Ultradźwiękowa produkcja wysoko oczyszczonych beta-glukanów schizofilanu

Schizophyallan to grzybowy β-glukan o właściwościach immunomodulujących. Aby uzyskać wysoce aktywne działanie lecznicze, schizofyllan musi mieć niską masę cząsteczkową, aby wykazać lepszą biodostępność. Udowodniono, że ultradźwięki zmniejszają masę cząsteczkową schizofilanu. Jako niezawodna i skuteczna metoda, ultradźwięki mogą być łatwo stosowane do produkcji schizofylanu o niskiej masie cząsteczkowej.

Grzyby Schizophyllum i ultradźwiękowa ekstrakcja beta-glukanu

Gatunki grzybów Schizophyllum rosną w naturze na rozkładających się drzewach po porze deszczowej. Owocniki zbierane są w następnej porze suchej. Gatunki Schizophyllum są bogate w związki biochemiczne, takie jak glukany i dlatego są spożywane zwłaszcza w krajach tropikalnych jako żywność i lekarstwa. Ze względu na swoje właściwości immunomodulujące, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe, Schizophyllum commune, znany również jako grzyb Splitgill, przyciągnął firmy biotechnologiczne i farmaceutyczne.
Polisacharyd schizofyllan, znany również jako sizofiran, sonifilan lub sizofilan, jest głównym β-glukanem występującym w grzybach Schizophyllum, które oferują wysoce skuteczny bioaktywny β-glukan schizofyllan.
Grzyby Schizophyllum commune rosną w naturze na drzewach, grzybnia może być również hodowana w bulionie fermentacyjnym. W zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych schizofyllan o niskiej masie cząsteczkowej jest znacznie bardziej skuteczny niż schizofyllan o wysokiej masie cząsteczkowej. Wynika to z faktu, że schizofilan o niskiej masie cząsteczkowej wykazuje znacznie lepszą biodostępność i szybkość wchłaniania. Ponadto, schizofyllan o wysokiej masie cząsteczkowej jest często problematyczny w zastosowaniach, ponieważ powoduje wysoką lepkość roztworów wodnych.
Ultradźwiękowa redukcja rozmiaru jest wysoce skuteczną i niezawodną techniką obniżania masy cząsteczkowej schizofilanu, zwiększając w ten sposób jakość cząsteczki β-glukanu.

Protokół produkcji schizofilanu o niskiej masie cząsteczkowej

Ponieważ schizofyllan o masie cząsteczkowej wykazuje drastycznie lepszą biodostępność i właściwości aplikacyjne, zespół badawczy Smirnou zbadał ultradźwięki w celu rozszczepienia i zmniejszenia wielkości cząsteczki β-glukanu schizofylanu.

Ultradźwięki Schizophyllan

β-1,3(1,6)-glukan schizofyllan (SPG) został wyprodukowany przez zanurzoną hodowlę grzyba S. commune w bioreaktorze przy użyciu sacharozy jako substratu.
Po zakończeniu hodowli, bulion hodowlany rozcieńczono zdemineralizowaną wodą do stężenia schizofyllanu 2 g/L i poddano działaniu ultradźwięków za pomocą urządzenia Procesor ultradźwiękowy UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Niemcy) w trybie recyrkulacji przy następujących parametrach i warunkach: przepływ medium 50 ml/s, częstotliwość 20 kHz, moc wyjściowa 2000 W, sonotroda typu BS2d22, wzmacniacz typu B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura bulionu hodowlanego na początku sonikacji wynosiła 25 ° C. Ultradźwiękowy bulion hodowlany (energia właściwa 100 Ws / ml) filtrowano przez filtr wgłębny Seitz HS800 pod ciśnieniem 1,5 bara w temperaturze 40 ° C. Ultradźwiękowy schizofyllan (uSPG) do charakterystyki chemicznej wytrącano z przesączu potrójną ilością alkoholu izopropylowego w temperaturze laboratoryjnej i suszono w temperaturze 60°C przez 12 godzin. Roztwory uSPG do badań immunologicznych przygotowano w następujący sposób: (1) ultradźwiękowy przesącz bulionu hodowlanego poddawano diafiltracji przez 0,1 m2 kasety PES Pall Centramate serii T (100 kDa cut-off) pod ciśnieniem 0,8 bara i diafiltrację kontynuowano do momentu, gdy przewodność retentatu wynosiła 20 μS/cm; (2) roztwór zatężano przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i sterylizowano w autoklawie w temperaturze 120°C/20 min. Denaturowany uSPG przygotowano w podobny sposób, z tym wyjątkiem, że NaOH dodano do filtratu bulionu hodowlanego w stężeniu 0,2 M, a alkalizowany roztwór inkubowano przez 30 minut w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

Metody analityczne

Wydajność grzybni określono grawimetrycznie: bulion hodowlany rozcieńczono wodą w stosunku 1:4, odwirowano 10000 × g w 25°C przez 20 min, osad przemyto potrójną ilością wody, wysuszono w 60°C i zważono. Schizofyllan wytrącano z supernatantu potrójną ilością alkoholu izopropylowego, suszono w temperaturze 60°C przez 24 godziny, a jego wydajność oznaczano grawimetrycznie. pO2 w bulionie hodowlanym mierzono za pomocą sondy optycznej Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Szwajcaria).
Lepkość dynamiczną bulionu hodowlanego mierzono na urządzeniu HAAKE Visco Tester 6L z wrzecionami 1L i 2L w temperaturze 4°C i prędkości obrotowej 30 obr. Prędkość filtracji obliczono na podstawie czasu filtracji 500 ml bulionu hodowlanego przez filtr wgłębny 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) przy ciśnieniu 1,5 bara i temperaturze 40°C.
Masę cząsteczkową uSPG mierzono metodą SEC-MALLS w systemie HPLC Alliance (Waters) z szeregowo połączonymi kolumnami PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) zatężano przez diafiltrację do stężenia uSPG 1 g/L i sterylizowano w autoklawie w temperaturze 120°C/20 min. Denaturowany uSPG przygotowano w podobny sposób, z tym wyjątkiem, że NaOH dodano do filtratu bulionu hodowlanego w stężeniu 0,2 M, a alkalizowany roztwór inkubowano przez 30 minut w temperaturze laboratoryjnej przed diafiltracją.

Wyniki:
Obróbkę ultradźwiękową zastosowano bezpośrednio do bulionu hodowlanego S. commune 144-h z grzybnią w celu ułatwienia dalszego przetwarzania SPG.
 
Charakterystyka sonikowanego schizofyllanu: Ultradźwiękowy schizofyllan (uSPG) został wytrącony z filtratu bulionu hodowlanego alkoholem i scharakteryzowany. SEC-MALLS oszacował Mw uSPG na około 1 MDa. Średnia masa cząsteczkowa schizofyllanu z płynnej fermentacji wynosi około 5 MDa, podczas gdy w hodowli w stanie stałym może osiągnąć nawet 10 MDa. Porównując masę cząsteczkową schizofyllanu poddanego działaniu ultradźwięków z masą cząsteczkową natywnego, niepoddanego obróbce schizofyllanu, można zaobserwować 5- do 10-krotne zmniejszenie masy cząsteczkowej w wyniku działania ultradźwięków.
Sonikowany polisacharyd uSPG zawierał 0,7%w/w białka i 1,0%w/w pozostałości po zapaleniu. hydrolizat uSPG składał się z glukozy z ponad 99%. Wyniki analityczne wskazują, że sonikacja losowo rozszczepia szkielet β-glukanu, a boczne gałęzie pozostają nienaruszone, zmniejszając w ten sposób rozmiar i masę cząsteczkową schizofilanu. Badania immunologiczne na zasadniczo wolnych od białek i endotoksyn uSPG wykazały, że ultradźwiękowy schizofyllan o niskiej masie cząsteczkowej ma wyraźną aktywność immunomodulującą.

 
Zmniejszona lepkość: Ultradźwięki spowodowały znaczny spadek lepkości bulionu hodowlanego. Podczas ultradźwięków lepkość bulionu hodowlanego zmieniała się nieliniowo: spadek lepkości był szybki na początku ultradźwięków, ale później zwolnił. Specyficzna energia wejściowa 100 Ws / ml była wystarczająca do zmniejszenia lepkości bulionu hodowlanego prawie 7 razy.

Ulepszona filtracja: Bulion hodowlany poddany działaniu ultradźwięków przepływał przez filtr szybciej niż nietraktowany bulion hodowlany (energia właściwa 0 Ws / ml) z wysokocząsteczkowym SPG. Poza tym, ultradźwięki znacznie zmniejszyły straty produktu podczas filtracji. Filtrat nietraktowanego bulionu hodowlanego z wysokocząsteczkowym SPG (energia właściwa 0 Ws / ml) zawierał 0,3 ± 0,07 g / l SPG, podczas gdy stężenie SPG przed filtracją wgłębną wynosiło 2 g / l. W przeciwieństwie do tego, filtrat kultury ultradźwiękowej 100 Ws / ml zawierał SPG w stężeniu 2,2 ± 0,2 g / l, co odpowiada prawie zerowej utracie produktu.

Wnioski: We wnioskach zespół badawczy stwierdza, że obróbka ultradźwiękowa jest skuteczną technologią wytwarzania schizofylanu o niskiej masie cząsteczkowej, który może być następnie stosowany w kosmetyce i medycynie. Ultradźwięki, stosowane na kompletnym bulionie hodowlanym z grzybnią, przynoszą pewne korzyści w produkcji schizofilanu. Zmniejsza straty produktu podczas dalszego przetwarzania i umożliwia produkcję wysoko oczyszczonego polisacharydu dzięki efektywnemu wykorzystaniu ultrafiltracji.
Ponadto naukowcy odkryli, że ultradźwiękowe przetwarzanie schizofyllanu jest łatwo skalowalne. Jedna jednostka pilotażowego dezintegratora ultradźwiękowego UIP2000hdT przetworzyła 1 litr bulionu hodowlanego w 110 s w trybie przepływu. Wydajność systemu można łatwo zwiększyć poprzez sekwencyjne podłączenie dodatkowych jednostek ultradźwiękowych.

 
Przeczytaj więcej o prostym skalowaniu ekstrakcji grzybów!
 

Wysokowydajny sprzęt ultradźwiękowy do przetwarzania glukanu grzybowego

Fragmentacja polisacharydów, takich jak glukany, a także innych związków bioaktywnych, takich jak chityna i chitozan, może być niezawodnie przetwarzana za pomocą wysokowydajnego sprzętu ultradźwiękowego firmy Hielscher. Nasze ultrasonografy mogą dostarczać wysokie amplitudy, oferują precyzyjną kontrolę nad parametrami procesu i mogą pracować 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu pod dużym obciążeniem i w wymagających środowiskach. Asortyment urządzeń Hielscher Ultrasonics niezawodnie spełnia te wymagania. Oprócz wyjątkowej wydajności ultradźwiękowej, ultradźwięki Hielscher charakteryzują się wysoką wydajnością energetyczną, co jest znaczącą zaletą ekonomiczną – szczególnie w przypadku komercyjnej produkcji na dużą skalę.
Ultradźwięki Hielscher to wysokowydajne systemy, które mogą być wyposażone w akcesoria, takie jak sonotrody, wzmacniacze, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dopasować się do potrzeb procesu.Dzięki cyfrowemu kolorowemu wyświetlaczowi, opcji wstępnego ustawiania przebiegów sonikacji, automatycznemu zapisowi danych na zintegrowanej karcie SD, zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę i wielu innym funkcjom, zapewniona jest najwyższa kontrola procesu i łatwość obsługi. W połączeniu z solidnością i dużą nośnością, systemy ultradźwiękowe Hielscher są niezawodnym koniem roboczym w produkcji.Redukcja masy cząsteczkowej β-glukanów, takich jak schizofyllan, wymaga silnych ultradźwięków w celu uzyskania ukierunkowanego rozszczepienia i końcowego produktu schizofylanu o wysokiej jakości, który może być stosowany w zastosowaniach farmaceutycznych.
 
Więcej informacji na temat ultradźwiękowej ekstrakcji beta-glukanu z grzybów, w tym instrukcje krok po kroku, można znaleźć tutaj!
 
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultradźwiękowców: