PMCA do wysokoprzepustowego wykrywania prionów z użyciem sonikatora UIP400MTP

Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP oferuje wydajne rozwiązanie do wysokoprzepustowego przygotowania próbek w cyklicznej amplifikacji nieprawidłowo sfałdowanych białek (PMCA). Zapewniając równomierny rozkład energii w wielu dołkach i utrzymując precyzyjne parametry sonikacji, system ten umożliwia jednoczesne przetwarzanie licznych próbek z wyjątkową powtarzalnością. Możliwości te mają kluczowe znaczenie dla optymalizacji PMCA w celu wykrywania prionów w niskich stężeniach w trudnych próbkach biologicznych, takich jak ślina, w których inhibitory testu mogą utrudniać interpretację wyników.

Choroby prionowe, takie jak przewlekła choroba wyniszczająca (CWD) u jeleniowatych i choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi, są schorzeniami neurodegeneracyjnymi wywoływanymi przez nieprawidłowo sfałdowane białka prionowe (PrP^Sc). Chorobom tym często towarzyszą niskie poziomy zakaźnych prionów w płynach ustrojowych, takich jak ślina, krew i mocz, co utrudnia diagnostykę i badania. Poziome przenoszenie CWD za pośrednictwem prionów wydalanych do matryc środowiskowych ma szczególnie istotne konsekwencje dla zarządzania populacjami dzikich zwierząt i zdrowia ekosystemów. Podobnie w chorobach takich jak choroba Creutzfeldta-Jakoba niezawodna amplifikacja nieprawidłowo sfałdowanych białek prionowych z próbek ludzkich ma kluczowe znaczenie dla rozwoju diagnostyki i zrozumienia postępu choroby.

Zastosowanie zmodyfikowanego protokołu PMCA pozwala ominąć typowe inhibitory testu (np. mucyny w ślinie) i uzyskać wysoką czułość wykrywania prionów, które w przeciwnym razie byłyby niewykrywalne lub dawałyby niejednoznaczne wyniki przy użyciu technik takich jak konwersja indukowana wytrząsaniem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC). Postępy te usprawniają wykrywanie prionów w różnych chorobach, czyniąc PMCA niezbędnym narzędziem w badaniach nad prionami i diagnostyce. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP ułatwia wysokoprzepustową PMCA, poddając sonikacji liczne próbki w mikropłytkach (np. płytkach 6-, 24- lub 96-dołkowych) lub fiolkach umieszczonych w statywie na probówki.

Protokół wysokoprzepustowej cyklicznej amplifikacji nieprawidłowo sfałdowanych białek (PMCA)

Poniższy protokół umożliwia wydajne przetwarzanie dużej liczby próbek w dokładnie takich samych warunkach w celu uzyskania wiarygodnych wyników badań.

Przygotowanie próbek

Materiał wyjściowy:
Przygotuj próbki poprzez:

• Ponowne zawieszenie osadów uzyskanych w wyniku ekstrakcji sarkozylem w substracie PMCA.
• Bezpośrednie dodanie zarodków prionowych do homogenatów mózgu lub próbek krwi.

Substrat:

• Użyj 10% (wt/vol) homogenatu mózgu przygotowanego z myszy transgenicznych wykazujących nadekspresję PrP^C (np. myszy Tg).
• Homogenizuj tkankę mózgową w:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Przechowuj substrat w temperaturze -80ºC do czasu użycia.

Rozmieszczenie próbek w mikropłytce lub probówkach:
Probówki:

• Dodaj 90 μL substratu w postaci homogenatu mózgu i zaszczep go 10 μL próbki (np. krwi, homogenatu mózgu lub osadu uzyskanego z użyciem sarkozylu).
• Umieść 3 kulki teflonowe (o średnicy 1,59 mm lub 2,38 mm) w każdej probówce o pojemności 0,2 mL.
• Umieść probówki w statywie kompatybilnym z sonikatorem UIP400MTP.

Mikropłytka 6-dołkowa:

• Do każdego dołka dodaj 5 mL substratu w postaci homogenatu mózgu i zaszczep go 500 μL próbki.
• Dodaj 3 kulki teflonowe do każdego dołka.

Procedura PMCA

Umieszczenie:
Umieść statyw na probówki lub mikropłytkę 6-dołkową w sonikatorze UIP400MTP zgodnie z instrukcjami producenta.

Program cykli:
Wykonaj 144 cykle PMCA w następujący sposób:

• Inkubacja: 29 minut i 30 sekund w temperaturze 37°C.
• Sonikacja: 30 sekund przy amplitudzie 60%.
• Monitoruj temperaturę: użyj podłączanego czujnika temperatury do monitorowania temperatury próbek i zaprogramuj UIP400MTP na maksymalną temperaturę 48–50°C.

Kolejne rundy:
Po zakończeniu pierwszej rundy 144 cykli przenieś porcję amplifikowanego materiału:

• Rozcieńcz 10-krotnie w świeżym substracie w postaci homogenatu mózgu myszy transgenicznych.
• W kolejnych rundach wykonuj 96 cykli PMCA, utrzymując te same parametry sonikacji.
• Kontynuuj przez żądaną liczbę rund (zwykle do 5).

Wykrywanie PrP^Sc

1. Trawienie proteinazą K:
   – Poddaj próbki działaniu proteinazy K (50 μg/mL) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
   – Zakończ trawienie przez dodanie buforu do próbek zawierającego SDS i gotowanie przez 10 minut.
2. Analiza metodą Western blot:
   – Przeanalizuj strawione próbki z użyciem:
   – przeciwciał anty-PrP 6H4 lub PRC1.
   – Przeprowadź SDS-PAGE i przenieś białka na membrany PVDF w celu detekcji.

 

Hielscher UIP400MTP to najbardziej wszechstronny sonikator do płytek wielodołkowych, płytek PCR i probówek na próbki. Dzięki ciągłej mocy sonikacji wynoszącej 400 watów jest przeznaczony do takich zastosowań jak liza komórek, emulgowanie, ekstrakcja białek, fragmentacja DNA / RNA, deaglomeracja, ekstrakcja z materiału FFPE, odrywanie komórek i biofilmów oraz emulgowanie. UIP400MTP nie jest łaźnią ultradźwiękową. To sonikator z rezonatorem kubkowym o wysokiej intensywności, przeznaczony do ukierunkowanej sonikacji. Ten wydajny sonikator bezkontaktowy zapewnia równomierną sonikację we wszystkich dołkach standardowej płytki wielodołkowej. Umożliwia precyzyjne sterowanie amplitudą, mocą i pracą impulsową. Wbudowany programator czasowy i sonda temperatury zapewniają powtarzalne wyniki. Sonikator do płytek UIP400MTP chłodzi próbki w łaźni wodnej; opcjonalnie dostępny jest zewnętrzny agregat chłodniczy.

 

Przetwarzaj więcej próbek, aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki

Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP znacznie zwiększa wydajność i skalowalność cyklicznej amplifikacji nieprawidłowo sfałdowanych białek (PMCA), rozwiązując problem tradycyjnie czasochłonnego charakteru tej procedury. Umożliwiając jednoczesne przetwarzanie do 96 próbek w płytce 96-dołkowej, system usprawnia procedury PMCA, utrzymując jednocześnie precyzyjne i jednakowe warunki sonikacji we wszystkich dołkach. Ta wysoka przepustowość minimalizuje ręczną obsługę, ogranicza pracochłonne etapy i zapewnia powtarzalność, czyniąc urządzenie niezbędnym narzędziem w badaniach nad prionami. Zarówno w badaniach nad przewlekłą chorobą wyniszczającą, jak i chorobą Creutzfeldta-Jakoba UIP400MTP ułatwia prowadzenie badań na dużą skalę z większą wydajnością, umożliwiając naukowcom sprostanie wymaganiom nowoczesnych zastosowań diagnostycznych i naukowych.

---

---

Literatura / Źródła

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.