de fluxo
Sistemas de sonicação estéril / indireta	Processamento de amostras sem contaminação	Dependente do frasco/tubo/microplaca	Amostras sensíveis, ambientes estéreis, contextos regulamentados	Sem contacto com a sonda; evita a transferência de resíduos entre amostras; esforço mínimo de limpeza	VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP

Vantagens da utilização da sonicação para lise celular

Em comparação com outros métodos de lise celular e extração, a lise celular ultrassónica apresenta várias vantagens:

Rapidez: A lise celular e extração ultrassónicas constituem um método rápido que pode romper as células em poucos segundos. Este método é muito mais rápido do que outros, como a homogeneização, a congelação e descongelação ou a moagem em moinho de esferas.
Eficiência: A lise celular e extração ultrassónicas podem ser utilizadas para tratar amostras pequenas, grandes ou múltiplas amostras de uma só vez, tornando este método mais eficiente do que outros que exigem o processamento individual de pequenas amostras.
Sem produtos químicos: A lise celular e extração ultrassónicas constituem um método não invasivo que não requer a utilização de produtos químicos agressivos ou enzimas. Isto torna este método ideal para aplicações em que é necessário manter a integridade do conteúdo celular. É possível evitar a contaminação indesejada das amostras.
Elevado rendimento: A lise celular e extração ultrassónicas permitem extrair o conteúdo celular com elevado rendimento, incluindo DNA, RNA e proteínas. Isto deve-se ao facto de as ondas sonoras de alta frequência romperem as paredes celulares e libertarem o conteúdo para a solução circundante.
Controlo da temperatura: Sonicadores sofisticados permitem um controlo preciso da temperatura da amostra. Os sonicadores digitais Hielscher estão equipados com um sensor de temperatura conectável e software de monitorização da temperatura.
Reprodutibilidade: Os protocolos de lise celular ultrassónica podem ser facilmente reproduzidos e até adaptados a diferentes volumes de amostra, maiores ou menores, através de um simples aumento linear de escala.
Versatilidade: A lise celular e extração ultrassónicas podem ser utilizadas para extrair uma ampla variedade de tipos celulares, incluindo bactérias, leveduras, fungos, células vegetais e células de mamíferos. Também podem ser utilizadas para extrair diferentes tipos de moléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA e lípidos.
Preparação simultânea de numerosas amostras: A Hielscher Ultrasonics disponibiliza várias soluções para processar comodamente numerosas amostras exatamente nas mesmas condições de processo. Isto torna a etapa de preparação de amostras por lise e extração altamente eficiente e permite poupar tempo.
Facilidade de utilização: O equipamento de lise celular e extração ultrassónicas é fácil de utilizar e requer uma formação mínima. O equipamento é também económico, pois constitui um investimento único, sem necessidade de voltar a adquirir consumíveis descartáveis. Isto torna-o atrativo para uma ampla variedade de investigadores e laboratórios.

De um modo geral, a lise celular e extração ultrassónicas constituem um método rápido, eficiente, controlável com precisão e versátil para extrair o conteúdo celular. As suas vantagens face aos métodos alternativos tornam este método uma opção atrativa para uma ampla variedade de aplicações de investigação e industriais.

Este tutorial explica qual o tipo de sonicador mais adequado às suas tarefas de preparação de amostras, como lise, rutura celular, isolamento de proteínas e fragmentação de ADN e ARN em laboratórios, análise e investigação. Escolha o tipo de sonicador ideal para a sua aplicação, volume e número de amostras e capacidade de processamento. A Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultrassónico ideal para si!

Princípio de funcionamento da lise celular ultrassónica

A lise celular e extração ultrassónicas utilizam ondas sonoras de alta frequência para romper as células e extrair o seu conteúdo. As ondas sonoras criam variações de pressão no líquido circundante, provocando a formação e o colapso de pequenas bolhas num processo conhecido como cavitação. Estas bolhas geram forças mecânicas localizadas de intensidade muito elevada, que podem romper as células e libertar o seu conteúdo para a solução circundante.

A lise celular com um sonicador envolve habitualmente os seguintes passos:

A amostra é colocada num tubo ou recipiente com uma solução tampão líquida.
É inserida uma sonda ultrassónica na amostra e são aplicadas ondas sonoras de alta frequência de aprox. 20–30 kHz.
As ondas ultrassónicas provocam oscilação e cavitação no líquido circundante, gerando forças localizadas que rompem as células e libertam o seu conteúdo.
A amostra é centrifugada ou filtrada para remover quaisquer detritos celulares, e o conteúdo extraído é recolhido para análise subsequente.

Desvantagens dos métodos de lise comuns

Durante o seu trabalho em laboratório, poderá já ter sentido as dificuldades da lise celular com protocolos tradicionais de lise mecânica ou química.

Lise mecânica: Os métodos de lise mecânica, como a trituração com almofariz e pilão ou a homogeneização com uma prensa francesa, um moinho de esferas ou um sistema rotor-estator, frequentemente não oferecem opções de controlo e ajuste precisos. Isto significa que a moagem e a trituração podem gerar rapidamente calor e forças de cisalhamento que podem danificar a amostra e desnaturar as proteínas. Estes métodos também podem ser demorados e exigir grandes quantidades de material de partida.
Lise química: Os métodos de lise química, como a lise à base de detergentes, podem danificar a amostra ao romper a bicamada lipídica e desnaturar as proteínas. Também podem exigir várias etapas e podem deixar contaminantes residuais que interferem com as aplicações subsequentes. Encontrar a dosagem ótima de detergente é um desafio adicional.
Ciclos de congelação e descongelação: Os ciclos de congelação e descongelação podem provocar a rutura das membranas celulares, mas a repetição dos ciclos também pode causar a desnaturação e degradação das proteínas. Este método também pode exigir vários ciclos, o que pode ser demorado e resulta frequentemente em rendimentos inferiores.
Lise enzimática: Os métodos de lise enzimática podem ser específicos de determinados tipos celulares e exigir várias etapas, tornando-os demorados. Também geram resíduos e requerem uma otimização cuidadosa para evitar a degradação da amostra. Os kits de lise enzimática são frequentemente caros. Se o seu procedimento atual de lise enzimática produzir resultados insuficientes, pode aplicar a sonicação como método sinérgico para intensificar a rutura celular.

Em contraste com os métodos convencionais de lise celular mecânica e química, a sonicação é uma ferramenta muito eficiente e fiável para a desintegração celular, que permite um controlo completo dos parâmetros de sonicação. Isto garante uma elevada seletividade na libertação de materiais e uma elevada pureza do produto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
É adequada a todos os tipos celulares e facilmente aplicável a pequena e grande escala – sempre em condições controladas. Os sonicadores são fáceis de limpar. Um homogeneizador ultrassónico dispõe sempre de funções de limpeza no local (CIP) e esterilização no local (SIP). O sonotrodo consiste numa peça maciça de titânio que pode ser limpa com um pano ou lavada com água ou solvente (dependendo do meio de trabalho). Devido à sua robustez, a manutenção dos sonicadores é quase negligenciável.

Lise ultrassónica e rutura celular

Em geral, a lise de amostras em laboratório demora entre 15 segundos e 2 minutos. Como a intensidade da sonicação é muito fácil de ajustar através da definição da amplitude e do tempo de sonicação, bem como da escolha do equipamento adequado, é possível romper as membranas celulares de forma muito suave ou muito abrupta, dependendo da estrutura celular e do objetivo da lise (por exemplo, a extração de DNA requer uma sonicação mais suave, enquanto a extração completa de proteínas de bactérias requer um tratamento ultrassónico mais intenso). A temperatura durante o processo pode ser monitorizada por um sensor de temperatura integrado e facilmente controlada por arrefecimento (banho de gelo ou células de fluxo com camisas de arrefecimento) ou por sonicação em modo pulsado. Durante a sonicação em modo pulsado, ciclos curtos de impulsos de sonicação com duração de 1–15 segundos permitem a dissipação de calor e o arrefecimento durante os intervalos mais longos entre impulsos.
Todos os processos que utilizam ultrassons são completamente reprodutíveis e linearmente escaláveis.

O VialTweeter é um sonicador para múltiplas amostras que permite uma homogeneização fiável das amostras em condições estéreis.

O VialTweeter é um homogeneizador ultrassónico para a preparação estéril simultânea, uniforme e rápida de numerosas amostras.

Exemplo de procedimento para a lise ultrassónica de células bacterianas:

Preparação da suspensão celular: Os sedimentos celulares devem ser completamente suspensos numa solução tampão por homogeneização (escolha uma solução tampão compatível com a análise subsequente, por exemplo, um método específico de cromatografia). Adicione lisozimas e/ou outros aditivos, se necessário (também devem ser compatíveis com os meios de separação/purificação). Misture/homogeneíze suavemente a solução sob sonicação ligeira até obter uma suspensão completa.
Saiba mais sobre as sinergias das lisozimas combinadas com a sonicação!
Lise ultrassónica: Coloque a amostra num banho de gelo. Para a rutura celular, submeta a suspensão a impulsos de sonicação de 60–90 segundos (utilizando o modo pulsado do seu sonicador).
Separação: Centrifugue o lisado (por exemplo, 10 min. a 10 000 x g; a 4degC). Separe cuidadosamente o sobrenadante do sedimento celular. O sobrenadante é o lisado celular total. Após a filtração do sobrenadante, obtém um líquido clarificado com a proteína celular solúvel.

O vídeo mostra o sistema de preparação ultrassónica de amostras UIP400MTP, que permite preparar amostras de forma fiável em qualquer placa multipoços padrão, utilizando ultrassons de alta intensidade. As aplicações típicas do UIP400MTP incluem a lise celular, a fragmentação de ADN, ARN e cromatina, bem como a extração de proteínas.

As aplicações mais comuns dos sonicadores em biologia e biotecnologia são:

Preparação de extratos celulares
Rutura de leveduras, bactérias, células vegetais, tecido celular mole ou duro, material nucleico
Extração de proteínas
Preparação e isolamento de enzimas
Produção de antigénios
Extração de DNA e/ou fragmentação direcionada
Preparação de lipossomas

A rutura celular, a lise e a extração com ultrassons constituem um método eficiente de preparação de amostras em laboratório.

A rutura celular com um sonicador de tipo sonda é um método eficiente de preparação de amostras.

Temas relacionados

As múltiplas aplicações dos ultrassons estendem-se aos setores da biotecnologia, bioengenharia, microbiologia, biologia molecular, bioquímica, imunologia, bacteriologia, virologia, proteómica, genética, fisiologia, biologia celular, hematologia e botânica.

Lise: rutura das estruturas celulares

As células são protegidas por uma membrana plasmática semipermeável que consiste numa bicamada fosfolipídica (também uma bicamada de proteínas e lípidos; formada por lípidos hidrofóbicos e moléculas hidrofílicas de fósforo, com moléculas proteicas incorporadas) e cria uma barreira entre o interior das células (citoplasma) e o meio extracelular. As células vegetais e as células procarióticas são envolvidas por uma parede celular. Devido à parede celular espessa de celulose, composta por múltiplas camadas, as células vegetais são mais difíceis de lisar do que as células animais. O interior celular, incluindo organelos, núcleo e mitocôndria, é estabilizado pelo citoesqueleto.
A lise das células visa extrair e separar os organelos, proteínas, DNA, mRNA ou outras biomoléculas.

Métodos convencionais de lise celular e as suas desvantagens

Existem vários métodos para lisar células, que podem ser divididos em métodos mecânicos e químicos, incluindo a utilização de detergentes ou solventes, a aplicação de alta pressão ou a utilização de um moinho de esferas ou de uma prensa francesa. A desvantagem mais problemática destes métodos é a dificuldade de controlo e ajuste dos parâmetros do processo e, consequentemente, do seu efeito.
A tabela abaixo apresenta as principais desvantagens dos métodos de lise comuns:

A tabela apresenta os métodos convencionais de rutura celular e lise e mostra as principais desvantagens de cada método.

Tabela: os métodos convencionais de lise celular apresentam grandes desvantagens

Procedimento de lise

A lise é um processo sensível. Durante a lise, a proteção da membrana celular é destruída; contudo, deve evitar-se a inativação, desnaturação e degradação das proteínas extraídas por um ambiente não fisiológico (desvio do valor de pH). Por isso, em geral, a lise é realizada numa solução tampão. A maioria das dificuldades resulta de uma rutura celular não controlada, que provoca uma libertação não direcionada de todo o material intracelular e/ou a desnaturação do produto-alvo.

Perguntas frequentes sobre sonicação e lise celular

É possível lisar células com sonicação? Sim, a sonicação lisa eficazmente as células utilizando ondas ultrassónicas de alta frequência que induzem cavitação, um fenómeno em que pequenas bolhas de vapor se formam e colapsam violentamente no interior da suspensão celular. As forças mecânicas resultantes rompem as membranas celulares e facilitam a libertação de componentes intracelulares para o líquido.
Como utilizar um sonicador para lise celular? A utilização de um sonicador para lise celular envolve a imersão da sonda do sonicador numa suspensão celular e o ajuste de parâmetros como a amplitude e a duração dos impulsos. O processo deve ser cuidadosamente monitorizado para otimizar a rutura celular, minimizando simultaneamente a desnaturação das proteínas e a inativação das enzimas.
Qual é o princípio da sonicação para lise celular? A sonicação funciona com base no princípio da cavitação acústica. A energia ultrassónica é transmitida para o meio líquido, provocando rápidas flutuações de pressão que levam à formação e implosão de microbolhas. Estas implosões geram forças intensas de cisalhamento e temperaturas elevadas localizadas, rompendo as estruturas celulares e melhorando a homogeneidade do lisado.
Quanto tempo demora a sonicação para lise celular? A duração da sonicação para lise celular pode variar significativamente em função de fatores como o tipo de célula, a densidade celular, a potência do sonicador e o protocolo específico utilizado. Os procedimentos típicos podem durar desde vários segundos até alguns minutos, sendo frequentemente realizados em ciclos para gerir a produção de calor e garantir uma rutura celular uniforme.
Qual é o objetivo da sonicação na extração de proteínas? Na extração de proteínas, a sonicação serve para romper eficientemente as membranas celulares e solubilizar as proteínas. Este método é particularmente útil para libertar proteínas do interior dos compartimentos celulares, tornando-o essencial para preparar lisados a partir dos quais as proteínas serão purificadas ou analisadas.
Porque se utiliza a sonicação para extração? A sonicação é preferida para a extração devido à sua ação rápida e à capacidade de aplicar energia direcionada, rompendo as estruturas celulares para libertar moléculas bioativas sem recorrer a tratamentos químicos agressivos, preservando assim a integridade funcional dos compostos extraídos.
A sonicação rompe as interações proteína-proteína? Embora a sonicação possa romper eficazmente as membranas celulares, também pode romper as interações proteína-proteína. O grau de rutura depende da intensidade da sonicação e da duração da exposição, podendo levar à desnaturação ou dissociação de complexos proteicos, o que poderá afetar estudos analíticos ou funcionais subsequentes.
A sonicação pode ser utilizada para lisar E. coli? Os sonicadores Hielscher são particularmente eficazes na lise de células bacterianas, como E. coli, que possuem paredes celulares robustas. A técnica proporciona um método físico para romper a parede e a membrana celulares por cisalhamento, tornando-a um método preferencial para preparar lisados bacterianos em laboratórios de biologia molecular e bioquímica.
Quais são os processos subsequentes à etapa de sonicação?
As etapas subsequentes à lise ultrassónica incluem tipicamente o fracionamento do lisado, o isolamento direcionado de organelos e a extração ou purificação adicional de proteínas.
O lisado processado é depois separado e preparado para aplicações analíticas ou funcionais, como proteómica de alta resolução, transcriptómica ou estudos de ligação a recetores.

Bibliografia/Referências

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