Produkcja chityny i chitozanu z grzybów

Ultradźwięki są wysoce efektywną metodą uwalniania chityny i chitozanu z grzybów, takich jak grzyby. Chityna i chitozan muszą być deacetylowane w dalszych etapach przetwarzania w celu uzyskania wysokiej jakości biopolimeru. Wspomagana ultradźwiękami deacetylacja jest wysoce skuteczną, prostą i szybką techniką, dzięki której uzyskuje się wysokiej jakości chitozany o dużej masie cząsteczkowej i doskonałej biodostępności.

Chityna i chitozan z grzybów

Grzyby jadalne i lecznicze, takie jak Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi lub reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (pieczarki), Hericium erinaceus (lwia grzywa), Cordyceps sinensis (grzyb gąsienicowy), Grifola frondosa (kurka leśna), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, turówka) i wiele innych gatunków grzybów jest szeroko wykorzystywanych jako żywność oraz do ekstrakcji związków bioaktywnych. Grzyby te, jak również pozostałości po obróbce (odpady grzybowe) mogą być wykorzystane do produkcji chitozanu. Ultradźwięki nie tylko sprzyjają uwalnianiu chityny ze struktury ściany komórkowej grzybów, ale także prowadzą do przekształcenia chityny w cenny chitozan poprzez ultradźwiękową depolimeryzację.

eacetylacja chityny do chitozanu jest promowana przez sonizację.

chityna, która jest polimerem N-acetyloglukozaminy (poli(β-(1-4)-N-acetylo-D-glukozaminy), jest naturalnie występującym polisacharydem szeroko rozpowszechnionym w egzoszkielecie bezkręgowców, takich jak skorupiaki i owady, w szkielecie wewnętrznym kałamarnicy i mątwy, jak również w ścianach komórkowych grzybów. Wbudowana w strukturę ścian komórkowych grzybów, chityna odpowiada za kształt i sztywność ściany komórkowej grzyba. W wielu zastosowaniach chityna jest przekształcana w procesie depolimeryzacji do swojej deacetylowanej pochodnej, znanej jako chitozan.
chitozan jest najbardziej rozpowszechnioną i najcenniejszą pochodną chityny. Jest to wielkocząsteczkowy polisacharyd połączony b-1,4 glikozydem, zbudowany z N-acetylo-glukozaminy i glukozaminy.
Chitozan można otrzymać na drodze chemicznej lub enzymatycznej n-deacetylacja. W chemicznie napędzanym procesie deacetylacji, grupa acetylowa (R-NHCOCH₃) ulega rozszczepieniu pod wpływem silnych zasad w wysokiej temperaturze. Alternatywnie, chitozan może być syntetyzowany poprzez enzymatyczną deacetylację. Jednakże, na skalę produkcji przemysłowej preferowaną techniką jest deacetylacja chemiczna, ponieważ deacetylacja enzymatyczna jest znacznie mniej wydajna ze względu na wysoki koszt enzymów deacetylazowych i niskie wydajności otrzymywanego chitozanu. Za pomocą ultradźwięków intensyfikuje się chemiczną degradację wiązań (1→4)-/β (depolimeryzacja) oraz deacetylację chityny w celu uzyskania wysokiej jakości chitozanu. Kiedy sonikacja jest stosowana jako obróbka wstępna do enzymatycznej deacetylacji, wydajność i jakość chitozanu również ulega poprawie.

Przemysłowa produkcja chitozanu z grzybów przy użyciu ultradźwięków

Komercyjna produkcja chityny i chitozanu opiera się głównie na odpadach z przemysłu morskiego (tj. rybołówstwa, połowu skorupiaków itp.). Różne źródła surowca skutkują różną jakością chityny i chitozanu, co powoduje wahania produkcji i jakości wynikające z sezonowych zmian w połowach. Ponadto, chitozan pochodzący ze źródeł grzybowych oferuje podobno lepsze właściwości, takie jak jednorodna długość polimeru i większa rozpuszczalność w porównaniu z chitozanem pochodzącym ze źródeł morskich. (por. Ghormade i in., 2017) W celu dostarczenia jednorodnego chitozanu, ekstrakcja chityny z gatunków grzybów stała się stabilną alternatywną produkcją. Produkcja chityny i citiosanu z grzybów może być łatwo i niezawodnie osiągnięta przy użyciu technologii ultradźwiękowej ekstrakcji i deacetylacji. Intensywna sonikacja zaburza struktury komórkowe w celu uwolnienia chityny i promuje transfer masy w rozpuszczalnikach wodnych, co zapewnia najwyższą wydajność chityny i efektywność ekstrakcji. Późniejsza ultradźwiękowa deacetylacja przekształca chitynę w cenny chitozan. Zarówno ultradźwiękowa ekstrakcja chityny, jak i jej deacetylacja do chitozanu mogą być liniowo skalowane do dowolnego poziomu produkcji komercyjnej.

Sonikacja intensyfikuje produkcję chitozanu grzybowego i czyni ją bardziej wydajną i ekonomiczną.
(zdjęcie i opracowanie: © Zhu et al., 2019)

Wysoce wydajna synteza chitozanu poprzez sonikację

W celu przezwyciężenia wad (tj. niska wydajność, wysoki koszt energii, długi czas przetwarzania, toksyczne rozpuszczalniki) tradycyjnej chemicznej i enzymatycznej deacetylacji chityny, ultradźwięki o wysokiej intensywności zostały włączone do przetwarzania chityny i chitozanu. Sonikacja o wysokiej intensywności i wynikające z niej efekty kawitacji akustycznej prowadzą do szybkiego rozszczepienia łańcuchów polimerowych i zmniejszenia polidyspersyjności, sprzyjając w ten sposób syntezie chitozanu. Ponadto, ultradźwiękowe siły ścinające intensyfikują przenoszenie masy w roztworze, dzięki czemu reakcje chemiczne, hydrolityczne lub enzymatyczne ulegają wzmocnieniu.

Chemiczna deacetylacja i depolimeryzacja wspomagana ultradźwiękami

Ponieważ chityna jest niereaktywnym i nierozpuszczalnym biopolimerem, musi być poddana procesom demineralizacji, deproteinizacji i depolimeryzacji/dezacetylacji, aby otrzymać rozpuszczalny i biodostępny chitozan. Te etapy procesu obejmują traktowanie silnymi kwasami, takimi jak HCl i silnymi zasadami, takimi jak NaOH i KOH. Ponieważ te konwencjonalne etapy procesu są nieefektywne, powolne i wymagają dużych nakładów energii, intensyfikacja procesu poprzez sonikację znacznie poprawia produkcję chitozanu. Zastosowanie ultradźwięków zwiększa wydajność i jakość chitozanu, skraca proces z kilku dni do kilku godzin, pozwala na zastosowanie łagodniejszych rozpuszczalników i sprawia, że cały proces jest bardziej energooszczędny.

Ultradźwiękowo ulepszona deproteinizacja chityny

Vallejo-Dominguez i wsp. (2021) w swoich badaniach nad deproteinizacją chityny stwierdzili, że "zastosowanie ultradźwięków do produkcji biopolimerów zmniejszyło zawartość białka, jak również wielkość cząstek chityny. Chitozan o wysokim stopniu deacetylacji i średniej masie cząsteczkowej został wytworzony przy pomocy ultradźwięków.

Ultradźwiękowa hydroliza do depolimeryzacji chityny

W przypadku hydrolizy chemicznej, do deacetylacji chityny stosuje się kwasy lub zasady, przy czym deacetylacja zasadowa (np. wodorotlenek sodu NaOH) jest szerzej stosowana. Hydroliza kwasowa jest metodą alternatywną do tradycyjnej deacetylacji chemicznej, w której do depolimeryzacji chityny i chitozanu stosuje się roztwory kwasów organicznych. Metoda hydrolizy kwasowej jest stosowana głównie wtedy, gdy masa cząsteczkowa chityny i chitozanu musi być jednorodna. Ten konwencjonalny proces hydrolizy jest znany jako powolny, energo- i kosztochłonny. Wymóg stosowania silnych kwasów, wysokich temperatur i ciśnień to czynniki, które sprawiają, że proces hydrolizy chitozanu jest bardzo kosztowny i czasochłonny. Stosowane kwasy wymagają dalszych procesów, takich jak neutralizacja i odsalanie.
Dzięki włączeniu ultradźwięków o dużej mocy do procesu hydrolizy można znacznie obniżyć wymagania dotyczące temperatury i ciśnienia przy hydrolitycznym rozszczepianiu chityny i chitozanu. Ponadto sonikacja pozwala na obniżenie stężenia kwasu lub zastosowanie łagodniejszych kwasów. Dzięki temu proces jest bardziej trwały, wydajny, ekonomiczny i przyjazny dla środowiska.

Deacetylacja chemiczna wspomagana ultradźwiękami

Chemiczny rozpad i dezaktywację chityny i chitozanu przeprowadza się głównie poprzez poddanie chityny lub chitozanu działaniu kwasów mineralnych (np. kwasu solnego HCl), azotynu sodu (NaNO₂), lub nadtlenku wodoru (H₂O₂). Ultradźwięki zwiększają szybkość deacetylacji, skracając tym samym czas reakcji wymagany do uzyskania docelowego stopnia deacetylacji. Oznacza to, że sonikacja skraca wymagany czas przetwarzania z 12-24 godzin do kilku godzin. Ponadto, sonikacja umożliwia stosowanie znacznie niższych stężeń chemicznych, na przykład 40% (w/w) wodorotlenku sodu przy zastosowaniu sonikacji, podczas gdy bez zastosowania ultradźwięków wymagane jest 65% (w/w).

Ultradźwiękowo-enzymatyczna deacetylacja

Chociaż enzymatyczna deacetylacja jest łagodną, nieszkodliwą dla środowiska formą przetwarzania, jej wydajność i koszty są nieekonomiczne. Ze względu na skomplikowaną, pracochłonną i kosztowną izolację i oczyszczanie enzymów z produktu końcowego, enzymatyczne odacetylanie chityny nie jest wdrażane do produkcji komercyjnej, a jedynie stosowane w laboratoriach naukowych.
Wstępna obróbka ultradźwiękowa przed deacetylacją enzymatyczną powoduje fragmentację cząsteczek chityny, co zwiększa powierzchnię i czyni ją bardziej dostępną dla enzymów. Wysokowydajna sonikacja pomaga usprawnić enzymatyczną deacetylację i czyni proces bardziej ekonomicznym.

Wyniki badań dla ultradźwiękowej deacetylacji chityny i chitozanu

Zhu i wsp. (2018) stwierdzają w swojej pracy, że ultradźwiękowa deacetylacja okazała się kluczowym przełomem, przekształcając β-chitynę w chitozan z 83-94% deacetylacją w obniżonych temperaturach reakcji. Zdjęcie po lewej stronie przedstawia obraz SEM ultradźwiękowo deacetylowanego chitozanu (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (zdjęcie i opracowanie: © Zhu et al., 2018)
W ich protokole, roztwór NaOH (20 w/v %) został przygotowany przez rozpuszczenie płatków NaOH w wodzie DI. Roztwór alkaliczny został następnie dodany do osadu GLSP (0,5 g) w stosunku ciało stałe-ciecz 1:20 (g: mL) do probówki wirówkowej. Chitozan dodano do NaCl (40 mL, 0,2 M) i kwasu octowego (0,1 M) w stosunku objętościowym roztworu 1:1. Następnie zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków w łagodnej temperaturze 25°C przez 60 min przy użyciu ultrasonografu typu sonda (250W, 20kHz). (por. Zhu i in., 2018)
Pandit et al. (2021) stwierdzili, że na szybkość degradacji roztworów chitozanu rzadko ma wpływ stężenie kwasu użytego do rozpuszczania polimeru, a w dużej mierze zależy ona od temperatury, intensywności fal ultradźwiękowych i siły jonowej mediów użytych do rozpuszczenia polimeru. (por. Pandit et al., 2021)

W innej pracy, Zhu i wsp. (2019) wykorzystali sproszkowane zarodniki Ganoderma lucidum jako surowiec grzybowy i zbadali wspomaganą ultradźwiękami deacetylację oraz wpływ parametrów przetwarzania, takich jak czas sonikacji, stosunek ciała stałego do cieczy, stężenie NaOH i moc napromieniowania na stopień deacetylacji (DD) chitozanu. Największą wartość DD uzyskano przy następujących parametrach ultradźwiękowych: 20 min sonikacji przy 80 W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Metodami SEM, FTIR, TG i XRD zbadano morfologię powierzchni, zawartość grup chemicznych, stabilność termiczną i krystaliczność otrzymanego ultradźwiękowo chitozanu. Zespół badawczy donosi o znacznym zwiększeniu stopnia deacetylacji (DD), lepkości dynamicznej ([η]) i ciężaru cząsteczkowego (Mv¯) ultradźwiękowo otrzymanego chitozanu. Wyniki te podkreśliły, że technika ultradźwiękowej deacetylacji grzybów jest wysoce wydajną metodą produkcji chitozanu, która jest odpowiednia do zastosowań biomedycznych. (por. Zhu et al., 2019)

Obrazy SEM chityn i chitozanów z dwóch gatunków grzybów: a) chityna z L. vellereus; b) chityna z P. ribis; c) chitozan z L.vellereus; d) chitozan z P. ribis.
zdjęcie i opracowanie: © Erdoğan et al., 2017

Najwyższa jakość chitozanu dzięki ultradźwiękowej deacetylacji

Ultradźwiękowe procesy ekstrakcji i depolimeryzacji chityny/chitozanu są precyzyjnie sterowane, a parametry procesu można dostosować do surowców i docelowej jakości produktu końcowego (np. masa cząsteczkowa, stopień deacetylacji). Pozwala to na dostosowanie procesu ultradźwiękowego do czynników zewnętrznych i ustawienie optymalnych parametrów dla uzyskania doskonałego wyniku i wydajności.
Ultradźwiękowo deacetylowany chitozan wykazuje doskonałą biodostępność i biokompatybilność. Porównując pod względem właściwości biomedycznych biopolimery chitozanowe otrzymane metodą ultradźwiękową z chitozanem otrzymanym termicznie, stwierdzono, że chitozan otrzymany metodą ultradźwiękową wykazuje znacznie lepszą żywotność fibroblastów (komórek L929) oraz zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną zarówno dla Escherichia coli (E. coli), jak i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(por. Zhu et al., 2018)

Jak działa ultradźwiękowa ekstrakcja i deacetylacja chityny?

Kiedy fale ultradźwiękowe o dużej mocy są sprzężone z cieczą lub zawiesiną (np. zawiesina składająca się z chityny w rozpuszczalniku), fale ultradźwiękowe przemieszczają się przez ciecz, powodując naprzemienne cykle wysokiego i niskiego ciśnienia. Podczas cykli niskociśnieniowych tworzą się drobne pęcherzyki próżniowe (tzw. pęcherzyki kawitacyjne), które rosną przez kilka cykli ciśnieniowych. Po osiągnięciu pewnego rozmiaru, gdy pęcherzyki nie są w stanie zaabsorbować więcej energii, implodują one gwałtownie podczas cyklu wysokociśnieniowego. Implozja pęcherzyków charakteryzuje się intensywnymi siłami kawitacyjnymi (lub sonomechanicznymi). Te warunki sonomechaniczne występują lokalnie w kawitacyjnym punkcie zapalnym i charakteryzują się bardzo wysokimi temperaturami i ciśnieniami, odpowiednio do 4000K i 1000atm; jak również odpowiednio wysokimi różnicami temperatur i ciśnień. Ponadto, generowane są mikroturbulencje i strumienie cieczy o prędkościach do 100m/s. Ultradźwiękowa ekstrakcja chityny i chitozanu z grzybów i skorupiaków, jak również depolimeryzacja i deacetylacja chityny są spowodowane głównie efektami sonomechanicznymi: mieszanie i turbulencje rozbijają komórki i promują transfer masy, a także mogą przecinać łańcuchy polimerowe w połączeniu z kwaśnymi lub zasadowymi rozpuszczalnikami.
Zasada działania ekstrakcji chityny za pomocą ultradźwięków: Ekstrakcja ultradźwiękowa skutecznie rozbija strukturę komórkową grzybów i uwalnia do rozpuszczalnika związki wewnątrzkomórkowe ze ściany komórkowej i wnętrza komórki (tj. polisacharydy takie jak chityna i chitozan oraz inne bioaktywne fitozwiązki). Ekstrakcja ultradźwiękowa oparta jest na zasadzie działania kawitacji akustycznej. Efektem kawitacji ultradźwiękowej / akustycznej są duże siły ścinające, turbulencje i intensywne różnice ciśnień. Te sonomechaniczne siły rozbijają struktury komórkowe, takie jak chitynowe ściany komórkowe grzybów, promują transfer masy pomiędzy biomateriałem grzyba a rozpuszczalnikiem i prowadzą do bardzo wysokiej wydajności ekstraktu w szybkim procesie. Dodatkowo, sonikacja sprzyja sterylizacji ekstraktów poprzez zabijanie bakterii i mikrobów. Inaktywacja mikroorganizmów przez sonikację jest wynikiem niszczących sił kawitacyjnych działających na błonę komórkową, produkcji wolnych rodników i miejscowego ogrzewania.
Zasada działania depolimeryzacji i deacetylacji za pomocą ultradźwięków: Łańcuchy polimerowe są zatrzymywane w polu ścinania wokół pęcherzyka, a segmenty łańcucha polimerowego w pobliżu zapadającej się wnęki będą poruszać się z większą prędkością niż segmenty znajdujące się dalej. W łańcuchu polimerowym powstają naprężenia spowodowane względnym ruchem segmentów polimeru i rozpuszczalników, które są wystarczające do spowodowania rozszczepienia. Proces ten jest więc podobny do innych efektów ścinania w roztworach polimerów ~2° i daje bardzo podobne rezultaty. (por. Price et al., 1994)

Wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe do przetwarzania chityny i chitozanu pochodzenia grzybowego

Skaningowe obrazy mikroskopii elektronowej (SEM) w powiększeniu 100 × a) mieczyk, b) mieczyk poddany działaniu ultradźwięków, c) β-chityna, d) β-chityna poddana działaniu ultradźwięków oraz e) chitozan (źródło: Preto i in. 2017).

Rozdrabnianie chityny i jej deketylacja do chitozanu wymaga wydajnych i niezawodnych urządzeń ultradźwiękowych o wysokich amplitudach, z możliwością precyzyjnego sterowania parametrami procesu i możliwością pracy w trybie 24/7 przy dużym obciążeniu i w trudnych warunkach otoczenia. Program produktów firmy Hielscher Ultrasonics spełnia te wymagania w sposób niezawodny. Oprócz doskonałych parametrów ultradźwiękowych ultradźwięki firmy Hielscher charakteryzują się wysoką sprawnością energetyczną, co stanowi istotną zaletę ekonomiczną. – zwłaszcza przy zastosowaniu w produkcji na dużą skalę.
Ultradźwiękowe urządzenia firmy Hielscher są wysokowydajnymi systemami, które mogą być wyposażone w akcesoria takie jak sonotrody, boostery, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dopasować się do potrzeb procesowych.Dzięki cyfrowemu kolorowemu wyświetlaczowi, możliwości zaprogramowania przebiegu sonikacji, automatycznemu zapisowi danych na zintegrowanej karcie SD, zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę i wielu innym funkcjom zapewniona jest najwyższa kontrola procesu i łatwość obsługi. W połączeniu z wytrzymałością i dużą nośnością systemy ultradźwiękowe firmy Hielscher są niezawodnym koniem roboczym w produkcji. Fragmentacja i deacetylacja chityny wymaga silnych ultradźwięków, aby uzyskać ukierunkowaną konwersję i wysokiej jakości produkt końcowy chitozanu. Szczególnie przy rozdrabnianiu płatków chityny oraz na etapach depolimeryzacji/deacetylacji decydujące znaczenie mają wysokie amplitudy i podwyższone ciśnienia. Przemysłowe procesory ultradźwiękowe firmy Hielscher Ultrasonics z łatwością osiągają bardzo wysokie amplitudy. Amplitudy do 200µm mogą pracować w trybie ciągłym 24/7. Dla jeszcze większych amplitud dostępne są sonotrody ultradźwiękowe dostosowane do potrzeb klienta. Moc urządzeń ultradźwiękowych firmy Hielscher pozwala na efektywną i szybką deacetylację w bezpiecznym i przyjaznym dla użytkownika procesie.
Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators: