Produkcja chityny i chitozanu z grzybów

Ultradźwięki są wysoce skuteczną metodą uwalniania chityny i chitozanu ze źródeł grzybowych, takich jak grzyby. Chityna i chitozan muszą być depolimeryzowane i deacetylowane w procesie przetwarzania w celu uzyskania wysokiej jakości biopolimeru. Depolimeryzacja i deacetylacja wspomagana ultradźwiękami jest wysoce skuteczną, prostą i szybką techniką, która skutkuje wysokiej jakości chitozanami o wysokiej masie cząsteczkowej i doskonałej biodostępności.

Chityna i chitozan pochodzące z grzybów poprzez ultradźwięki

Grzyby jadalne i lecznicze, takie jak Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi lub reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (pieczarki), Hericium erinaceus (lwia grzywa), Cordyceps sinensis (grzyb gąsienicowy), Grifola frondosa (opieńka), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, turkuć podjadek) i wiele innych gatunków grzybów są szeroko stosowane jako żywność i do ekstrakcji związków bioaktywnych. Grzyby te, jak również pozostałości przetwarzania (odpady grzybowe) mogą być wykorzystywane do produkcji chitozanu. Ultradźwięki nie tylko sprzyjają uwalnianiu chityny ze struktury ściany komórkowej grzyba, ale także napędzają konwersję chityny w cenny chitozan poprzez wspomaganą ultradźwiękami depolimeryzację i deacetylację.

Depolimeryzacja i deacetylacja chityny do chitozanu jest promowana przez sonikację

Intensywna ultrasonizacja przy użyciu systemu ultradźwiękowego typu sondy jest techniką stosowaną do promowania depolimeryzacji i deacetylacji chityny, co prowadzi do powstawania chitozanu. Chityna jest naturalnie występującym polisacharydem występującym w egzoszkieletach skorupiaków, owadów i ścianach komórkowych niektórych grzybów. Chitozan jest otrzymywany z chityny poprzez usunięcie grup acetylowych z cząsteczki chityny.

Procedura ultradźwiękowa dla chityny grzybowej do konwersji chitozanu

Gdy intensywna ultrasonizacja jest stosowana do produkcji chitozanu z chityny, zawiesina chityny jest sonikowana falami ultradźwiękowymi o wysokiej intensywności i niskiej częstotliwości, zwykle w zakresie od 20 kHz do 30 kHz. Proces ten generuje intensywną kawitację akustyczną, która odnosi się do powstawania, wzrostu i zapadania się mikroskopijnych pęcherzyków próżniowych w cieczy. Kawitacja generuje zlokalizowane ekstremalnie wysokie siły ścinające, wysokie temperatury (do kilku tysięcy stopni Celsjusza) i ciśnienia (do kilkuset atmosfer) w cieczy otaczającej pęcherzyki kawitacyjne. Te ekstremalne warunki przyczyniają się do rozpadu polimeru chityny i późniejszej deacetylacji.
 

Obrazy SEM chityn i chitozanów z dwóch gatunków grzybów: a) chityna z L. vellereus; b) chityna z P. ribis; c) chitozan z L.vellereus; d) chitozan z P. ribis.
zdjęcie i opracowanie: © Erdoğan et al., 2017

Ultradźwiękowa depolimeryzacja chityny

Depolimeryzacja chityny zachodzi poprzez połączone działanie sił mechanicznych, takich jak mikrostrumieniowanie i strumieniowanie cieczy, a także przez ultradźwiękowo inicjowane reakcje chemiczne indukowane przez wolne rodniki i inne reaktywne gatunki powstające podczas kawitacji. Fale wysokociśnieniowe generowane podczas kawitacji powodują, że łańcuchy chityny ulegają naprężeniom ścinającym, co powoduje rozszczepienie polimeru na mniejsze fragmenty.

Ultradźwiękowa deacetylacja chityny

Oprócz depolimeryzacji, intensywna ultrasonizacja sprzyja również deacetylacji chityny. Deacetylacja polega na usunięciu grup acetylowych z cząsteczki chityny, co prowadzi do powstania chitozanu. Intensywna energia ultradźwiękowa, w szczególności wysokie temperatury i ciśnienia generowane podczas kawitacji, przyspieszają reakcję deacetylacji. Reaktywne warunki stworzone przez kawitację pomagają rozerwać wiązania acetylowe w chitynie, powodując uwolnienie kwasu octowego i przekształcenie chityny w chitozan.
Ogólnie rzecz biorąc, intensywne ultradźwięki wzmacniają zarówno procesy depolimeryzacji, jak i deacetylacji, zapewniając niezbędną energię mechaniczną i chemiczną do rozbicia polimeru chityny i ułatwienia konwersji do chitozanu. Technika ta oferuje szybką i wydajną metodę produkcji chitozanu z chityny, z licznymi zastosowaniami w różnych gałęziach przemysłu, w tym w farmacji, rolnictwie i inżynierii biomedycznej.

Przemysłowa produkcja chitozanu z grzybów z ultradźwiękami mocy

Komercyjna produkcja chityny i chitozanu opiera się głównie na odpadach z przemysłu morskiego (tj. rybołówstwa, zbioru skorupiaków itp.). Różne źródła surowca skutkują różną jakością chityny i chitozanu, co powoduje wahania produkcji i jakości ze względu na sezonowe wahania połowów. Ponadto, chitozan pochodzący ze źródeł grzybowych oferuje podobno lepsze właściwości, takie jak jednorodna długość polimeru i większa rozpuszczalność w porównaniu z chitozanem pochodzącym ze źródeł morskich. (por. Ghormade et al., 2017) W celu dostarczenia jednolitego chitozanu, ekstrakcja chityny z gatunków grzybów stała się stabilną alternatywą produkcyjną. Produkcja chityny i cytozanu z grzybów może być łatwo i niezawodnie osiągnięta przy użyciu technologii ekstrakcji ultradźwiękowej i deacetylacji. Intensywna sonikacja zakłóca struktury komórkowe w celu uwolnienia chityny i sprzyja przenoszeniu masy w rozpuszczalnikach wodnych w celu uzyskania najwyższej wydajności chityny i wydajności ekstrakcji. Późniejsza deacetylacja ultradźwiękowa przekształca chitynę w cenny chitozan. Zarówno ultradźwiękowa ekstrakcja chityny, jak i deacetylacja chitozanu mogą być liniowo skalowane do dowolnego komercyjnego poziomu produkcji.

Sonikacja intensyfikuje produkcję chitozanu grzybowego i sprawia, że produkcja jest bardziej wydajna i ekonomiczna.
(zdjęcie i opracowanie: © Zhu et al., 2019)

Wyniki badań nad ultradźwiękową deacetylacją chityny i chitozanu

Zhu et al. (2018) stwierdzają w swoich badaniach, że deacetylacja ultradźwiękowa okazała się kluczowym przełomem, przekształcając β-chitynę w chitozan z 83-94% deacetylacją w obniżonych temperaturach reakcji. Zdjęcie po lewej stronie przedstawia obraz SEM ultradźwiękowo deacetylowanego chitozanu (90 W, 15 min, 20 w / v% NaOH, 1:15 (g: ml) (zdjęcie i opracowanie: © Zhu et al., 2018)
W ich protokole roztwór NaOH (20% w/v) przygotowano przez rozpuszczenie płatków NaOH w wodzie DI. Roztwór alkaliczny został następnie dodany do osadu GLSP (0,5 g) w stosunku ciało stałe-ciecz 1:20 (g: ml) do probówki wirówkowej. Chitozan dodano do NaCl (40 ml, 0,2 M) i kwasu octowego (0,1 M) w stosunku objętościowym roztworu 1:1. Zawiesinę następnie poddano działaniu ultradźwięków w łagodnej temperaturze 25 ° C przez 60 minut przy użyciu ultrasonografu typu sondy (250 W, 20 kHz). (por. Zhu i in., 2018)
 
Pandit et al. (2021) stwierdzili, że na szybkość degradacji roztworów chitozanu rzadko wpływa stężenie kwasu wykorzystywanego do rozpuszczania polimeru i w dużej mierze zależy od temperatury, intensywności fal ultradźwiękowych i siły jonowej mediów stosowanych do rozpuszczania polimeru. (por. Pandit et al., 2021)
 
W innym badaniu Zhu et al. (2019) wykorzystali proszki zarodników Ganoderma lucidum jako surowiec grzybowy i zbadali deacetylację wspomaganą ultradźwiękami oraz wpływ parametrów przetwarzania, takich jak czas sonikacji, stosunek ciała stałego do cieczy, stężenie NaOH i moc napromieniowania na stopień deacetylacji (DD) chitozanu. Najwyższą wartość DD uzyskano przy następujących parametrach ultradźwiękowych: 20 min sonikacji przy 80 W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Morfologię powierzchni, grupy chemiczne, stabilność termiczną i krystaliczność uzyskanego ultradźwiękowo chitozanu badano za pomocą SEM, FTIR, TG i XRD. Zespół badawczy donosi o znacznym zwiększeniu stopnia deacetylacji (DD), lepkości dynamicznej ([η]) i masy cząsteczkowej (Mv¯) ultradźwiękowo wytwarzanego chitozanu. Wyniki podkreśliły, że ultradźwiękowa technika deacetylacji grzybów jest wysoce skuteczną metodą produkcji chitozanu, która jest odpowiednia do zastosowań biomedycznych. (por. Zhu et al., 2019)

Najwyższa jakość chitozanu dzięki depolimeryzacji ultradźwiękowej i deacetylacji

Procesy ekstrakcji i depolimeryzacji chityny / chitozanu napędzane ultradźwiękami są precyzyjnie kontrolowane, a parametry procesu ultradźwiękowego można dostosować do surowców i docelowej jakości produktu końcowego (np. masy cząsteczkowej, stopnia deacetylacji). Pozwala to na dostosowanie procesu ultradźwiękowego do czynników zewnętrznych i ustawienie optymalnych parametrów dla lepszego wyniku i wydajności.
Ultradźwiękowo deacetylowany chitozan wykazuje doskonałą biodostępność i biokompatybilność. Gdy ultradźwiękowo przygotowane biopolimery chitozanu są porównywane z termicznie otrzymywanym chitozanem pod względem właściwości biomedycznych, ultradźwiękowo wytwarzany chitozan wykazuje znacznie lepszą żywotność fibroblastów (komórek L929) i zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną zarówno dla Escherichia coli (E. coli), jak i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(por. Zhu i in., 2018)
 

Obrazy skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w powiększeniu 100× a) gladiusa, b) gladiusa poddanego działaniu ultradźwięków, c) β-chityny, d) β-chityny poddanej działaniu ultradźwięków i e) chitozanu (źródło: Preto et al. 2017).

Wysokowydajny sprzęt ultradźwiękowy do przetwarzania chityny i chitozanu

Fragmentacja chityny i deketylacja chityny do chitozanu wymaga wydajnego i niezawodnego sprzętu ultradźwiękowego, który może dostarczać wysokie amplitudy, oferuje precyzyjną kontrolę nad parametrami procesu i może pracować 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu pod dużym obciążeniem i w wymagających środowiskach. Asortyment produktów Hielscher Ultrasonics niezawodnie spełnia te wymagania. Oprócz wyjątkowej wydajności ultradźwiękowej, ultradźwięki Hielscher charakteryzują się wysoką wydajnością energetyczną, co jest znaczącą zaletą ekonomiczną – szczególnie w przypadku komercyjnej produkcji na dużą skalę.
Ultradźwięki Hielscher to wysokowydajne systemy, które mogą być wyposażone w akcesoria, takie jak sonotrody, wzmacniacze, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dopasować się do potrzeb procesu.Dzięki cyfrowemu kolorowemu wyświetlaczowi, opcji wstępnego ustawiania przebiegów sonikacji, automatycznemu zapisowi danych na zintegrowanej karcie SD, zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę i wielu innym funkcjom, ultradźwięki Hielscher zapewniają najwyższą kontrolę procesu i łatwość obsługi. W połączeniu z solidnością i dużą nośnością, systemy ultradźwiękowe Hielscher są niezawodnym koniem roboczym w produkcji. Fragmentacja i deacetylacja chityny wymaga silnych ultradźwięków, aby uzyskać ukierunkowaną konwersję i końcowy produkt chitozanowy wysokiej jakości. Szczególnie w przypadku fragmentacji płatków chityny i etapów depolimeryzacji / deacetylacji kluczowe znaczenie mają wysokie amplitudy i podwyższone ciśnienia. Przemysłowe procesory ultradźwiękowe firmy Hielscher Ultrasonics z łatwością zapewniają bardzo wysokie amplitudy. Amplitudy do 200 µm mogą być stale uruchamiane w trybie 24/7. Dla jeszcze wyższych amplitud dostępne są niestandardowe sonotrody ultradźwiękowe. Moc systemów ultradźwiękowych Hielscher pozwala na wydajną i szybką depolimeryzację i deacetylację w bezpiecznym i przyjaznym dla użytkownika procesie.
 

Synergiczne leczenie chityną poprawione przez ultradźwięki

W celu przezwyciężenia wad (tj. niskiej wydajności, wysokich kosztów energii, długiego czasu przetwarzania, toksycznych rozpuszczalników) tradycyjnej chemicznej i enzymatycznej deacetylacji chityny, ultradźwięki o wysokiej intensywności zostały zintegrowane z przetwarzaniem chityny i chitozanu. Sonikacja o wysokiej intensywności i wynikające z niej efekty kawitacji akustycznej prowadzą do szybkiego rozszczepienia łańcuchów polimerowych i zmniejszenia polidyspersyjności, promując w ten sposób syntezę chitozanu. Ponadto ultradźwiękowe siły ścinające intensyfikują przenoszenie masy w roztworze, dzięki czemu reakcje chemiczne, hydrolityczne lub enzymatyczne są wzmocnione. Ultradźwiękowa obróbka chityny może być łączona z już istniejącymi technikami przetwarzania chityny, takimi jak metody chemiczne, hydroliza lub procedury enzymatyczne.

Deacetylacja i depolimeryzacja chemiczna wspomagana ultradźwiękami

Ponieważ chityna jest niereaktywnym i nierozpuszczalnym biopolimerem, musi zostać poddana procesom demineralizacji, deproteinizacji i depolimeryzacji / deacetylacji w celu uzyskania rozpuszczalnego i biodostępnego chitozanu. Te etapy procesu obejmują obróbkę silnymi kwasami, takimi jak HCl i silnymi zasadami, takimi jak NaOH i KOH. Ponieważ te konwencjonalne etapy procesu są nieefektywne, powolne i wymagają dużej energii, intensyfikacja procesu poprzez sonikację znacznie poprawia produkcję chitozanu. Zastosowanie ultradźwięków zwiększa wydajność i jakość chitozanu, skraca proces z kilku dni do kilku godzin, pozwala na stosowanie łagodniejszych rozpuszczalników i sprawia, że cały proces jest bardziej energooszczędny.

Ultradźwiękowo ulepszona deproteinizacja chityny

Vallejo-Dominguez i wsp. (2021) stwierdzili w swoim badaniu deproteinizacji chityny, że “Zastosowanie ultradźwięków do produkcji biopolimerów zmniejszyło zawartość białka, jak również wielkość cząstek chityny. Chitozan o wysokim stopniu deacetylacji i średniej masie cząsteczkowej został wyprodukowany przy pomocy ultradźwięków.”

Hydroliza ultradźwiękowa do depolimeryzacji chityny

W przypadku hydrolizy chemicznej do deacetylacji chityny stosuje się kwasy lub zasady, jednak deacetylacja alkaliczna (np. wodorotlenek sodu NaOH) jest częściej stosowana. Hydroliza kwasowa jest metodą alternatywną do tradycyjnej deacetylacji chemicznej, w której do depolimeryzacji chityny i chitozanu stosuje się roztwory kwasów organicznych. Metoda hydrolizy kwasowej jest najczęściej stosowana, gdy masa cząsteczkowa chityny i chitozanu musi być jednorodna. Ten konwencjonalny proces hydrolizy jest znany jako powolny, energochłonny i kosztowny. Wymóg stosowania silnych kwasów, wysokich temperatur i ciśnień to czynniki, które sprawiają, że proces hydrolizy chitozanu staje się bardzo kosztowną i czasochłonną procedurą. Stosowane kwasy wymagają dalszych procesów, takich jak neutralizacja i odsalanie.
Dzięki integracji ultradźwięków o dużej mocy z procesem hydrolizy, wymagania dotyczące temperatury i ciśnienia dla hydrolitycznego rozszczepienia chityny i chitozanu mogą być znacznie obniżone. Ponadto, sonikacja pozwala na niższe stężenia kwasu lub stosowanie łagodniejszych kwasów. Dzięki temu proces jest bardziej zrównoważony, wydajny, opłacalny i przyjazny dla środowiska.

Deacetylacja chemiczna wspomagana ultradźwiękami

Chemiczna dezintegracja i dezaktywacja chityny i chitozanu odbywa się głównie poprzez traktowanie chityny lub chitozanu kwasami mineralnymi (np. kwasem solnym HCl), azotynem sodu (NaNO₂) lub nadtlenek wodoru (H₂O₂). Ultradźwięki poprawiają szybkość deacetylacji, skracając tym samym czas reakcji wymagany do uzyskania docelowego stopnia deacetylacji. Oznacza to, że sonikacja skraca wymagany czas przetwarzania z 12-24 godzin do kilku godzin. Ponadto sonikacja pozwala na znacznie niższe stężenia chemiczne, na przykład 40% (w/w) wodorotlenku sodu przy użyciu sonikacji, podczas gdy 65% (w/w) jest wymagane bez użycia ultradźwięków.

Deacetylacja ultradźwiękowo-enzymatyczna

Chociaż enzymatyczna deacetylacja jest łagodną, przyjazną dla środowiska formą przetwarzania, jej wydajność i koszty są nieopłacalne. Ze względu na złożoną, pracochłonną i kosztowną izolację i oczyszczanie enzymów z produktu końcowego, enzymatyczna deacetylacja chityny nie jest stosowana w produkcji komercyjnej, a jedynie w laboratoriach naukowych.
Ultradźwiękowa obróbka wstępna przed enzymatyczną deacetylacją rozdrabnia cząsteczki chityny, zwiększając w ten sposób powierzchnię i zwiększając powierzchnię dostępną dla enzymów. Wysokowydajna sonikacja pomaga poprawić enzymatyczną deacetylację i czyni proces bardziej ekonomicznym.