Ultradźwiękowa produkcja wysoko oczyszczonych beta-glukanów schizofilanu

Schizofilan jest grzybowym β-glukanem o właściwościach immunomodulujących. Aby wykazywać silne działanie lecznicze, schizofilan musi mieć małą masę cząsteczkową, zapewniającą lepszą biodostępność. Udowodniono, że sonikacja zmniejsza masę cząsteczkową schizofilanu. Jako niezawodna i skuteczna metoda sonikacja może być łatwo stosowana do produkcji schizofilanu o małej masie cząsteczkowej.

Grzyby Schizophyllum i ultradźwiękowa ekstrakcja beta-glukanów

Gatunki grzybów z rodzaju Schizophyllum rosną w naturze na rozkładających się drzewach po porach deszczowych. Owocniki zbiera się w następującej po nich porze suchej. Gatunki Schizophyllum są bogate w związki biochemiczne, takie jak glukany, dlatego spożywa się je, szczególnie w krajach tropikalnych, jako żywność i środek leczniczy. Ze względu na właściwości immunomodulujące, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe Schizophyllum commune, znany również jako rozszczepka pospolita, wzbudził zainteresowanie firm biotechnologicznych i farmaceutycznych.
Polisacharyd schizofilan, znany również jako sizofiran, sonifilan lub sizofilan, jest głównym β-glukanem występującym w grzybach Schizophyllum, które dostarczają tego wysoce skutecznego, bioaktywnego β-glukanu.
Grzyby Schizophyllum commune rosną w naturze na drzewach; grzybnię można również hodować w podłożu fermentacyjnym. W zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych schizofilan o małej masie cząsteczkowej jest znacznie skuteczniejszy niż schizofilan o dużej masie cząsteczkowej. Wynika to z faktu, że schizofilan o małej masie cząsteczkowej wykazuje znacznie lepszą biodostępność i szybkość wchłaniania. Ponadto schizofilan o dużej masie cząsteczkowej często sprawia problemy w zastosowaniach, ponieważ jego roztwory wodne mają dużą lepkość.
Ultradźwiękowe zmniejszanie rozmiaru jest wysoce skuteczną i niezawodną techniką obniżania masy cząsteczkowej schizofilanu, a tym samym poprawy jakości cząsteczki β-glukanu.

Protokół produkcji schizofilanu o małej masie cząsteczkowej

Ponieważ schizofilan o masie cząsteczkowej wykazuje zdecydowanie lepszą biodostępność i właściwości użytkowe, zespół badawczy Smirnou zbadał zastosowanie sonikacji do rozszczepiania i zmniejszania rozmiaru cząsteczki β-glukanu – schizofilanu.

Sonikacja schizofilanu

β-1.3(1.6)-Glukan schizofilan (SPG) wytwarzano poprzez hodowlę wgłębną grzyba S. commune w bioreaktorze, wykorzystując sacharozę jako substrat.
Po zakończeniu hodowli płyn hodowlany rozcieńczono wodą demineralizowaną do stężenia schizofilanu 2 g/L i poddano sonikacji za pomocą procesora ultradźwiękowego UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Niemcy) w trybie recyrkulacji przy następujących parametrach i warunkach: natężenie przepływu medium 50 mL/s, częstotliwość 20 kHz, moc wyjściowa 2000 W, sonotroda typu BS2d22, wzmacniacz amplitudy typu B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura płynu hodowlanego na początku sonikacji wynosiła 25°C. Płyn hodowlany poddany sonikacji (jednostkowy wkład energii 100 Ws/mL) przefiltrowano przez filtr wgłębny Seitz HS800 pod ciśnieniem 1,5 bar w temperaturze 40°C. Schizofilan poddany sonikacji (uSPG), przeznaczony do charakterystyki chemicznej, wytrącono z filtratu trzykrotną ilością alkoholu izopropylowego w temperaturze laboratoryjnej i suszono w temperaturze 60°C przez 12h. Roztwory uSPG do badań immunologicznych przygotowano następująco: (1) filtrat płynu hodowlanego poddanego sonikacji poddano diafiltracji przez kasetę PES Pall Centramate serii T o powierzchni 0,1m2 (próg odcięcia 100 kDa) przy ciśnieniu 0,8 bar, a diafiltrację kontynuowano do osiągnięcia przewodności retentatu 20 μS/cm; (2) roztwór zatężono przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i wysterylizowano w autoklawie przy 120°C/20 min. Zdenaturowany uSPG przygotowano w podobny sposób, z tą różnicą, że do filtratu płynu hodowlanego dodano NaOH do stężenia 0,2 M, a zalkalizowany roztwór inkubowano przez 30 min w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

Metody analityczne

Uzysk grzybni oszacowano grawimetrycznie: płyn hodowlany rozcieńczono wodą w stosunku 1:4, odwirowano przy 10 000 × g w temperaturze 25°C przez 20 min, osad przemyto trzykrotną ilością wody, wysuszono w temperaturze 60°C i zważono. Schizofilan wytrącono z supernatantu trzykrotną ilością alkoholu izopropylowego, suszono w temperaturze 60°C przez 24h, a jego uzysk określono grawimetrycznie. pO2 w płynie hodowlanym mierzono sondą optyczną Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Szwajcaria).
Lepkość dynamiczną płynu hodowlanego mierzono za pomocą HAAKE Visco Tester 6L z wrzecionami 1L i 2L w temperaturze 4°C i przy prędkości obrotowej 30 rpm. Szybkość filtracji obliczano na podstawie czasu filtracji 500 mL płynu hodowlanego przez filtr wgłębny Seitz HS800 (Pall, USA) o wymiarach 200 × 200 mm pod ciśnieniem 1,5 bar i w temperaturze 40°C.
Masę cząsteczkową uSPG mierzono metodą SEC-MALLS w systemie HPLC Alliance (Waters) z połączonymi szeregowo kolumnami PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) zatężono przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i wysterylizowano w autoklawie przy 120°C/20 min. Zdenaturowany uSPG przygotowano w podobny sposób, z tą różnicą, że do filtratu płynu hodowlanego dodano NaOH do stężenia 0,2 M, a zalkalizowany roztwór inkubowano przez 30 min w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

Wyniki:
Sonikację zastosowano bezpośrednio do płynu z 144-godzinnej hodowli S. commune zawierającego grzybnię, aby ułatwić dalsze przetwarzanie SPG.
 
Charakterystyka schizofilanu poddanego sonikacji: Schizofilan poddany sonikacji (uSPG) wytrącono alkoholem z filtratu płynu hodowlanego i scharakteryzowano. Metodą SEC-MALLS oszacowano Mw uSPG na około 1 MDa. Średnia masa cząsteczkowa schizofilanu z fermentacji w podłożu płynnym wynosi około 5 MDa, natomiast w hodowli na podłożu stałym może osiągać nawet 10 MDa. Porównując masę cząsteczkową schizofilanu poddanego sonikacji z masami cząsteczkowymi natywnego schizofilanu niepoddanego obróbce, można zaobserwować 5–10-krotne zmniejszenie masy cząsteczkowej wskutek sonikacji.
Polisacharyd uSPG poddany sonikacji zawierał 0,7%w/w białka i 1,0%w/w pozostałości po prażeniu. Hydrolizat uSPG składał się w ponad 99% z glukozy. Wyniki analiz wskazują, że sonikacja rozszczepia główny łańcuch β-glukanu w sposób losowy, a boczne odgałęzienia pozostają nienaruszone, co zmniejsza rozmiar i masę cząsteczkową schizofilanu. Badania immunologiczne uSPG zasadniczo wolnego od białek i endotoksyn wykazały, że schizofilan o małej Mw poddany sonikacji wykazuje wyraźną aktywność immunomodulującą.

 
Zmniejszona lepkość: Sonikacja spowodowała znaczne zmniejszenie lepkości płynu hodowlanego. Podczas sonikacji lepkość płynu hodowlanego zmieniała się nieliniowo: spadek lepkości był szybki na początku sonikacji, ale później zwalniał. Jednostkowy wkład energii 100 Ws/mL wystarczył, aby zmniejszyć lepkość płynu hodowlanego niemal 7-krotnie.

Ulepszona filtracja: Płyn hodowlany poddany działaniu ultradźwięków przepływał przez filtr szybciej niż płyn hodowlany niepoddany obróbce (jednostkowy wkład energii 0 Ws/mL), zawierający SPG o dużej masie cząsteczkowej. Ponadto sonikacja znacznie zmniejszyła straty produktu podczas filtracji. Filtrat płynu hodowlanego niepoddanego obróbce, zawierającego SPG o dużej masie cząsteczkowej (jednostkowy wkład energii 0 Ws/mL), zawierał 0,3 ± 0,07 g/L SPG, podczas gdy stężenie SPG przed filtracją wgłębną wynosiło 2 g/L. Natomiast filtrat płynu hodowlanego poddanego sonikacji przy 100 Ws/mL zawierał SPG w stężeniu 2,2 ± 0,2 g/L, co odpowiada niemal zerowej stracie produktu.

Wniosek: W podsumowaniu zespół badawczy stwierdza, że przetwarzanie ultradźwiękowe jest wydajną technologią wytwarzania schizofilanu o małej masie cząsteczkowej, który można następnie stosować w kosmetyce i medycynie. Sonikacja całego płynu hodowlanego zawierającego grzybnię przynosi określone korzyści w produkcji schizofilanu. Zmniejsza straty produktu podczas dalszego przetwarzania i umożliwia produkcję wysoko oczyszczonego polisacharydu dzięki efektywnemu wykorzystaniu ultrafiltracji.
Ponadto badacze stwierdzili, że przetwarzanie ultradźwiękowe schizofilanu można łatwo skalować. Jeden dezintegrator ultradźwiękowy UIP2000hdT w instalacji pilotażowej przetworzył 1 litr płynu hodowlanego w ciągu 110 s w trybie przepływowym. Wydajność systemu można łatwo zwiększyć przez szeregowe podłączenie dodatkowych urządzeń ultradźwiękowych.

 
Dowiedz się więcej o łatwym zwiększaniu skali ekstrakcji z grzybów!
 

Wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe do przetwarzania glukanów grzybowych

Fragmentację polisacharydów, takich jak glukany, a także innych związków bioaktywnych, takich jak chityna i chitozan, można niezawodnie przeprowadzać za pomocą wysokowydajnych urządzeń ultradźwiękowych Hielscher. Nasze sonikatory mogą zapewniać wysokie amplitudy, umożliwiają precyzyjne sterowanie parametrami procesu i mogą pracować 24/7 pod dużym obciążeniem oraz w wymagających warunkach. Gama urządzeń Hielscher Ultrasonics niezawodnie spełnia te wymagania. Oprócz wyjątkowej wydajności ultradźwiękowej sonikatory Hielscher cechują się wysoką efektywnością energetyczną, co stanowi istotną korzyść ekonomiczną – szczególnie przy zastosowaniu w komercyjnej produkcji na dużą skalę.
Sonikatory Hielscher to wysokowydajne systemy, które można wyposażyć w akcesoria, takie jak sonotrody, wzmacniacze amplitudy, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dostosować je do potrzeb procesu.
Cyfrowy kolorowy wyświetlacz, możliwość wcześniejszego ustawienia cykli sonikacji, automatyczne zapisywanie danych na zintegrowanej karcie SD, zdalne sterowanie przez przeglądarkę i wiele innych funkcji zapewniają najwyższy poziom kontroli procesu i łatwości obsługi. W połączeniu z solidną konstrukcją i zdolnością do pracy pod dużym obciążeniem systemy ultradźwiękowe Hielscher są niezawodnymi urządzeniami do intensywnej pracy w produkcji.
Zmniejszanie masy cząsteczkowej β-glukanów, takich jak schizofilan, wymaga ultradźwięków o dużej mocy, aby uzyskać zamierzone rozszczepienie i wysokiej jakości produkt końcowy zawierający schizofilan, który można stosować w zastosowaniach farmaceutycznych.
 
Tutaj znajdziesz więcej informacji o ultradźwiękowej ekstrakcji beta-glukanów z grzybów, w tym instrukcje krok po kroku!
 
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów: