Tworzenie fibryli amyloidowych z użyciem sonikatora do mikropłytek UIP400MTP

Fibryle amyloidowe, podobnie jak kryształy, powstają w procesie nukleacji i następującego po niej wzrostu. Jednak ze względu na wysoką barierę energii swobodnej nukleacji spontaniczne tworzenie fibryli amyloidowych zachodzi dopiero po przedłużonej fazie opóźnienia. Sonikacja stała się skutecznym narzędziem do indukowania nukleacji amyloidu, a tym samym znacznego przyspieszania tworzenia fibryli. W połączeniu z czytnikiem mikropłytek wykorzystującym fluorescencję tioflawiny T (ThT) sonikacja umożliwia wysokoprzepustowe wykrywanie fibryli amyloidowych w wielu próbkach jednocześnie.

Indukowane ultradźwiękami tworzenie fibryli amyloidowych za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP

Za pomocą sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP można szybko syntetyzować duże ilości fibryli amyloidowych o jednakowej jakości do celów badawczych. To wydajne podejście umożliwia badanie amyloidogenności białek. Technika ta ułatwia szybką i powtarzalną fibrylację amyloidu, co wykazano na przykładzie β2-mikroglobuliny (β2-m), białka amyloidogennego związanego z amyloidozą dializacyjną.

Proste podejście eksperymentalne: fibrylacja amyloidu indukowana ultradźwiękami

Aby wywołać tworzenie fibryli, 96-dołkową mikropłytkę umieszczono w środku sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP, który zapewnia równomierną ekspozycję na ultradźwięki we wszystkich dołkach. Warunki eksperymentalne były następujące:

1. Każdy dołek zawierał 0,2 ml roztworu β2-mikroglobuliny (0,3 mg/ml, pH 2,5) z dodatkiem 5 μM ThT.
2. Płytkę poddawano cyklom sonikacji, na przykład 1-minutowej sonikacji, po której następowało 9 minut przerwy.
3. Po sonikacji mierzono fluorescencję ThT za pomocą czytnika mikropłytek.

(por. So i wsp., 2011)

Porównanie z konwencjonalnym mieszaniem

W porównaniu z tradycyjnymi metodami mieszania sonikacja radykalnie skróciła fazę opóźnienia tworzenia fibryli. W konwencjonalnych warunkach wytrząsania mikropłytki tylko w 1 z 10 dołków zaobserwowano zwiększoną fluorescencję ThT po 20 godzinach. Natomiast przy zastosowaniu cyklicznej sonikacji (15 minut sonikacji, po których następowało 5 minut spoczynku) znaczny wzrost fluorescencji ThT wykryto bezpośrednio po pierwszej sonikacji.

Szybkie przyspieszenie kinetyki fibrylacji

Wyniki uzyskane przez So i wsp. (2011) wykazały, że dzięki sonikacji czas spontanicznego tworzenia fibryli β2-mikroglobuliny przy pH 2,5 można skrócić z kilku godzin do zaledwie 10–15 minut.
Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) potwierdziły, że fibryle wytworzone przez 10-minutową sonikację co 15 minut były morfologicznie nieodróżnialne od tych powstałych przy zastosowaniu 1-minutowej sonikacji co 10 minut. Podkreśla to powtarzalność i odporność na zmienność warunków fibrylacji amyloidu indukowanej ultradźwiękami.

Obrazy AFM fibryli amyloidowych wytworzonych przez 1-minutową sonikację co 10 min (i), przez 10-minutową sonikację co 15 min (ii) oraz w reakcji zaszczepiania bez sonikacji (iii). Biały pasek skali odpowiada 1 μm.
Badanie i obrazy: ©So i wsp., 2011

Fibrylacja w warunkach obojętnego pH

Nawet w warunkach obojętnego pH uzyskano tworzenie fibryli po fazie opóźnienia trwającej 1,5 godziny, co dowodzi, że sonikacja znacznie obniża barierę energetyczną nukleacji i wzrostu. Stanowi to dodatkowe potwierdzenie hipotezy, że fibrylacja amyloidu jest przede wszystkim reakcją fizyczną, w dużej mierze ograniczaną przez barierę energetyczną nukleacji, którą sonikacja skutecznie obniża.

Wpływ na badania chorób związanych z amyloidem

Łatwe i niezawodne tworzenie fibryli amyloidowych za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP ma istotne znaczenie dla badań nad chorobą Alzheimera (AD) i innymi schorzeniami związanymi z amyloidem, takimi jak choroba Parkinsona, cukrzyca typu II i amyloidozy układowe. W AD agregacja amyloidu β (Aβ) jest kluczową cechą patologiczną, jednak badanie kinetyki jego fibrylacji pozostaje wyzwaniem ze względu na długie fazy opóźnienia i zmienność konwencjonalnych metod. Tworzenie fibryli indukowane sonikacją przyspiesza nukleację, zapewniając wysoką powtarzalność i mniejszą zmienność, co ma kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów oraz zrozumienia mechanizmów amyloidogennych. Ponadto wysoka przepustowość UIP400MTP umożliwia prowadzenie badań nad nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek na dużą skalę, ułatwiając odkrywanie środków terapeutycznych, które mogą modulować tworzenie fibryli i potencjalnie ograniczać postęp neurodegeneracji.

Badanie to potwierdza, że sonikacja z użyciem sonikatora do płytek wielodołkowych UIP400MTP jest wysoce wydajną metodą przyspieszania tworzenia fibryli amyloidowych. Kluczowe zalety tego podejścia obejmują:

• Radykalne skrócenie fazy opóźnienia fibrylacji.
• Równomierną ekspozycję na ultradźwięki we wszystkich dołkach, umożliwiającą powtarzalne tworzenie fibryli.
• Możliwość prowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych, dzięki której metoda nadaje się do poszukiwania amyloidogenności białek w skali całego genomu.

Dzięki połączeniu sonikacji z detekcją fluorescencji ThT metoda ta zapewnia szybką, skalowalną i niezawodną platformę do badania fibrylacji amyloidu. Ze względu na wydajność i potencjał wysokiej przepustowości podejście to może ułatwić prostą syntezę fibryli amyloidowych do badań biofizycznych i farmaceutycznych, oferując obiecujące narzędzie do badań związanych z amyloidem oraz badań przesiewowych leków.