Ekstrakcja beta-glukanów z grzybów za pomocą ultradźwięków
Materiały i sprzęt
- Grzyby (np. 100 g posiekanych lub pokrojonych w plasterki grzybów)
- Zimna woda destylowana (np. 500 ml)
- Blender lub młynek
- Szklane zlewki lub kolby
- Papier filtracyjny lub zestaw do filtracji próżniowej
- Wirówka (opcjonalnie)
- Alkohol (np. etanol) do wytrącania osadów
- Lodówka
- Suszarka
Protokół ekstrakcji beta-glukanu
- Zmiel lub zmiażdż grzyby (np. Chaga lub Lion’ Mane mushroom) na gruboziarniste cząstki o wielkości ok. 1 do 3 milimetrów. Na przykład użyj 100 g suszonych cząstek grzybów.
- Następnie dodaj cząstki grzybów do szklanej zlewki lub kolby.
- Następnie dodaj 500 ml wody destylowanej do zlewki zawierającej cząstki grzybów, które mają zostać wyekstrahowane. Stosunek wody do grzybów może się różnić w zależności od rodzaju grzyba i wielkości cząstek.
- Po wymieszaniu zawiesiny, poddać mieszaninę działaniu ultradźwięków za pomocą ultradźwiękowego homogenizatora laboratoryjnego (np. UP400St z sonotrodą 22 mm przy 100% amplitudzie lub UP200Ht z sonotrodą 14 mm przy 100% amplitudzie) i utrzymywać temperaturę poniżej 90°C. Niższe temperatury pomagają zachować związki wrażliwe na ciepło, takie jak beta-glukany podczas ekstrakcji. Sonikacja przez około 5 do 10 minut w przypadku korzystania z UP400St i przez 10 do minut w przypadku korzystania z UP200Ht, odpowiednio. Należy pamiętać, że temperatura i czas ekstrakcji mogą się różnić w zależności od zastosowanej mocy ultradźwiękowej. Oczywiście większe objętości będą wymagały dłuższego czasu sonikacji.
- Przefiltruj sonikowaną mieszaninę przez bibułę filtracyjną lub użyj zestawu do filtracji próżniowej, aby oddzielić ciecz (zawierającą wyekstrahowane beta-glukany) od stałych pozostałości grzybów.
- Następnie wytrącić beta-glukany z cieczy poprzez dodanie alkoholu (np. etanolu). Zazwyczaj do wytrącenia można użyć 2-3 objętości alkoholu.
- Następnie należy przechowywać mieszaninę w lodówce przez kilka godzin, aby umożliwić wytrącenie się beta-glukanów.
- Po wytrąceniu można ostrożnie zdekantować ciecz i zebrać osad beta-glukanu.
- Na koniec wysusz beta-glukany w piekarniku w niskiej temperaturze (np. 40-50°C), aż do usunięcia całego alkoholu i uzyskania suchego proszku.
Grzyby wykazują różnice w swoich właściwościach. W związku z tym proces ekstrakcji beta-glukanu może się różnić w zależności od takich czynników, jak konkretny gatunek grzybów, stan grzybów (suszone lub świeże), wielkość cząstek i temperatura ekstrakcji. Aby zoptymalizować procedurę ekstrakcji, należy rozważyć eksperymentowanie z różnymi parametrami, w tym z różnymi stosunkami ciał stałych do cieczy, dostosowywaniem temperatur, badaniem różnych rozpuszczalników i testowaniem różnych czasów trwania sonikacji i ustawień amplitudy.
Ultradźwiękowo wspomagana ekstrakcja enzymatyczna beta-glukanu
Ekstrakcja enzymatyczna wspomagana ultradźwiękami jest metodą stosowaną do ekstrakcji beta-glukanów z grzybów przy użyciu kombinacji enzymów i fal ultradźwiękowych. Proces ten zwiększa wydajność ekstrakcji poprzez rozbijanie ścian komórkowych grzybów i ułatwianie uwalniania beta-glukanów.
Zwiększenie skali ekstrakcji beta-glukanu z grzybów
Po ustaleniu protokołu ekstrakcji beta-glukanu, który spełnia Twoje wymagania, skalowanie procesu ekstrakcji może być prostym przedsięwzięciem.
Skalowanie ekstrakcji wsadowej
Jeśli planujesz zwiększyć skalę przy użyciu metody ekstrakcji wsadowej, zalecamy zwiększenie objętości wsadu przy jednoczesnym utrzymaniu stosunku ciała stałego do cieczy i wszystkich innych parametrów na stałym poziomie. Jeśli nadal używasz tego samego homogenizatora ultradźwiękowego, pamiętaj o proporcjonalnym wydłużeniu czasu sonikacji. W przypadku partii przekraczających 1 litr warto rozważyć zastosowanie powolnego mieszadła w celu utrzymania zawiesiny cząstek i poprawy jednorodności ekstrakcji. Poniższy rysunek przedstawia 8-litrowy zestaw do ekstrakcji wsadowej wykorzystujący homogenizator ultradźwiękowy UP400St w połączeniu z mieszadłem laboratoryjnym.
Zestaw do ekstrakcji grzybów wsadowych 8L z sonikatorem UP400St
Filtracja próżniowa ekstraktu beta-glukanu po sonikacji
Ekstrakcja grzybów na linii produkcyjnej
Dla osób zainteresowanych ciągłą ekstrakcją większych ilości beta-glukanów z grzybów, firma Hielscher Ultrasonics oferuje reaktory przepływowe przeznaczone do ekstrakcji materiałów botanicznych. Jeśli dotyczy to Ciebie, zachęcamy do skontaktowania się z nami bezpośrednio, aby uzyskać więcej informacji. Nasz zespół techniczny chętnie pomoże w określeniu najbardziej odpowiedniej konfiguracji dla konkretnych potrzeb. Jednak przeprowadzenie wspomnianego wcześniej eksperymentu w skali laboratoryjnej z konkretnym gatunkiem grzybów może być nieocenione w zrozumieniu dokładnych wymagań procesu. Poniższy obraz przedstawia duży reaktor przepływowy z homogenizatorem ultradźwiękowym UIP4000hdT do ekstrakcji beta-glukanów przy około 50 do 200 litrach zawiesiny grzybowo-rozpuszczalnikowej na godzinę.
Homogenizator ultradźwiękowy UIP4000hdT dla 50 do 200 l zawiesiny grzybowo-rozpuszczalnikowej na godzinę
Empiryczne stężenie beta-glukanu w gatunkach grzybów
Poniżej znajduje się lista empirycznych stężeń beta-glukanu, który został wyekstrahowany z różnych gatunków grzybów.
| Gatunki grzybów | Zawartość beta glukanu (% masy) |
|---|---|
| Termitomyces fuliginosus R. Heim | 1% |
| Boletus colossus R. Heim | 3% |
| Russula densifolia Secr. ex Gillet | 25% |
| Russula cyanoxantha (Schaeff.) Fr. | 29% |
| Russula alboareolata Hongo | 42% |
| Russula emetica (Schaeff.) Pers. | 10% |
| Russula delica Fr. | 38% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita princeps Corner & Bas | 9% |
| Amanita caesarea (Scop.) Pers. | 4% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) Boedijn | 19% |
| Cortinarius claricolor var. turmalis (Fr.) Quadr | 13% |
| Termitomyces tylerianus Otieno | 12% |
| Termitomyces microcarpus (Berk. & Broome) R. Heim | 8% |
| Termitomyces eurhizus (Berk.) R. Heim | 7% |
| Polyporellus varius (Pers.) P. Karst. | 2% |
| Pycnoporus coccineus (Fr.) Bondartsev & Piosenkarz | 45% |
| Lentinus squarrosulus Mont. | 2% |
| Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schröt | 3% |
| Pycnoporus sanguineus (L.) Fr. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita virgineoides Bas | 1% |
| Agaricus silvaticus Schaeff. | 3% |
| Chlorophyllum molybdites (G. Mey.) Massee | 3% |
| Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. | 33% |
| Amauroderma rugosum (Blume & T. Nees) Torrend | 4% |
| Suillus bovinus var. bovinus (Pers.) Kuntze | 1% |
| Clitocybe suaveolens (Schumach.) P. Kumm. S | 9% |
| Cleroderma verrucosum (Bull.) Pers. | 9% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) | 19% |
| Lentinula edodes (Berk.) Pegler | 34% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
Stężenie beta-glukanu w dzikich gatunkach grzybów, Źródło: Boonyanuphap, Jaruntorn & Hansawasdi, Chanida. (2010). Przestrzenne rozmieszczenie zbiorowisk dzikich grzybów zawierających beta glukan w subtropikalnym suchym lesie w Tajlandii. Fungal Diversity. 46. 29-42. 10.1007/s13225-010-0067-8.
Kwantyfikacja stężenia ekstraktu beta-glukanu z grzybów
Stężenie beta-glukanu po ekstrakcji można określić ilościowo przy użyciu różnych metod, w zależności od rodzaju beta-glukanu i specyficznych wymagań analizy. Poniżej wymieniono powszechnie stosowane metody ilościowego oznaczania stężenia beta-glukanu. Oczywiście wybór metody zależy od takich czynników, jak wymagana dokładność i dostępny sprzęt.
-
Metoda grawimetryczna
- Zasada: Metoda ta opiera się na wytrącaniu beta-glukanów etanolem, a następnie suszeniu i ważeniu osadu.
- Procedura: Próbka jest rozpuszczana w wodzie, traktowana etanolem w celu wytrącenia beta-glukanów, a następnie osad jest zbierany, suszony i ważony.
- Zalety: Prosty i szeroko stosowany.
- Ograniczenia: Mniej precyzyjne w porównaniu z innymi metodami.
-
Metody kolorymetryczne
- Zasada: Metody te obejmują reakcje barwne ze specyficznymi odczynnikami, które powodują zmianę koloru proporcjonalną do stężenia beta-glukanu.
-
Przykłady:
- Metoda kwasu fenolowo-siarkowego: Metoda ta polega na traktowaniu próbki stężonym kwasem siarkowym i fenolem, który zmienia kolor roztworu na pomarańczowy. Intensywność koloru jest proporcjonalna do stężenia beta-glukanu.
- Metoda Anthrone: Odczynnik Anthrone reaguje z beta-glukanami, tworząc niebiesko-zielony kolor, a intensywność koloru jest mierzona.
- Zalety: Czuły i odpowiedni do analizy o wysokiej przepustowości.
- Ograniczenia: Zakłócenia powodowane przez inne związki i konieczność stosowania specyficznych odczynników.
-
Badania enzymatyczne
- Zasada: Testy enzymatyczne wykorzystują enzymy, takie jak β-glukanaza, do rozkładu beta-glukanów na prostsze cukry, a uwolnione cukry są oznaczane ilościowo.
- Zalety: Wysoka specyficzność i dokładność.
- Ograniczenia: Wymaga specjalistycznego sprzętu i odczynników.
-
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
- Zasada: HPLC rozdziela i określa ilościowo związki na podstawie ich interakcji z kolumną chromatograficzną.
- Procedura: Beta-glukany są hydrolizowane do monosacharydów, a powstałe cukry są oddzielane i oznaczane ilościowo metodą HPLC.
- Zalety: Wysoce dokładny i odpowiedni dla złożonych próbek.
- Ograniczenia: Wymaga specjalistycznego sprzętu i wiedzy.
-
Specyficzne testy immunologiczne
- Zasada: Testy immunologiczne wykorzystują przeciwciała specyficzne dla beta-glukanów w celu ilościowego określenia ich stężenia.
-
Przykłady:
- ELISA (test immunoenzymatyczny): W tej metodzie przeciwciało połączone z enzymem powoduje zmianę koloru, gdy wiąże się z beta-glukanami.
- Testy przepływu bocznego: Są to szybkie testy, które zapewniają widoczny wynik na pasku testowym.
- Zalety: Wysoka specyficzność i czułość.
- Ograniczenia: Wymaga specyficznych przeciwciał i może być bardziej kosztowna.