Ekstrakcja beta-glukanów z grzybów za pomocą ultradźwięków
Materiały i wyposażenie
- Grzyby (np. 100g grzybów posiekanych lub pokrojonych w plasterki)
- Zimna woda destylowana (np. 500mL)
- Blender lub młynek
- Szklane zlewki lub kolby
- Bibuła filtracyjna lub zestaw do filtracji próżniowej
- Wirówka (opcjonalnie)
- Alkohol (np. etanol) do wytrącania
- Lodówka
- Suszarka laboratoryjna
Protokół ekstrakcji beta-glukanów
- Zmiel lub rozdrobnij grzyby (np. czagę lub soplówkę jeżowatą) na grube cząstki o wielkości około 1 do 3 milimetrów. Na przykład użyj 100g wysuszonych cząstek grzybów.
- Następnie umieść cząstki grzybów w szklanej zlewce lub kolbie.
- Następnie dodaj 500mL wody destylowanej do zlewki zawierającej cząstki grzybów przeznaczone do ekstrakcji. Stosunek wody do grzybów może się różnić w zależności od konkretnego rodzaju grzyba i wielkości cząstek.
- Po wymieszaniu zawiesiny poddaj mieszaninę sonikacji za pomocą laboratoryjnego homogenizatora ultradźwiękowego (np. UP400St z sonotrodą 22mm przy amplitudzie 100% lub UP200Ht z sonotrodą 14mm przy amplitudzie 100%) i utrzymuj temperaturę poniżej 90°C. Niższe temperatury pomagają zachować podczas ekstrakcji związki wrażliwe na ciepło, takie jak beta-glukany. Prowadź sonikację przez około 5 do 10 minut przy użyciu UP400St oraz przez 10 do … minut przy użyciu UP200Ht. Należy pamiętać, że temperatura i czas ekstrakcji mogą się różnić w zależności od zastosowanej mocy ultradźwięków. Oczywiście większe objętości będą wymagały dłuższych czasów sonikacji.
- Przefiltruj mieszaninę poddaną sonikacji przez bibułę filtracyjną lub użyj zestawu do filtracji próżniowej, aby oddzielić ciecz (zawierającą wyekstrahowane beta-glukany) od stałych pozostałości grzybów.
- Następnie wytrąć beta-glukany z cieczy przez dodanie alkoholu (np. etanolu). Zazwyczaj do wytrącania można użyć 2–3 objętości alkoholu.
- Następnie przechowuj mieszaninę w lodówce przez kilka godzin, aby umożliwić wytrącenie beta-glukanów.
- Po wytrąceniu możesz ostrożnie zdekantować ciecz i zebrać osad beta-glukanów.
- Na koniec susz beta-glukany w suszarce w niskiej temperaturze (np. 40–50°C), aż cały alkohol zostanie usunięty i uzyskasz suchy proszek.
Grzyby różnią się pod względem swoich właściwości. Dlatego proces ekstrakcji beta-glukanów może się różnić w zależności od takich czynników jak konkretny gatunek grzyba, stan grzybów (suszone lub świeże), wielkość cząstek i temperatura ekstrakcji. Aby zoptymalizować procedurę ekstrakcji, rozważ eksperymentowanie z różnymi parametrami, w tym zmianę stosunku fazy stałej do cieczy, dostosowywanie temperatur, badanie różnych rozpuszczalników oraz testowanie różnych czasów sonikacji i ustawień amplitudy.
Ekstrakcja enzymatyczna beta-glukanu wspomagana ultradźwiękami
Ekstrakcja enzymatyczna wspomagana ultradźwiękami to metoda stosowana do ekstrakcji beta-glukanów z grzybów za pomocą połączenia enzymów i fal ultradźwiękowych. Proces ten zwiększa wydajność ekstrakcji poprzez rozkład ścian komórkowych grzybów i ułatwienie uwalniania beta-glukanów.
Zwiększanie skali ekstrakcji beta-glukanów z grzybów
Po opracowaniu protokołu ekstrakcji beta-glukanów spełniającego Twoje wymagania zwiększenie skali procesu ekstrakcji może być prostym zadaniem.
Zwiększanie skali ekstrakcji okresowej
Jeśli planujesz zwiększyć skalę przy użyciu metody ekstrakcji okresowej, zalecamy zwiększanie objętości partii przy zachowaniu stałego stosunku fazy stałej do cieczy i wszystkich pozostałych parametrów. Jeśli nadal używasz tego samego homogenizatora ultradźwiękowego, pamiętaj o proporcjonalnym wydłużeniu czasu sonikacji. W przypadku partii przekraczających 1 litr możesz rozważyć zastosowanie wolnoobrotowego mieszadła, aby utrzymać cząstki w zawiesinie i poprawić równomierność ekstrakcji. Poniższe zdjęcie przedstawia zestaw do ekstrakcji okresowej o objętości 8 litrów, wykorzystujący homogenizator ultradźwiękowy UP400St w połączeniu z mieszadłem laboratoryjnym.
Zestaw do okresowej ekstrakcji grzybów o objętości 8L z sonikatorem UP400St
Filtracja próżniowa ekstraktu beta-glukanów po sonikacji
Przepływowa ekstrakcja grzybów
Dla osób zainteresowanych ciągłą ekstrakcją większych ilości beta-glukanów z grzybów Hielscher Ultrasonics oferuje reaktory z komorą przepływową przeznaczone do ekstrakcji materiału roślinnego. Jeśli dotyczy to Ciebie, zachęcamy do bezpośredniego kontaktu z nami w celu uzyskania dodatkowych informacji. Nasz zespół techniczny chętnie pomoże dobrać najbardziej odpowiedni zestaw do Twoich konkretnych potrzeb. Jednak przeprowadzenie wspomnianego wcześniej eksperymentu w skali laboratoryjnej z wybranym przez Ciebie gatunkiem grzyba może być nieocenione w zrozumieniu dokładnych wymagań procesu. Poniższe zdjęcie przedstawia duży reaktor z komorą przepływową i homogenizatorem ultradźwiękowym UIP4000hdT do ekstrakcji beta-glukanów, przetwarzający około 50 do 200 litrów zawiesiny grzybów w rozpuszczalniku na godzinę.
Doświadczalnie oznaczona zawartość beta-glukanów w gatunkach grzybów
Poniżej znajduje się zestawienie doświadczalnie oznaczonej zawartości beta-glukanów wyekstrahowanych z różnych gatunków grzybów.
| Mushroom Species | Total 1,3-1,6-β-D-glucan (g/100g dry mass) |
|---|---|
| Boletus pinophilus | 9,8% |
| Suillus granulatus | 13,3% |
| Craterellus cornucopioides | 4,5% |
| Suillus variegatus | 13,7% |
| Hydnum repandum | 4,1% |
| Gyroporus cyanescens | 14,3% |
| Tricholomopsis rutilans | 10,2% |
| Agaricus bisporus (portobello) | 4% |
| Agaricus bisporus (cremini) | 4% |
| Auricularia auricular-judae | 16,8% |
1,3-1,6-β-D-glucan content in the analyzed wild-growing and cultivated mushrooms, Source:Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Quantitative Evaluation of 1,3-1,6-Β-D-Glucan Contents in Wild–Growing Species of Edible Polish Mushrooms. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.
SonoStation: Mobilny system do obróbki ultradźwiękowej gotowy do użycia – składający się z dyspergatorów ultradźwiękowych, pompy, mieszadła i zbiornika
Homogenizator ultradźwiękowy UIP4000hdT do przetwarzania około 50 do 200 litrów zawiesiny grzybów w rozpuszczalniku na godzinę
Ilościowe oznaczanie stężenia beta-glukanów w ekstrakcie z grzybów
Stężenie beta-glukanów po ekstrakcji można oznaczać ilościowo różnymi metodami, w zależności od rodzaju beta-glukanu i konkretnych wymagań analizy. Poniżej wymieniono powszechnie stosowane metody ilościowego oznaczania stężenia beta-glukanów. Oczywiście wybór metody zależy od takich czynników jak wymagana dokładność i dostępne wyposażenie.
-
Metoda grawimetryczna
- Zasada: Metoda ta opiera się na wytrącaniu beta-glukanów etanolem, a następnie suszeniu i ważeniu osadu.
- Procedura: Próbkę rozpuszcza się w wodzie i poddaje działaniu etanolu w celu wytrącenia beta-glukanów, a następnie zbiera się, suszy i waży osad.
- Zalety: Prosta i powszechnie stosowana.
- Ograniczenia: Mniejsza precyzja w porównaniu z innymi metodami.
-
Metody kolorymetryczne
- Zasada: Metody te obejmują reakcje barwne z określonymi odczynnikami, które powodują zmianę barwy proporcjonalną do stężenia beta-glukanów.
-
Przykłady:
- Metoda fenolowo-siarkowa: Metoda ta polega na poddaniu próbki działaniu stężonego kwasu siarkowego i fenolu, co powoduje zmianę barwy roztworu na pomarańczową. Intensywność barwy jest proporcjonalna do stężenia beta-glukanów.
- Metoda antronowa: Odczynnik antronowy reaguje z beta-glukanami, powodując powstanie niebieskozielonej barwy, której intensywność jest mierzona.
- Zalety: Czułe i odpowiednie do analiz o wysokiej wydajności przetwarzania próbek.
- Ograniczenia: Interferencje ze strony innych związków i konieczność stosowania określonych odczynników.
-
Oznaczenia enzymatyczne
- Zasada: W oznaczeniach enzymatycznych wykorzystuje się enzymy, takie jak β-glukanaza, do rozkładu beta-glukanów na prostsze cukry, a uwolnione cukry oznacza się ilościowo.
- Zalety: Wysoce swoiste i dokładne.
- Ograniczenia: Wymagają specjalistycznego wyposażenia i odczynników.
-
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
- Zasada: HPLC rozdziela i oznacza ilościowo związki na podstawie ich oddziaływań z kolumną chromatograficzną.
- Procedura: Beta-glukany hydrolizuje się do monosacharydów, a powstałe cukry rozdziela się i oznacza ilościowo metodą HPLC.
- Zalety: Bardzo dokładna i odpowiednia do próbek o złożonym składzie.
- Ograniczenia: Wymaga specjalistycznego wyposażenia i wiedzy fachowej.
-
Swoiste oznaczenia immunologiczne
- Zasada: W oznaczeniach immunologicznych wykorzystuje się przeciwciała swoiste wobec beta-glukanów do ilościowego oznaczania ich stężenia.
-
Przykłady:
- ELISA (test immunoenzymatyczny): W tej metodzie przeciwciało sprzężone z enzymem powoduje zmianę barwy po związaniu się z beta-glukanami.
- Testy przepływu bocznego: Są to szybkie testy, które zapewniają widoczny wynik na pasku testowym.
- Zalety: Wysoka swoistość i czułość.
- Ograniczenia: Wymagają swoistych przeciwciał i mogą być bardziej kosztowne.