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Lise de sonication: ruptura da pilha & Extração

A desintegração celular ou lise é uma parte comum da preparação diária de amostras em laboratórios de biotecnologia. O objetivo da lise é interromper partes da parede celular ou a célula completa para liberar moléculas biológicas. O chamado lisado pode consistir, por exemplo, em plasmídeos, ensaios de receptores, proteínas, DNA, ARN, etc. Os passos seguintes da lise são fracionamento, isolamento de organelas e / ou extração e purificação de proteínas. O material extraído (= lisado) deve ser separado e está sujeito a investigações ou aplicações adicionais, por exemplo, para pesquisa proteômica. Os homogeneizadores ultra-sônicos são uma ferramenta comum para o sucesso da lise celular. Como a intensidade ultra-sônica pode ser nivelada ajustando os parâmetros do processo, a intensidade de sonicação ideal de muito macia a muito difícil pode ser definida individualmente para cada substância e meio para atender às exigências de aplicação específicas.

Estrutura celular

As células são protegidos por uma membrana de plasma semi-permeável que consiste em uma camada dupla de fosfo-lípido (bicamada também proteína-lípido; formadas por lípidos hidrófobos e moléculas de fósforo hidrofílicas, com moléculas de proteína incorporados) e cria uma barreira entre o interior de células (citoplasma) e o ambiente extracelular. As células vegetais e células de procariotas estão rodeadas por uma parede celular. Devido a múltiplas camadas de espessura da parede celular de celulose, as células vegetais são mais difíceis de lise do que as células animais. O interior da célula, tais como organelos, núcleo, mitocôndria, é estabilizado pelo citoesqueleto.
Por lise das células, que se destina a extrair e separar a organelos, proteínas, ADN, ARNm ou outras biomoléculas.

Sonication é comumente usado para a preparação da amostra de matéria celular.

A Fig. 1: Ultrasonic extracção a partir de células: a secção transversal microscópico (TS) da haste apical de hortelã (Mentha piperita) mostra o mecanismo de acções durante a extracção de ultra-sons a partir de células (ampliação 2000x) [recurso: Vilkhu et al. 2011]

Métodos

Existem vários métodos de lisado de células, que podem ser divididas em métodos mecânicos e químicos, que incluem a utilização de detergentes ou solventes, a aplicação de alta pressão, ou a utilização de um moinho de esferas ou de uma prensa francesa. A desvantagem mais problemático desses métodos é o difícil controlo e ajuste dos parâmetros do processo e, assim, o impacto.
As principais desvantagens dos métodos comuns de lise:

Diferentes técnicas de lise

Tabela: Os métodos convencionais de lise celular tem grandes desvantagens

Pelo contrário, ultra-sons é uma ferramenta muito eficaz e fiável para a desintegração de células, que permite um controlo completo sobre os parâmetros de sonicação. Isto assegura uma elevada selectividade na libertação de materiais e a pureza do produto. [Balasundaram et al. 2009] É apropriado para todos os tipos de células e facilmente aplicável em pequena e grande escala. Ultrasonicators são fáceis de limpar. Um homogeneizador de ultra-som sempre apresenta clean-in-place (CIP) e função esterilizar-in-place (SIP). O sonotrodo consiste em uma trompa de titânio maciço que pode ser limpa ou lavada em água ou solvente (dependendo do meio a trabalhar). A manutenção de ultrasonicators é devido à sua robustez quase negligenciável.

lise

A lise é um processo sensível. Durante a lise a protecção da membrana celular é destruída, no entanto, a inactivao, a desnaturação e degradação das proteínas extraídas de um ambiente não fisiológicas (desvio do valor de pH) deve ser evitada. Portanto, em geral a lise é levada a cabo numa solução tampão. A maioria das dificuldades surgem de rompimento celular descontrolada, resultando em uma libertação não segmentado de todo o material intracelular ou / e a desnaturação do produto alvo.

lise celular ultra-sónica pode ser utilizada para a preparação da amostra no laboratório e para a produção de grandes volumes. Clique para ampliar!

Fig. 1: 200 watts poderoso homogeneizador de ultra-sons UP200Ht com controlo digital e gravação automática de dados para a lise celular fiável e reprodutível.

Ultrasonic lise

Geralmente, a lise das amostras no laboratório levará entre 15 segundos e 2 minutos. Como a intensidade da sonicação é muito fácil de ajustar pela amplitude ajustando um tempo de sonicação, bem como escolhendo o equipamento certo, é possível perturbar as membranas celulares de forma muito suave ou muito abrupta, dependendo da estrutura celular e da finalidade da lise ( Por exemplo, a extração de DNA requer uma sonicação mais suave, a extração completa de bactérias requer um tratamento de ultra-som mais intenso). A temperatura durante o processo pode ser monitorada por um sensor de temperatura integrado e pode ser facilmente controlada por refrigeração (banho de gelo ou células de fluxo com camadas de refrigeração) ou por sonicação em modo pulsado. Durante a sonicação em modo pulso, ciclos de estouro de sonicação curta de 1-15 segundos de duração permitem a dissipação de calor e o resfriamento durante os períodos intermitentes mais longos.
Todos os processos baseados em ultra-som são completamente reprodutível e escalonável linearmente.

Ultra-sons VialTweeter homogeneizador para a preparação simultânea de amostra até 10 tubos de ensaio. (Clique para ampliar!)

O dispositivo de ultra-sons VialTweeter permite a preparação de amostras simultânea de até 10 frascos sob as mesmas condições de processo.

ultra-som Homogeneizadores

Vários tipos de Dispositivos ultra-sônicos permitir que se adaptam ao objectivo a preparação da amostra e para assegurar facilidade de uso e operação de conforto. Sonda do tipo ultrasonicators são os dispositivos mais comuns em laboratório. Eles são mais adequados para a preparação de amostras de pequeno e médio tamanho, com volumes de 0,1 ml até 1000 ml. tamanhos de energia diferentes e sonotrodos permitem adaptar o ultrasonicator para o volume da amostra e o recipiente para resultados mais eficazes e eficientes sonicação. O dispositivo de sonda ultra-sónica é a melhor escolha quando as amostras individuais têm de ser preparados.

Se houver mais amostras para preparar, por exemplo, 8 frascos de solução celular, dispositivos como o VialTweeter ou um cuforn ultra-sônico são o homogeneizador mais adequado para a lise. Vários frascos são sonicados ao mesmo tempo, com a mesma intensidade. Isso economiza não apenas o tempo, mas garante também o mesmo tratamento de todas as amostras, o que torna os resultados entre as amostras confiáveis ​​e comparáveis. Além disso, é evitada a contaminação cruzada por imersão do sonotrodo ultra-sonográfico (também conhecido como sonda ultra-sônica, chifre, ponta ou dedo). Uma vez que os frascos são utilizados, são omitidas a limpeza demorada e a perda da amostra devido à decantação de vasos.
Para maiores volumes, por exemplo para a produção comercial de extractos celulares, sistemas de ultra-sons continuas com um reactor de célula de fluxo são os mais adequados. O fluxo contínuo e uniforme do material processado assegura um ainda sonicação. Todos os parâmetros do processo de desintegração de ultra-sons pode ser optimizado e ajustada para os requisitos da aplicação e o material específico de células.

Procedimento exemplificativo para a lise de ultra-sons de células bacterianas:

  • Preparação da suspensão de células: os peletes de células deve ser completamente suspensa numa solução tampão de homogeneização (tampão de escolher a solução compatível com a seguinte análise, por exemplo, método de cromatografia específica). Adicionar lisozimas e / ou outros aditivos, se necessário (que deve ser também compatível com os meios de separação / purificação). Misture / homogeneizar a solução suavemente sob sonicação suave até a suspensão completa é conseguida.
  • Ultra-sons de lise: Colocar a amostra num banho de gelo. Para rompimento celular, sonicate a suspensão a 60-90 rajadas segundo (usando o modo de pulso do seu ultrasonicator).
  • (., Por exemplo, 10 minutos a 10000 x g; em 4degC): Separação Centrifugar o lisado. Separa-se o sobrenadante da pelete de células cuidadosamente. O sobrenadante é o lisado de células totais. Depois de filtração do sobrenadante, obtém-se um fluido purificado da proteína celular solúvel.

As aplicações mais comuns para ultrasonicators em biologia e biotecnologia são:

  • preparação de extracto celular
  • rompimento de leveduras, bactérias, células de plantas, suave & tecido celular duro, material nucleico
  • extracção de proteínas
  • Preparação e isolamento de enzimas
  • Produção de antígenos
  • a extracção do ADN e / ou fragmentação alvo
  • preparação de lipossomas
homogeneizadores de ultra-sons de alta potência como o UIP1000hd são utilizados para a desagregação de células e a extracção em modo de fluxo contínuo embora lote ou. (Clique para ampliar!)

sistemas de bancada de ultra-som, tais como o UIP1000hd (1 kW) pode processar grandes volumes de material biológico.

As aplicações múltiplas de ramos de ultra-som para fora nos sectores da biotecnologia, bioengenharia, microbiologia, biologia molecular, bioquímica, imunologia, bacteriologia, virologia, proteómica, genética, fisiologia, biologia celular, hematologia, e botânica.

Para avaliação e otimização de aplicações dos clientes, Hielscher Ultrasonics oferece uma totalmente equipada Processo de ultra-sons Laboratório. Por favor, entre em contato conosco para mais informações!

Literatura / Referências

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, D. G. (2009): Os avanços nas estratégias de lançamento de produtos e impacto na concepção de bioprocessos. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manassés, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Recuperação de ultra-som e modificação de ingredientes para alimentos. Em: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Tecnologias de ultra-som para a Alimentação e Bioprocessamento. New York: Springer, 2011. pp 345-368..

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