Produkcja chityny i chitozanu z grzybów

Sonikacja jest wysoce wydajną metodą uwalniania chityny i chitozanu ze źródeł grzybowych, takich jak grzyby kapeluszowe. Chityna i chitozan muszą zostać poddane depolimeryzacji i deacetylacji na dalszych etapach przetwarzania, aby uzyskać biopolimer wysokiej jakości. Wspomagane ultradźwiękami depolimeryzacja i deacetylacja stanowią wysoce skuteczną, prostą i szybką technikę, która pozwala uzyskać wysokiej jakości chitozany o dużej masie cząsteczkowej i lepszej biodostępności.

Chityna i chitozan z grzybów otrzymywane za pomocą sonikacji

Grzyby jadalne i lecznicze, takie jak Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (lingzhi lub reishi), Inonotus obliquus (czaga), Agaricus bisporus (pieczarka dwuzarodnikowa), Hericium erinaceus (soplówka jeżowata), Cordyceps sinensis (maczużnik chiński), Grifola frondosa (żagwica listkowata), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, wrośniak różnobarwny) oraz wiele innych gatunków grzybów są szeroko wykorzystywane jako żywność oraz do ekstrakcji związków bioaktywnych. Grzyby te, a także pozostałości po ich przetwarzaniu (odpady grzybowe), mogą być wykorzystywane do produkcji chitozanu. Sonikacja nie tylko wspomaga uwalnianie chityny ze struktury ściany komórkowej grzybów, lecz także prowadzi do przekształcania chityny w cenny chitozan poprzez wspomagane ultradźwiękami depolimeryzację i deacetylację.

Sonikacja wspomaga depolimeryzację i deacetylację chityny do chitozanu

Intensywna sonikacja z wykorzystaniem układu ultradźwiękowego z sonotrodą jest techniką stosowaną do wspomagania depolimeryzacji i deacetylacji chityny, prowadzących do powstawania chitozanu. Chityna jest naturalnie występującym polisacharydem obecnym w egzoszkieletach skorupiaków i owadów oraz w ścianach komórkowych niektórych grzybów. Chitozan otrzymuje się z chityny poprzez usunięcie grup acetylowych z jej cząsteczki.

Ultradźwiękowa procedura przekształcania chityny grzybowej w chitozan

Podczas stosowania intensywnej sonikacji do produkcji chitozanu z chityny zawiesinę chityny poddaje się działaniu fal ultradźwiękowych o wysokiej intensywności i niskiej częstotliwości, zwykle w zakresie od 20 kHz do 30 kHz. Proces ten generuje intensywną kawitację akustyczną, polegającą na powstawaniu, wzroście i zapadaniu się mikroskopijnych pęcherzyków próżniowych w cieczy. Kawitacja wytwarza lokalnie niezwykle duże siły ścinające, wysokie temperatury (do kilku tysięcy stopni Celsjusza) i ciśnienia (do kilkuset atmosfer) w cieczy otaczającej pęcherzyki kawitacyjne. Te ekstremalne warunki przyczyniają się do rozpadu polimeru chityny i następującej po nim deacetylacji.
 

Obrazy SEM chityn i chitozanów z dwóch gatunków grzybów: a) chityna z L. vellereus; b) chityna z P. ribis; c) chitozan z L.vellereus; d) chitozan z P. ribis.
zdjęcie i badanie: © Erdoğan et al., 2017

Ultradźwiękowa depolimeryzacja chityny

Depolimeryzacja chityny zachodzi wskutek łącznego działania sił mechanicznych, takich jak mikroprzepływy i strumienie cieczy, a także inicjowanych ultradźwiękami reakcji chemicznych wywoływanych przez wolne rodniki i inne reaktywne formy powstające podczas kawitacji. Fale wysokiego ciśnienia generowane podczas kawitacji poddają łańcuchy chityny naprężeniom ścinającym, powodując rozszczepienie polimeru na mniejsze fragmenty.

Ultradźwiękowa deacetylacja chityny

Oprócz depolimeryzacji intensywna sonikacja wspomaga również deacetylację chityny. Deacetylacja polega na usunięciu grup acetylowych z cząsteczki chityny, co prowadzi do powstania chitozanu. Intensywna energia ultradźwiękowa, a w szczególności wysokie temperatury i ciśnienia generowane podczas kawitacji, przyspieszają reakcję deacetylacji. Warunki sprzyjające reakcjom, wytwarzane przez kawitację, pomagają rozrywać wiązania grup acetylowych w chitynie, prowadząc do uwalniania kwasu octowego i przekształcania chityny w chitozan.
Ogólnie intensywna sonikacja usprawnia zarówno depolimeryzację, jak i deacetylację, dostarczając energii mechanicznej i chemicznej niezbędnej do rozkładu polimeru chityny i ułatwienia jego przekształcenia w chitozan. Technika ta stanowi szybką i wydajną metodę produkcji chitozanu z chityny, mającą liczne zastosowania w różnych branżach, w tym w farmacji, rolnictwie i inżynierii biomedycznej.

Przemysłowa produkcja chitozanu z grzybów za pomocą ultradźwięków dużej mocy

Komercyjna produkcja chityny i chitozanu opiera się głównie na odpadach z branż morskich (tj. rybołówstwa, pozyskiwania skorupiaków i mięczaków itp.). Różne źródła surowców prowadzą do uzyskiwania chityny i chitozanu o różnej jakości, co skutkuje wahaniami produkcji i jakości związanymi z sezonową zmiennością połowów. Ponadto według doniesień chitozan pochodzący ze źródeł grzybowych wykazuje lepsze właściwości, takie jak jednorodna długość łańcuchów polimeru i większa rozpuszczalność, w porównaniu z chitozanem ze źródeł morskich. (por. Ghormade et al., 2017) Aby zapewnić dostawy chitozanu o jednolitych właściwościach, ekstrakcja chityny z gatunków grzybów stała się stabilną alternatywną metodą produkcji. Produkcję chityny i chitozanu z grzybów można prowadzić łatwo i niezawodnie, wykorzystując technologię ultradźwiękowej ekstrakcji i deacetylacji. Intensywna sonikacja rozbija struktury komórkowe, uwalniając chitynę, i wspomaga transport masy w rozpuszczalnikach wodnych, zapewniając większy uzysk chityny i lepszą wydajność ekstrakcji. Następująca po niej ultradźwiękowa deacetylacja przekształca chitynę w cenny chitozan. Zarówno ultradźwiękową ekstrakcję chityny, jak i jej deacetylację do chitozanu można skalować liniowo do dowolnego poziomu produkcji komercyjnej.

Sonikacja intensyfikuje produkcję chitozanu grzybowego i czyni ją bardziej wydajną i ekonomiczną.
(zdjęcie i badanie: © Zhu et al., 2019)

Wyniki badań nad ultradźwiękową deacetylacją chityny i chitozanu

Zhu et al. (2018) stwierdzają w swoim badaniu, że ultradźwiękowa deacetylacja okazała się kluczowym przełomem, umożliwiając przekształcenie β-chityny w chitozan o stopniu deacetylacji 83–94% przy obniżonych temperaturach reakcji. Zdjęcie po lewej przedstawia obraz SEM chitozanu poddanego ultradźwiękowej deacetylacji (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (zdjęcie i badanie: © Zhu et al., 2018)
W ich procedurze roztwór NaOH (20 w/v %) przygotowano przez rozpuszczenie płatków NaOH w wodzie dejonizowanej. Następnie roztwór zasady dodano do osadu GLSP (0,5 g) w probówce wirówkowej, przy stosunku fazy stałej do cieczy wynoszącym 1:20 (g: mL). Chitozan dodano do NaCl (40 mL, 0,2 M) i kwasu octowego (0,1 M) przy stosunku objętości roztworów 1:1. Następnie zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków w łagodnej temperaturze 25°C przez 60 min za pomocą sonikatora z sonotrodą (250W, 20kHz). (por. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) stwierdzili, że stężenia kwasu stosowanego do rozpuszczania polimeru rzadko wpływają na szybkość degradacji roztworów chitozanu, a szybkość ta w dużej mierze zależy od temperatury, intensywności fal ultradźwiękowych i siły jonowej ośrodków stosowanych do rozpuszczania polimeru. (por. Pandit et al., 2021)
 
W innym badaniu Zhu et al. (2019) wykorzystali proszki z zarodników Ganoderma lucidum jako surowiec grzybowy i badali deacetylację wspomaganą ultradźwiękami oraz wpływ parametrów przetwarzania, takich jak czas sonikacji, stosunek fazy stałej do cieczy, stężenie NaOH i moc napromieniania, na stopień deacetylacji (DD) chitozanu. Najwyższą wartość DD uzyskano przy następujących parametrach ultradźwiękowych: 20 min sonikacji przy 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Morfologię powierzchni, grupy chemiczne, stabilność termiczną i krystaliczność chitozanu otrzymanego ultradźwiękowo zbadano za pomocą SEM, FTIR, TG i XRD. Zespół badawczy donosi o znaczącym zwiększeniu stopnia deacetylacji (DD), lepkości dynamicznej ([η]) i masy cząsteczkowej (Mv¯) chitozanu wytworzonego ultradźwiękowo. Wyniki podkreśliły, że technika ultradźwiękowej deacetylacji materiału grzybowego jest wysoce skuteczną metodą produkcji chitozanu nadającego się do zastosowań biomedycznych. (por. Zhu et al., 2019)

Lepsza jakość chitozanu dzięki ultradźwiękowej depolimeryzacji i deacetylacji

Procesami ekstrakcji i depolimeryzacji chityny / chitozanu prowadzonymi za pomocą ultradźwięków można precyzyjnie sterować, a parametry procesu ultradźwiękowego można dostosować do surowców i docelowej jakości produktu końcowego (np. masy cząsteczkowej, stopnia deacetylacji). Pozwala to dostosować proces ultradźwiękowy do czynników zewnętrznych i ustawić optymalne parametry w celu uzyskania lepszych rezultatów i wydajności.
Chitozan poddany ultradźwiękowej deacetylacji wykazuje doskonałą biodostępność i biokompatybilność. Przy porównaniu właściwości biomedycznych biopolimerów chitozanu przygotowanych ultradźwiękowo z chitozanem otrzymanym termicznie chitozan wytworzony ultradźwiękowo wykazuje znacznie lepszą żywotność fibroblastów (komórek L929) oraz zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną zarówno wobec Escherichia coli (E. coli), jak i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(por. Zhu et al., 2018)
 

Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w powiększeniu 100× przedstawiające a) gladius, b) gladius poddany działaniu ultradźwięków, c) β-chitynę, d) β-chitynę poddaną działaniu ultradźwięków oraz e) chitozan (źródło: Preto et al. 2017)

Wysokowydajne urządzenia ultradźwiękowe do przetwarzania chityny i chitozanu

Fragmentacja chityny i deacetylacja chityny do chitozanu wymagają wydajnych i niezawodnych urządzeń ultradźwiękowych, które mogą zapewniać wysokie amplitudy, umożliwiają precyzyjne sterowanie parametrami procesu i mogą pracować 24/7 pod dużym obciążeniem oraz w wymagających warunkach. Gama produktów Hielscher Ultrasonics niezawodnie spełnia te wymagania. Oprócz wyjątkowej wydajności ultradźwiękowej sonikatory Hielscher wyróżniają się wysoką sprawnością energetyczną, co stanowi znaczącą korzyść ekonomiczną – szczególnie przy zastosowaniu w komercyjnej produkcji na dużą skalę.
Sonikatory Hielscher to wysokowydajne systemy, które można wyposażyć w akcesoria, takie jak sonotrody, wzmacniacze amplitudy, reaktory lub komory przepływowe, aby optymalnie dopasować je do potrzeb procesu.
 Dzięki cyfrowemu kolorowemu wyświetlaczowi, możliwości wstępnego programowania przebiegów sonikacji, automatycznemu zapisywaniu danych na zintegrowanej karcie SD, zdalnemu sterowaniu przez przeglądarkę i wielu innym funkcjom sonikatory Hielscher zapewniają najwyższy poziom kontroli procesu i łatwości obsługi. W połączeniu z solidną konstrukcją i zdolnością do pracy pod dużym obciążeniem systemy ultradźwiękowe Hielscher są niezawodnymi urządzeniami do intensywnej pracy w produkcji. 
Fragmentacja i deacetylacja chityny wymagają ultradźwięków dużej mocy, aby uzyskać docelową konwersję i końcowy produkt chitozanowy wysokiej jakości. Wysokie amplitudy i podwyższone ciśnienia mają kluczowe znaczenie zwłaszcza dla fragmentacji płatków chityny oraz etapów depolimeryzacji / deacetylacji. Przemysłowe procesory ultradźwiękowe Hielscher Ultrasonics z łatwością zapewniają bardzo wysokie amplitudy. Amplitudy do 200µm można utrzymywać nieprzerwanie podczas pracy 24/7. Dla jeszcze wyższych amplitud dostępne są sonotrody ultradźwiękowe wykonywane na zamówienie. Moc systemów ultradźwiękowych Hielscher umożliwia wydajną i szybką depolimeryzację i deacetylację w bezpiecznym i łatwym w obsłudze procesie.
 

Synergistyczna obróbka chityny usprawniona przez sonikację

Aby przezwyciężyć wady (tj. niską wydajność, wysokie koszty energii, długi czas przetwarzania, toksyczne rozpuszczalniki) tradycyjnej chemicznej i enzymatycznej deacetylacji chityny, do przetwarzania chityny i chitozanu wprowadzono ultradźwięki o wysokiej intensywności. Sonikacja o wysokiej intensywności i wynikające z niej efekty kawitacji akustycznej prowadzą do szybkiego rozszczepiania łańcuchów polimeru i zmniejszają polidyspersyjność, wspomagając tym samym syntezę chitozanu. Ponadto ultradźwiękowe siły ścinające intensyfikują transport masy w roztworze, dzięki czemu usprawniają reakcje chemiczne, hydrolityczne lub enzymatyczne. Ultradźwiękową obróbkę chityny można łączyć z istniejącymi już technikami jej przetwarzania, takimi jak metody chemiczne, hydroliza lub procedury enzymatyczne.

Chemiczna deacetylacja i depolimeryzacja wspomagane ultradźwiękami

Ponieważ chityna jest niereaktywnym i nierozpuszczalnym biopolimerem, musi przejść etapy demineralizacji, deproteinizacji i depolimeryzacji / deacetylacji, aby uzyskać rozpuszczalny i biodostępny chitozan. Te etapy procesu obejmują obróbkę mocnymi kwasami, takimi jak HCl, i mocnymi zasadami, takimi jak NaOH i KOH. Ponieważ te konwencjonalne etapy procesu są niewydajne, powolne i wymagają dużych nakładów energii, intensyfikacja procesu przez sonikację znacząco usprawnia produkcję chitozanu. Zastosowanie ultradźwięków dużej mocy zwiększa uzysk i jakość chitozanu, skraca proces z kilku dni do kilku godzin, pozwala stosować łagodniejsze rozpuszczalniki i sprawia, że cały proces jest bardziej energooszczędny.

Deproteinizacja chityny usprawniona ultradźwiękami

Vallejo-Dominguez et al. (2021) stwierdzili w badaniu deproteinizacji chityny, że „zastosowanie ultradźwięków do produkcji biopolimerów zmniejszyło zawartość białka oraz wielkość cząstek chityny. Dzięki wspomaganiu ultradźwiękami otrzymano chitozan o wysokim stopniu deacetylacji i średniej masie cząsteczkowej”.

Ultradźwiękowa hydroliza do depolimeryzacji chityny

W hydrolizie chemicznej do deacetylacji chityny stosuje się kwasy lub zasady, jednak deacetylacja zasadowa (np. z wykorzystaniem wodorotlenku sodu NaOH) jest stosowana szerzej. Hydroliza kwasowa jest metodą alternatywną wobec tradycyjnej deacetylacji chemicznej; wykorzystuje się w niej roztwory kwasów organicznych do depolimeryzacji chityny i chitozanu. Metodę hydrolizy kwasowej stosuje się przede wszystkim wtedy, gdy masa cząsteczkowa chityny i chitozanu musi być jednorodna. Ten konwencjonalny proces hydrolizy jest znany jako powolny, energochłonny i kosztowny. Konieczność stosowania mocnych kwasów, wysokich temperatur i ciśnień sprawia, że hydrolityczny proces otrzymywania chitozanu jest bardzo kosztowną i czasochłonną procedurą. Stosowane kwasy wymagają dalszych procesów, takich jak neutralizacja i odsalanie.
Włączenie ultradźwięków dużej mocy do procesu hydrolizy pozwala znacznie obniżyć wymagania dotyczące temperatury i ciśnienia dla hydrolitycznego rozszczepiania chityny i chitozanu. Ponadto sonikacja umożliwia stosowanie niższych stężeń kwasów lub łagodniejszych kwasów. Dzięki temu proces jest bardziej zrównoważony, wydajny, opłacalny i przyjaźniejszy dla środowiska.

Chemiczna deacetylacja wspomagana ultradźwiękami

Chemiczną dezintegrację i deacetylację chityny i chitozanu uzyskuje się głównie poprzez obróbkę chityny lub chitozanu kwasami mineralnymi (np. kwasem chlorowodorowym HCl), azotynem sodu (NaNO₂) lub nadtlenkiem wodoru (H₂O₂). Ultradźwięki zwiększają szybkość deacetylacji, skracając tym samym czas reakcji wymagany do uzyskania docelowego stopnia deacetylacji. Oznacza to, że sonikacja skraca wymagany czas przetwarzania z 12–24 godzin do kilku godzin. Ponadto sonikacja pozwala stosować znacznie niższe stężenia substancji chemicznych, na przykład 40% (w/w) wodorotlenku sodu przy zastosowaniu sonikacji, podczas gdy bez użycia ultradźwięków wymagane jest 65% (w/w).

Deacetylacja ultradźwiękowo-enzymatyczna

Chociaż enzymatyczna deacetylacja jest łagodną i przyjazną dla środowiska formą przetwarzania, jej wydajność i koszty sprawiają, że jest nieopłacalna. Ze względu na złożone, pracochłonne i kosztowne izolowanie i oczyszczanie enzymów z produktu końcowego na dalszych etapach procesu enzymatyczna deacetylacja chityny nie jest wdrażana w produkcji komercyjnej, lecz stosowana wyłącznie w laboratoriach badań naukowych.
Wstępna obróbka ultradźwiękowa przed enzymatyczną deacetylacją fragmentuje cząsteczki chityny, zwiększając tym samym powierzchnię i udostępniając enzymom większą jej część. Wysokowydajna sonikacja pomaga usprawnić enzymatyczną deacetylację i czyni proces bardziej ekonomicznym.