Sonicação para lise: Ruptura celular e extração

A desintegração celular ou lise é uma parte comum da preparação diária de amostras em laboratórios de biotecnologia. O objetivo da lise é interromper partes da parede celular ou a célula completa para liberar moléculas biológicas. Homogeneizadores ultra-sônicos são amplamente utilizados para lise celular bem sucedida. A principal vantagem dos ultrasonicators sofisticados é o controle preciso sobre os parâmetros do processo, como intensidade e temperatura, o que permite uma interrupção e extração celular suave, mas altamente eficiente.

Lise celular usando ultrassom

Ultrassonicadores do tipo sonda, como o UP200St, são homogeneizadores de tecido confiáveis e amplamente utilizados para a preparação de amostras em genética, por exemplo, para a Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT).A lise e extração celular ultra-sônica é um método usado para quebrar células abertas e extrair o conteúdo usando ondas sonoras de alta frequência, ou seja, ultrassom. A sonicação é uma técnica de lise, que é amplamente utilizada como um método estabelecido e confiável de ruptura celular e extração de material intracelular. A lise ultra-sônica é uma técnica confiável para preparar lisado contendo, por exemplo, plasmídeo, ensaios de receptores, proteínas, DNA, RNA, etc. Como a intensidade ultra-sônica pode ser nivelada ajustando os parâmetros do processo, a intensidade de sonicação ideal de muito suave a intensa pode ser definida individualmente para cada substância e meio para atender aos requisitos específicos de aplicação. As etapas seguintes da lise são fracionamento, isolamento de organelas e/ou extração e purificação de proteínas. O material extraído (= lisado) tem de ser separado e está sujeito a investigações ou aplicações adicionais, por exemplo, para investigação proteómica.

Desmembradores de laboratório ultra-sônicos UP100H e UP400St para preparação de amostras (homogeneização, lise, extração).

Homogeneizadores ultra-sônicos UP100H (100 watts) e UP400St (400 watts) para preparação de amostras, como lise e extração.

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Em comparação com outros métodos de lise e extração celular, a lise celular ultra-sônica tem várias vantagens:

  1. Velocidade: A lise e extração de células ultra-sônicas é um método rápido que pode quebrar células abertas em questão de segundos. Isso é muito mais rápido do que outros métodos, como homogeneização, congelamento-descongelamento ou moagem de contas.
  2. Eficiência: A lise e extração de células ultra-sônicas podem ser usadas para tratar amostras pequenas, grandes ou múltiplas de uma só vez, tornando-o mais eficiente do que outros métodos que exigem processamento individual de amostras pequenas.
  3. Sem produtos químicos: A lise e extração de células ultra-sônicas é um método não invasivo que não requer o uso de produtos químicos ou enzimas agressivos. Isso o torna ideal para aplicações em que a integridade do conteúdo da célula precisa ser mantida. A contaminação indesejada de amostras pode ser evitada.
  4. Alto rendimento: A lise e a extração de células ultra-sônicas podem extrair um alto rendimento de conteúdo celular, incluindo DNA, RNA e proteínas. Isso ocorre porque as ondas sonoras de alta frequência abrem as paredes celulares e liberam o conteúdo na solução circundante.
  5. Controle de temperatura: Ultrassonciadores sofisticados permitem o controle preciso da temperatura da amostra. Os sonicators digitais Hielscher são equipados com um sensor de temperatura conectável e software de monitoramento de temperatura.
  6. Reprodutíveis: Protocolos para lise de células ultra-sônicas podem ser facilmente reproduzidos e até mesmo combinados com diferentes volumes de amostra maiores ou menores por um simples aumento de escala linear.
  7. Versátil: A lise e extração de células ultra-sônicas podem ser usadas para extrair uma ampla gama de tipos de células, incluindo bactérias, leveduras, fungos, células de plantas e mamíferos. Também pode ser usado para extrair diferentes tipos de moléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA e lipídios.
  8. Preparação simultânea de inúmeras amostras: Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para processar confortavelmente inúmeras amostras sob as mesmas condições de processo. Isso torna a etapa de preparação da amostra de lise e extração altamente eficiente e economizadora de tempo.
  9. Fácil de usar: O equipamento de lise e extração de células ultra-sônicas é fácil de usar e requer treinamento mínimo. O equipamento também é econômico, pois é um investimento único, sem necessidade de recompra de alienações. Isso o torna atraente para uma ampla gama de pesquisadores e laboratórios.

No geral, a lise e extração de células ultra-sônicas é um método rápido, eficiente, precisamente controlável e versátil para extrair conteúdo celular. Suas vantagens sobre métodos alternativos o tornam uma escolha atraente para uma ampla gama de pesquisas e aplicações industriais.

Princípio de funcionamento da lise de células ultra-sônicas

A lise e extração de células ultra-sônicas usa ondas sonoras de alta frequência para interromper as células e extrair seu conteúdo. As ondas sonoras criam mudanças de pressão no líquido circundante, fazendo com que pequenas bolhas se formem e colapsem em um processo conhecido como cavitação. Essas bolhas geram forças mecânicas altamente intensas localizadas que podem quebrar as células abertas e liberar seu conteúdo na solução circundante.

A lise celular usando um ultra-sonicator geralmente envolve as seguintes etapas:

  • A amostra é colocada em um tubo ou recipiente com um tampão líquido.
  • Uma sonda ultra-sônica é inserida na amostra, e ondas sonoras de alta frequência com aprox. 20-30 kHz são aplicadas.
  • As ondas de ultrassom causam oscilação e cavitação no líquido circundante, gerando forças localizadas que quebram as células abertas e liberam seu conteúdo.
  • A amostra é centrifugada ou filtrada para remover quaisquer detritos celulares, e o conteúdo extraído é coletado para análise a jusante.
Extração ultrassônica é obra interrompendo estruturas celulares e promovendo transferência de massa

Poderosas ondas de ultrassom interrompem a matriz celular das estruturas biológicas e liberam os compostos bioativos. A transferência de massa entre o material vegetal e o solvente (por exemplo, tampão) é intensificada. (gráfico: ©Vilkhu et al., 2006)

Este vídeo mostra o homogeneizador ultrassônico Hielscher UP100H, um ultrassonônico amplamente utilizado para preparação de amostras em laboratórios.

Homogeneizador ultrassônico UP100H

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Desvantagens dos métodos comuns de lise

Durante o seu trabalho em laboratórios, você já pode ter experimentado o incômodo da lise celular usando protocolos tradicionais de lise mecânica ou química.

  • Lise mecânica: Métodos de lise mecânica, como moagem com argamassa e pilão ou homogeneização usando uma prensa francesa, moinho de contas ou sistema rotor-estator, muitas vezes carecem de controle de precipício e opções de ajuste. Isso significa que o uso de fresagem e moagem pode gerar rapidamente forças de calor e cisalhamento que podem danificar a amostra e desnaturar proteínas. Eles também podem ser demorados e exigir grandes quantidades de material de partida.
  • Lise química: Métodos de lise química, como a lise à base de detergente, podem danificar a amostra, interrompendo a bicamada lipídica e desnaturando proteínas. Eles também podem exigir várias etapas e podem deixar contaminantes residuais que interferem nas aplicações a jusante. Encontrar a dosagem ideal de detergente é um desafio adicional.
  • Ciclos de congelamento-descongelamento: Os ciclos de congelamento-descongelamento podem causar a ruptura das membranas celulares, mas os ciclos repetidos também podem causar desnaturação e degradação de proteínas. Este método também pode exigir vários ciclos, o que pode ser demorado e muitas vezes resulta em rendimentos mais baixos.
  • Lise enzimática: Os métodos de lise enzimática podem ser específicos para certos tipos de células e requerem várias etapas, tornando-os demorados. Eles também geram resíduos e exigem otimização cuidadosa para evitar a degradação da amostra. Kits de lise enzimática são muitas vezes caros. Se o seu procedimento de lise enzimática atual dá resultados insuficientes, a sonicação como método sinérgico pode ser aplicada para intensificar a ruptura celular.

Em contraste com os métodos convencionais de lise celular mecânica e química, a sonicação é uma ferramenta muito eficiente e confiável para a desintegração celular que permite um controle completo sobre os parâmetros de sonicação. Isso garante uma alta seletividade na liberação de materiais e na pureza do produto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
É adequado a todos os tipos de células e facilmente aplicável em pequena e grande escala – sempre sob condições controladas. Ultrasonicators são fáceis de limpar. Um homogeneizador ultra-sônico sempre possui função de limpeza no local (CIP) e esterilização no local (SIP). O sonotrodo consiste em um chifre de titânio maciço que pode ser limpo ou lavado em água ou solvente (dependendo do meio de trabalho). A manutenção de ultra-sonicators é devido à sua robustez quase negligenciável.

 

Este tutorial explica que tipo de sonicator é melhor para suas tarefas de preparação de amostras, como lise, interrupção celular, isolamento de proteínas, fragmentação de DNA e RNA em laboratórios, análise e pesquisa. Escolha o tipo de sonicator ideal para sua aplicação, volume de amostra, número de amostra e taxa de transferência. Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultra-sônico ideal para você!

Como encontrar o sonicator perfeito para ruptura celular e extração de proteínas em ciência e análise

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Lise ultrassônica e interrupção celular

Geralmente, a lise das amostras no laboratório levará entre 15 segundos e 2 minutos. Como a intensidade da sonicação é muito fácil de ajustar pela amplitude ajustando um tempo de sonicação, bem como escolhendo o equipamento certo, é possível perturbar as membranas celulares de forma muito suave ou muito abrupta, dependendo da estrutura celular e da finalidade da lise ( Por exemplo, a extração de DNA requer uma sonicação mais suave, a extração completa de bactérias requer um tratamento de ultra-som mais intenso). A temperatura durante o processo pode ser monitorada por um sensor de temperatura integrado e pode ser facilmente controlada por refrigeração (banho de gelo ou células de fluxo com camadas de refrigeração) ou por sonicação em modo pulsado. Durante a sonicação em modo pulso, ciclos de estouro de sonicação curta de 1-15 segundos de duração permitem a dissipação de calor e o resfriamento durante os períodos intermitentes mais longos.
Todos os processos baseados em ultra-som são completamente reprodutível e escalonável linearmente.

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O VialTweeter é um Ultraonicator MultiSample que permite a homogeneização confiável da amostra em condições estéreis.

O VialTweeter é um homogeneizador ultra-sônico para preparação simultânea, uniforme e rápida estéril de numerosas amostras.

Homogeneizadores ultra-sônicos para lise celular e extração

Vários tipos de dispositivos ultra-sônicos permitem corresponder à meta de preparação da amostra e garantir facilidade de uso e conforto de operação. Ultrasonicators do tipo sonda são os dispositivos mais comuns no laboratório. Eles são mais adequados para a preparação de amostras de pequeno e médio porte com volumes de 0,1mL até 1000mL. Diferentes tamanhos de potência e sonotrodos permitem adaptar o ultra-sonicator ao volume da amostra e ao vaso para obter resultados sônicos mais eficazes e eficientes. O dispositivo de sonda ultra-sônica é a melhor escolha quando amostras individuais precisam ser preparadas.

Se mais amostras tiverem que ser preparadas, por exemplo, 8-10 frascos de solução celular, uma intensa sonicação indireta com sistemas ultra-sônicos, como o VialTweeter ou um cuphorn ultra-sônico são o método de homogeneização mais adequado para uma lise eficiente. Vários frascos são sonicados ao mesmo tempo, na mesma intensidade. Isso economiza não apenas tempo, mas também garante o mesmo tratamento de todas as amostras, o que torna os resultados entre as amostras confiáveis e comparáveis. Além disso, durante a sonicação indireta, a contaminação cruzada, imergindo o sonotrodo ultrassônico (também conhecido como sonda ultra-sônica, chifre, ponta ou dedo) é evitado. Uma vez que individualmente para o tamanho da amostra são utilizados frascos para injetáveis correspondentes, a limpeza demorada e a perda de amostras devido à decantação dos recipientes são omitidas. Para a sonicação uniforme de placas multiwell ou microtitulação, Hielscher oferece o UIP400MTP.
Para maiores volumes, por exemplo para a produção comercial de extractos celulares, sistemas de ultra-sons continuas com um reactor de célula de fluxo são os mais adequados. O fluxo contínuo e uniforme do material processado assegura um ainda sonicação. Todos os parâmetros do processo de desintegração de ultra-sons pode ser optimizado e ajustada para os requisitos da aplicação e o material específico de células.
 
 
Procedimento exemplificativo para a lise de ultra-sons de células bacterianas:

  • Preparação da suspensão de células: os peletes de células deve ser completamente suspensa numa solução tampão de homogeneização (tampão de escolher a solução compatível com a seguinte análise, por exemplo, método de cromatografia específica). Adicionar lisozimas e / ou outros aditivos, se necessário (que deve ser também compatível com os meios de separação / purificação). Misture / homogeneizar a solução suavemente sob sonicação suave até a suspensão completa é conseguida.
  • Ultra-sons de lise: Colocar a amostra num banho de gelo. Para rompimento celular, sonicate a suspensão a 60-90 rajadas segundo (usando o modo de pulso do seu ultrasonicator).
  • (., Por exemplo, 10 minutos a 10000 x g; em 4degC): Separação Centrifugar o lisado. Separa-se o sobrenadante da pelete de células cuidadosamente. O sobrenadante é o lisado de células totais. Depois de filtração do sobrenadante, obtém-se um fluido purificado da proteína celular solúvel.

 

O vídeo mostra o sistema de preparação de amostras ultrassônicas UIP400MTP, que permite a preparação confiável da amostra de qualquer placa multi-bem padrão usando ultrassom de alta intensidade. Aplicações típicas do UIP400MTP incluem lise celular, DNA, RNA e cromatina, bem como extração de proteínas.

Ultrassonicator UIP400MTP para sônica de placa multi-bem

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As aplicações mais comuns para ultrasonicators em biologia e biotecnologia são:

  • preparação de extracto celular
  • Interrupção da levedura, bactérias, células vegetais, tecido celular macio ou duro, material nucleico
  • extracção de proteínas
  • Preparação e isolamento de enzimas
  • Produção de antígenos
  • a extracção do ADN e / ou fragmentação alvo
  • preparação de lipossomas
A ruptura celular, lise e extração com ultrassom é um método eficiente de preparação de amostras em laboratórios.

A ruptura celular com ultrasonicator do tipo sonda é um método eficiente de preparação de amostras.

A tabela abaixo fornece uma visão geral sobre nossos ultrasonicators para interrupção e extração de células. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador ultra-sônico. Nossa equipe técnica bem treinada e de longa data terá prazer em ajudá-lo a escolher o ultrasonicator mais adequado para suas amostras!
 

Volume batch Quociente de vazão Dispositivos Recomendados
até 10 frascos para injetáveis ou tubos n / D. VialTweeter
placas multiwell / microtiter n / D. UIP400MTP
múltiplos tubos / vasos n / D. Cuphorn
1 a 500mL 10 a 200 mL / min UP100H
10 a 1000mL 20 a 200mL/min UP200Ht, UP200St
10 a 2000 mL 20 a 400 mL / min UP400St

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Para avaliação e otimização das aplicações dos clientes, a Hielscher Ultrasonics oferece um laboratório de processos ultrassônicos totalmente equipado. Por favor, entre em contato conosco para obter mais informações!
Este vídeo mostra o homogeneizador ultra-sônico de 100 watts UP100H para extração de botânicos.

Extração ultrassônica de compostos bioativos

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As aplicações múltiplas de ramos de ultra-som para fora nos sectores da biotecnologia, bioengenharia, microbiologia, biologia molecular, bioquímica, imunologia, bacteriologia, virologia, proteómica, genética, fisiologia, biologia celular, hematologia, e botânica.

Lise: Quebrando estruturas celulares

As células são protegidos por uma membrana de plasma semi-permeável que consiste em uma camada dupla de fosfo-lípido (bicamada também proteína-lípido; formadas por lípidos hidrófobos e moléculas de fósforo hidrofílicas, com moléculas de proteína incorporados) e cria uma barreira entre o interior de células (citoplasma) e o ambiente extracelular. As células vegetais e células de procariotas estão rodeadas por uma parede celular. Devido a múltiplas camadas de espessura da parede celular de celulose, as células vegetais são mais difíceis de lise do que as células animais. O interior da célula, tais como organelos, núcleo, mitocôndria, é estabilizado pelo citoesqueleto.
Por lise das células, que se destina a extrair e separar a organelos, proteínas, ADN, ARNm ou outras biomoléculas.

Métodos convencionais de lise celular e suas desvantagens

Existem vários métodos de lisado de células, que podem ser divididas em métodos mecânicos e químicos, que incluem a utilização de detergentes ou solventes, a aplicação de alta pressão, ou a utilização de um moinho de esferas ou de uma prensa francesa. A desvantagem mais problemático desses métodos é o difícil controlo e ajuste dos parâmetros do processo e, assim, o impacto.
A tabela abaixo mostra as principais desvantagens dos métodos comuns de lise:

A tabela lista os métodos convencionais de ruptura celular e lise e mostra as principais desvantagens de cada método.

Tabela: Os métodos convencionais de lise celular tem grandes desvantagens

 

Procedimento de lise

A lise é um processo sensível. Durante a lise a protecção da membrana celular é destruída, no entanto, a inactivao, a desnaturação e degradação das proteínas extraídas de um ambiente não fisiológicas (desvio do valor de pH) deve ser evitada. Portanto, em geral a lise é levada a cabo numa solução tampão. A maioria das dificuldades surgem de rompimento celular descontrolada, resultando em uma libertação não segmentado de todo o material intracelular ou / e a desnaturação do produto alvo.

Literatura / Referências

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