PMCA do wysokoprzepustowego wykrywania prionów za pomocą sonikatora UIP400MTP

Sonikator wielodołkowy UIP400MTP oferuje wydajne rozwiązanie do wysokowydajnego przygotowywania próbek w cyklicznej amplifikacji nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA). Zapewniając równomierny rozkład energii w wielu dołkach i utrzymując precyzyjne parametry sonikacji, system ten umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek z wyjątkową powtarzalnością. Możliwości te mają kluczowe znaczenie dla optymalizacji PMCA w celu wykrywania prionów w niskich stężeniach w trudnych próbkach biologicznych, takich jak ślina, gdzie inhibitory testu mogą zaciemniać wyniki.

Choroby prionowe, takie jak przewlekła choroba wyniszczająca (CWD) u jeleniowatych i choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi, są zaburzeniami neurodegeneracyjnymi spowodowanymi nieprawidłowo sfałdowanymi białkami prionowymi (PrP).^Sc). Choroby te często wiążą się z niskim poziomem zakaźnych prionów w płynach ustrojowych, takich jak ślina, krew i mocz, co komplikuje diagnostykę i badania. Horyzontalne przenoszenie CWD poprzez priony wydalane w matrycach środowiskowych ma szczególnie istotne implikacje dla zarządzania dziką przyrodą i zdrowia ekologicznego. Podobnie, w przypadku chorób takich jak choroba Creutzfeldta-Jakoba, niezawodna amplifikacja nieprawidłowo sfałdowanych białek prionowych z próbek ludzkich ma kluczowe znaczenie dla rozwoju diagnostyki i zrozumienia postępu choroby.

Zastosowanie zmodyfikowanego protokołu PMCA pozwala ominąć typowe inhibitory testu (np. mucyny w ślinie) i osiągnąć wysoką czułość w wykrywaniu prionów, które w przeciwnym razie byłyby niewykrywalne lub niejednoznaczne przy użyciu technik takich jak konwersja indukowana wytrząsaniem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC). Te postępy zwiększają wykrywalność prionów w różnych chorobach, czyniąc PMCA niezbędnym narzędziem do badań i diagnostyki prionów. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP ułatwia wysokowydajną sonikację PMCA wielu próbek w mikropłytkach (np. 6-, 24- lub 96-dołkowych) lub fiolkach w stojaku na probówki.

Protokół wysokoprzepustowej cyklicznej amplifikacji nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA)

Poniższy protokół umożliwia wydajne przetwarzanie dużej liczby próbek w dokładnie takich samych warunkach w celu uzyskania wiarygodnych wyników badań.

przygotowanie próbki

Materiał wyjściowy:
Przygotuj próbki przez:

• Ponowne zawieszenie granulek do ekstrakcji sarkozylu w podłożu PMCA.
• Bezpośrednie nasycanie homogenatów mózgu lub próbek krwi nasionami prionów.

Podłoże:

• Użyć 10% (wag./obj.) homogenatu mózgu przygotowanego z transgenicznych myszy z nadekspresją PrP^C (np. myszy Tg).
• Homogenizować tkankę mózgową w:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Przechowywać podłoże w temperaturze -80ºC do momentu użycia.

Konfiguracja próbek w mikropłytkach lub probówkach:
Rurki:

• Dodać 90 μL substratu homogenatu mózgu i posiać 10 μL próbki (np. krwi, homogenatu mózgu lub osadu sarkozylu).
• Umieść 3 kulki teflonowe (o średnicy 1,59 mm lub 2,38 mm) w każdej probówce o pojemności 0,2 ml.
• Zamontować lampy w stelażu kompatybilnym z sonikatorem UIP400MTP.

Mikropłytka 6-dołkowa:

• Dodać 5 ml substratu homogenatu mózgu i wysiać 500 μl próbki na studzienkę.
• Dodaj 3 kulki teflonowe do każdej studzienki.

Procedura PMCA

Umieszczenie:
Umieścić statyw z probówkami lub 6-dołkową mikropłytkę w sonikatorze UIP400MTP zgodnie z instrukcjami producenta.

Program dla rowerzystów:
Wykonaj 144 cykle PMCA w następujący sposób:

• Inkubacja: 29 minut i 30 sekund w temperaturze 37°C.
• Sonikacja: 30 sekund przy amplitudzie 60%.
• Monitorowanie temperatury: Użyj podłączanego czujnika temperatury do monitorowania temperatury próbki i zaprogramuj UIP400MTP na maksymalną temperaturę 48-50°C.

Kolejne rundy:
Po zakończeniu pierwszej rundy 144 cykli przenieść porcję amplifikowanego materiału:

• Rozcieńczyć 10-krotnie w świeżym substracie homogenatu mózgu myszy transgenicznej.
• Wykonać 96 cykli PMCA dla kolejnych rund, zachowując te same parametry sonikacji.
• Kontynuuj przez żądaną liczbę rund (zazwyczaj do 5).

Wykrywanie PrP^Sc

1. Trawienie proteinazą K:
   – Poddać próbki działaniu proteinazy K (50 μg/ml) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
   – Zakończyć trawienie przez dodanie buforu SDS i gotowanie przez 10 minut.
2. Analiza Western Blot:
   – Przeanalizuj trawione próbki przy użyciu:
   – 6H4 lub PRC1 przeciwciała anty-PrP.
   – Wykonać SDS-PAGE i przenieść na membrany PVDF w celu detekcji.

 

 

Przetwarzanie większej liczby próbek w celu uzyskania bardziej wiarygodnych wyników

Sonikator wielodołkowy UIP400MTP znacznie zwiększa wydajność i skalowalność cyklicznej amplifikacji nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA), zajmując się tradycyjnie czasochłonnym charakterem procedury. Umożliwiając jednoczesne przetwarzanie do 96 próbek na 96-dołkowej płytce, system usprawnia przepływy pracy PMCA przy jednoczesnym zachowaniu precyzyjnych i jednolitych warunków sonikacji we wszystkich dołkach. Ta wysoka wydajność minimalizuje ręczną obsługę, redukuje pracochłonne etapy i zapewnia powtarzalność, co czyni go niezbędnym narzędziem do badań nad prionami. Niezależnie od tego, czy badasz przewlekłą chorobę wyniszczającą, czy chorobę Creutzfeldta-Jakoba, UIP400MTP ułatwia badania na dużą skalę z większą wydajnością, umożliwiając naukowcom spełnienie wymagań nowoczesnych zastosowań diagnostycznych i naukowych.

---

---

Literatura / Referencje

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.