Schizofilan jest β-glukanem grzybowym o właściwościach immunomodulujących. Dla uzyskania wysoce aktywnych efektów leczniczych, schizofilan musi mieć niską masę cząsteczkową, aby wykazać lepszą biodostępność. Udowodniono, że ultradźwięki zmniejszają masę cząsteczkową schizofilanu. Jako niezawodna i skuteczna metoda, sonikacja może być łatwo zastosowana do produkcji schizofilanu o niskiej masie cząsteczkowej.

Grzyby Schizophyllum i ultradźwiękowa ekstrakcja beta-glukanu

Gatunki grzybów z rodzaju Schizophyllum rosną w naturze na rozkładających się drzewach po porze deszczowej. Owocniki zbierane są w następnej porze suchej. Gatunki Schizophyllum są bogate w związki biochemiczne takie jak glukany i dlatego są spożywane szczególnie w krajach tropikalnych jako żywność i lek. Ze względu na swoje właściwości immunomodulacyjne, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe, Schizophyllum commune, znany również jako grzyb Splitgill, przyciąga firmy biotechnologiczne i farmaceutyczne.
Polisacharyd schizofilan, znany również jako sizofiran, sonifilan lub sizofilan, jest głównym β-glukanem występującym w grzybach Schizophyllum, które oferują wysoce skuteczny bioaktywny β-glukan schizofilan.
Grzyby Schizophyllum commune rosną w naturze na drzewach, grzybnia może być również hodowana w bulionie fermentacyjnym. W zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych schizofilan o niskiej masie cząsteczkowej jest o wiele bardziej skuteczny niż schizofilan o wysokiej masie cząsteczkowej. Wynika to z faktu, że schizofilan o niskiej masie cząsteczkowej wykazuje znacznie lepszą biodostępność i szybkość wchłaniania. Ponadto, schizofilan o wysokiej masie cząsteczkowej jest często problematyczny w zastosowaniach, ponieważ powoduje wysoką lepkość roztworów wodnych.
Ultradźwiękowa redukcja rozmiaru jest wysoce skuteczną i niezawodną techniką obniżania masy cząsteczkowej schizofilanu, a tym samym zwiększania jakości cząsteczki β-glukanu.

Protokół wytwarzania schizofilanu o niskiej masie cząsteczkowej

Ponieważ schizofilan o dużej masie cząsteczkowej wykazuje drastycznie lepszą biodostępność i właściwości aplikacyjne, zespół badawczy Smirnou zbadał ultradźwięki w celu rozszczepienia i zmniejszenia rozmiaru cząsteczki β-glukanu schizofilanu.

Ultrasonikowanie schizofilanu

β-1,3(1,6)-glukan schizofilan (SPG) produkowany był w wyniku zanurzonej hodowli grzyba S. commune w bioreaktorze z wykorzystaniem sacharozy jako substratu.
Po zakończeniu hodowli bulion hodowlany rozcieńczano wodą demineralizowaną do stężenia schizofilanu 2 g/L i poddawano działaniu ultradźwięków. Procesor ultradźwiękowy UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Niemcy) w trybie recycle przy następujących parametrach i warunkach: przepływ medium 50 mL/s, częstotliwość 20 kHz, moc wyjściowa 2000 W, sonotroda typu BS2d22, booster typu B2-1,4 i amplituda 100%. Temperatura bulionu hodowlanego w chwili rozpoczęcia sonikacji wynosiła 25°C. Ultradźwiękowy wywar hodowlany (nakład energii właściwej 100 Ws/mL) filtrowano przez filtr wgłębny Seitz HS800 pod ciśnieniem 1,5 bara w temperaturze 40°C. Ultradźwiękowy schizofilan (uSPG) do charakterystyki chemicznej wytrącano z przesączu potrójną ilością alkoholu izopropylowego w temperaturze laboratoryjnej, a następnie suszono w temperaturze 60°C przez 12h. Roztwory uSPG do badań immunologicznych przygotowywano w następujący sposób: (1) ultradźwiękowy przesącz z bulionu hodowlanego diafiltrowano przez 0,1m2 kasety Pall Centramate T-series PES (100 kDa cut-off) pod ciśnieniem 0,8 bara, a diafiltrację kontynuowano do momentu, gdy przewodność retentatu wynosiła 20 μS/cm; (2) roztwór zagęszczano przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i sterylizowano przez autoklawowanie w 120°C/20 min. Denaturowany uSPG przygotowywano w podobny sposób, z tą różnicą, że do przesączu bulionu hodowlanego dodawano NaOH w stężeniu 0,2 M, a alkalizowany roztwór inkubowano przez 30 min w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

Metody analityczne

Wydajność grzybni oceniano grawimetrycznie: wywar hodowlany rozcieńczano wodą w stosunku 1:4, odwirowywano 10000 × g w 25°C przez 20 min, osad przemywano potrójną ilością wody, suszono w 60°C i ważono. Schizofilan wytrącano z supernatantu potrójną ilością alkoholu izopropylowego, suszono w temp. 60°C przez 24h i oznaczano jego wydajność grawimetrycznie. pO2 w pożywce mierzono sondą optyczną Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Szwajcaria).
Lepkość dynamiczną wywaru hodowlanego mierzono na aparacie HAAKE Visco Tester 6L z wrzecionami 1L i 2L w temperaturze 4°C i prędkości obrotowej 30 obr/min. Szybkość filtracji obliczano na podstawie czasu filtracji 500 mL wywaru hodowlanego przez filtr wgłębny Seitz HS800 (Pall, USA) o wymiarach 200 × 200 mm przy ciśnieniu 1,5 bara i temperaturze 40°C.
Masę cząsteczkową uSPG mierzono metodą SEC-MALLS na systemie HPLC Alliance (Waters) z szeregowo połączonymi kolumnami PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40 oraz detektorem miniDAWN TREOS (Wyatt), zagęszczano przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i sterylizowano przez autoklawowanie w temp. 120°C/20 min. Denaturowany uSPG przygotowywano w podobny sposób, z tą różnicą, że do przesączu bulionu hodowlanego dodawano NaOH w stężeniu 0,2 M, a alkalizowany roztwór inkubowano przez 30 min w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

wyniki:
Zabieg ultradźwiękowy zastosowano bezpośrednio do bulionu z grzybnią S. commune 144-h, aby ułatwić dalsze przetwarzanie SPG.
 
Charakterystyka sonikowanego schizofilanu: Schizofilan poddany działaniu ultradźwięków (uSPG) został wytrącony z filtratu bulionu hodowlanego za pomocą alkoholu i scharakteryzowany. SEC-MALLS oszacował Mw uSPG na około 1 MDa. Średnia masa cząsteczkowa schizofilanu pochodzącego z fermentacji płynnej wynosi około 5 MDa, podczas gdy w hodowli w stanie stałym może osiągać nawet 10 MDa. Porównując masę cząsteczkową schizofilanu poddanego działaniu ultradźwięków z masą cząsteczkową schizofilanu natywnego, niepoddanego obróbce ultradźwiękowej, można zaobserwować 5- do 10-krotne zmniejszenie masy cząsteczkowej w wyniku działania ultradźwięków.
Sonikowany polisacharyd uSPG zawierał 0,7%w/w białka i 1,0%w/w pozostałości po spaleniu. Hydrolizat uSPG składał się w ponad 99% z glukozy. Wyniki analityczne wskazują, że sonikacja rozszczepia szkielet β-glukanu w sposób losowy, a boczne gałęzie pozostają nienaruszone, zmniejszając w ten sposób rozmiar i masę cząsteczkową schizofilanu. Badania immunologiczne na uSPG wolnym od białek i endotoksyn wykazały, że poddany sonikacji schizofilan o niskiej masie cząsteczkowej wykazuje wyraźną aktywność immunomodulacyjną.

 
Zmniejszona lepkość: Ultradźwiękowanie powodowało znaczne obniżenie lepkości wywaru hodowlanego. Podczas ultradźwięków lepkość bulionu hodowlanego zmieniała się nieliniowo: spadek lepkości był szybki na początku ultradźwięków, ale później ulegał spowolnieniu. Energia jednostkowa 100 Ws/mL wystarczała do prawie 7-krotnego zmniejszenia lepkości bulionu hodowlanego.

Ulepszona filtracja: Bulion hodowlany poddany działaniu ultradźwięków przepływał przez filtr szybciej niż bulion hodowlany nie poddany działaniu ultradźwięków (nakład energii właściwej 0 Ws/mL) z wysokocząsteczkowym SPG. Ponadto, ultradźwięki znacząco zmniejszyły straty produktu podczas filtracji. Przesącz z nieprzetworzonego bulionu hodowlanego z wysokocząsteczkowym SPG (specyficzny nakład energii 0 Ws/mL) zawierał 0,3 ± 0,07 g/L SPG, podczas gdy stężenie SPG przed filtracją wgłębną wynosiło 2 g/L. Natomiast przesącz z hodowli poddanej ultradźwiękom o energii 100 Ws/mL zawierał SPG w stężeniu 2,2 ± 0,2 g/L, co odpowiada prawie zerowym stratom produktu.

Wnioski: W podsumowaniu zespół badawczy stwierdza, że obróbka ultradźwiękowa jest efektywną technologią wytwarzania schizofilanu o niskiej masie cząsteczkowej, który może być następnie wykorzystany w kosmetyce i medycynie. Ultradźwięki, stosowane na kompletnym bulionie hodowlanym z grzybnią, przynoszą pewne korzyści w produkcji schizofilanu. Zmniejsza ona straty produktu podczas dalszego przetwarzania i umożliwia produkcję wysoko oczyszczonego polisacharydu dzięki efektywnemu wykorzystaniu ultrafiltracji.
Dodatkowo badacze stwierdzili, że ultradźwiękowe przetwarzanie schizofilanu jest łatwo skalowalne. Jedno urządzenie w instalacji pilotażowej dezintegratora ultradźwiękowego UIP2000hdT przetwarzało 1 litr bulionu hodowlanego w ciągu 110 s w trybie przepływowym. Wydajność systemu można łatwo zwiększyć poprzez sekwencyjne podłączenie dodatkowych jednostek ultradźwiękowych.

 
Przeczytaj więcej o prostym skalowaniu ekstrakcji grzybów!
 

Wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe do przetwarzania glukanu grzybowego

Fragmentacja polisacharydów, takich jak glukany, a także innych związków bioaktywnych, takich jak chityna i chitozan, może być niezawodnie przetwarzana za pomocą wysokowydajnego sprzętu ultradźwiękowego firmy Hielscher. Nasze ultrasonografy mogą dostarczać wysokie amplitudy, oferują precyzyjną kontrolę nad parametrami procesu i mogą pracować 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu pod dużym obciążeniem i w wymagających środowiskach. Asortyment urządzeń Hielscher Ultrasonics niezawodnie spełnia te wymagania. Oprócz wyjątkowej wydajności ultradźwiękowej, ultradźwięki Hielscher charakteryzują się wysoką wydajnością energetyczną, co jest znaczącą zaletą ekonomiczną – zwłaszcza przy zastosowaniu w produkcji na dużą skalę.
Ultradźwiękowe urządzenia firmy Hielscher są wysokowydajnymi systemami, które mogą być wyposażone w akcesoria takie jak sonotrody, boostery, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dopasować się do potrzeb procesowych.Dzięki cyfrowemu kolorowemu wyświetlaczowi, możliwości zaprogramowania przebiegu sonikacji, automatycznemu zapisowi danych na zintegrowanej karcie SD, zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę i wielu innym funkcjom zapewniona jest najwyższa kontrola procesu i łatwość obsługi. W połączeniu z wytrzymałością i dużą nośnością systemy ultradźwiękowe firmy Hielscher są niezawodnym koniem roboczym w produkcji.Redukcja masy cząsteczkowej β-glukanów, takich jak schizofilan, wymaga zastosowania silnych ultradźwięków, aby uzyskać ukierunkowane rozszczepienie i wysokiej jakości produkt końcowy schizofilanu, który może być stosowany w farmacji.
 
Więcej informacji na temat ultradźwiękowej ekstrakcji beta-glukanu z grzybów, w tym instrukcje krok po kroku, można znaleźć tutaj!
 
Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators: