Tworzenie fibryli amyloidu przy użyciu sonikatora mikropłytkowego UIP400MTP

Włókna amyloidowe, podobnie jak kryształy, tworzą się w procesie zarodkowania i późniejszego wzrostu. Jednak ze względu na wysoką barierę wolnej energii zarodkowania, spontaniczne tworzenie się włókien amyloidowych następuje dopiero po dłuższej fazie opóźnienia. Ultradźwięki stały się potężnym narzędziem do wywoływania zarodkowania amyloidu, co znacznie przyspiesza tworzenie się fibryli. W połączeniu z czytnikiem mikropłytek wykorzystującym fluorescencję tioflawiny T (ThT), ultradźwięki umożliwiają wysokowydajne wykrywanie włókien amyloidowych w wielu próbkach jednocześnie.

Ultradźwiękowo indukowana formacja włókien amyloidowych za pomocą sonikatora mikropłytkowego UIP400MTP

Dzięki sonikatorowi wielodołkowemu UIP400MTP, fibryle amyloidowe o tej samej jakości w dużych ilościach mogą być szybko syntetyzowane do celów badawczych. To skuteczne podejście pozwala na badanie amyloidogenności białek. Technika ta ułatwia szybką i powtarzalną fibrylację amyloidu, co wykazano w przypadku β2-mikroglobuliny (β2-m), białka amyloidogennego związanego z amyloidozą związaną z dializą.

Proste podejście eksperymentalne: Indukowane ultradźwiękami migotanie amyloidu

Aby wywołać tworzenie się włókien, 96-dołkową mikropłytkę umieszczono w środku sonikatora wielodołkowego UIP400MTP, co zapewnia równomierną ekspozycję ultradźwiękową we wszystkich studzienkach. Warunki eksperymentalne były następujące:

1. Każdy dołek zawierał 0,2 ml roztworu β2-mikroglobuliny (0,3 mg/ml, pH 2,5) uzupełnionego 5 μM ThT.
2. Płytkę poddawano cyklom ultradźwiękowym, takim jak 1-minutowe ultradźwięki, po których następowało 9 minut przerwy.
3. Po sonikacji fluorescencję ThT mierzono za pomocą czytnika mikropłytek.

(por. So et al., 2011)

Porównanie z konwencjonalnym mieszaniem

W porównaniu z tradycyjnymi metodami mieszania, ultradźwięki drastycznie zmniejszyły fazę opóźnienia tworzenia się włókien. W konwencjonalnych warunkach wytrząsania mikropłytki, tylko 1 z 10 studzienek wykazywał zwiększoną fluorescencję ThT po 20 godzinach. W przeciwieństwie do tego, stosując cykliczną ultrasonizację (15 minut sonikacji, a następnie 5 minut spoczynku), znaczny wzrost fluorescencji ThT wykryto natychmiast po pierwszym zabiegu sonikacji.

Gwałtowne przyspieszenie kinetyki migotania przedsionków

Wyniki uzyskane przez So et al. (2011) wykazały, że spontaniczne tworzenie się fibryli β2-mikroglobuliny przy pH 2,5 może być przyspieszone z kilku godzin do zaledwie 10-15 minut za pomocą ultradźwięków.
Obrazy mikroskopii sił atomowych (AFM) potwierdziły, że fibryle generowane przez 10-minutowe ultradźwięki co 15 minut były morfologicznie nie do odróżnienia od tych tworzonych przy użyciu 1-minutowych ultradźwięków co 10 minut. Podkreśla to powtarzalność i wytrzymałość indukowanej ultradźwiękami fibrylacji amyloidu.

Obrazy AFM fibryli amyloidowych wytwarzanych przez 1-minutową ultrasonizację co 10 minut (i), przez 10-minutową sonikację co 15 minut (ii) oraz przez reakcję wysiewu bez ultrasonizacji (iii). Biały pasek skali reprezentuje 1 μm.
Opracowanie i zdjęcia: ©So et al., 2011

Fibrylacja w warunkach neutralnego pH

Nawet w warunkach neutralnego pH tworzenie fibryli osiągnięto po czasie opóźnienia wynoszącym 1,5 godziny, co pokazuje, że ultradźwięki znacznie obniżają barierę energetyczną dla zarodkowania i wzrostu. Potwierdza to hipotezę, że fibrylacja amyloidu jest przede wszystkim reakcją fizyczną, w dużej mierze ograniczoną przez barierę energetyczną zarodkowania, którą ultradźwięki skutecznie zmniejszają.

Wpływ na badania nad chorobami związanymi z amyloidem

Łatwe i niezawodne tworzenie fibryli amyloidowych przy użyciu sonikatora mikropłytkowego UIP400MTP ma znaczące implikacje dla badań nad chorobą Alzheimera (AD) i innymi zaburzeniami związanymi z amyloidem, takimi jak choroba Parkinsona, cukrzyca typu II i amyloidozy układowe. W AD agregacja amyloidu-β (Aβ) jest kluczową cechą patologiczną, jednak badanie jej kinetyki fibrylacji pozostaje wyzwaniem ze względu na długie fazy opóźnienia i zmienność w konwencjonalnych metodach. Tworzenie fibryli napędzane ultradźwiękami przyspiesza zarodkowanie, zapewniając wysoką powtarzalność i zmniejszoną zmienność, co ma kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów i zrozumienia mechanizmów amyloidogennych. Ponadto, wysoka wydajność UIP400MTP umożliwia badania na dużą skalę w zakresie nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek, ułatwiając odkrywanie środków terapeutycznych, które mogą modulować tworzenie fibryli i potencjalnie łagodzić postęp neurodegeneracji.

Badanie to ustanawia ultradźwięki przy użyciu sonikatora wielodołkowego UIP400MTP jako wysoce skuteczną metodę przyspieszania tworzenia włókien amyloidowych. Kluczowe zalety tego podejścia obejmują:

• Znaczne skrócenie czasu opóźnienia migotania.
• Jednolita ekspozycja na ultradźwięki we wszystkich studzienkach, umożliwiająca powtarzalne tworzenie fibryli.
• Wysoka wydajność badań przesiewowych, dzięki czemu nadaje się do przeszukiwania całego genomu pod kątem amyloidogenności białek.

Integrując ultradźwięki z detekcją fluorescencji ThT, metoda ta zapewnia szybką, skalowalną i niezawodną platformę do badania fibrylacji amyloidu. Biorąc pod uwagę jego wydajność i potencjał wysokiej przepustowości, podejście to może ułatwić łatwą syntezę fibryli amyloidowych do badań biofizycznych i farmaceutycznych, oferując obiecujące narzędzie do badań związanych z amyloidem i badań przesiewowych leków.