Sonicatie voor Lysis: Celdisruptie en -extractie

Celdesintegratie of lysis is een gangbaar onderdeel van de dagelijkse monstervoorbereiding in biotechnologische laboratoria. Het doel van lysis is delen van de celwand of de volledige cel te ontwrichten om biologische moleculen vrij te maken. Ultrasone homogenisatoren worden veel gebruikt voor succesvolle cellyse. Het grote voordeel van geavanceerde ultrasone apparaten is de nauwkeurige regeling van procesparameters zoals intensiteit en temperatuur, die een zachte, maar zeer efficiënte celdisruptie en -extractie mogelijk maken.

Cellyse met behulp van ultrageluid

Ultrasone cellyse en -extractie is een methode die wordt gebruikt om cellen open te breken en de inhoud te extraheren met behulp van geluidsgolven met een hoge frequentie, d.w.z. ultrageluid. Sonificatie is een lysetechniek die algemeen wordt gebruikt als een gevestigde en betrouwbare methode voor celdisruptie en extractie van intracellulair materiaal. Ultrasone lysis is een betrouwbare techniek om lysaten te bereiden die bijv. plasmiden, receptoren, eiwitten, DNA, RNA enz. bevatten. Aangezien de ultrasone intensiteit kan worden gedoseerd door de procesparameters aan te passen, kan de optimale sonicatie-intensiteit van zeer zacht tot intens voor elke stof en elk medium afzonderlijk worden ingesteld om te voldoen aan specifieke toepassingseisen. De volgende stappen van de lysis zijn fractionering, organellenisolatie en/of eiwitextractie en -zuivering. Het geëxtraheerde materiaal (= lysaat) moet worden gescheiden en wordt gebruikt voor verder onderzoek of toepassingen, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek.

In vergelijking met andere cellyse- en extractiemethoden heeft ultrasone cellyse verschillende voordelen:

1. Snelheid: Ultrasone cellyse en extractie is een snelle methode die cellen in enkele seconden kan openbreken. Dit is veel sneller dan andere methoden zoals homogeniseren, vriesdooien of parelmalen.
2. efficiëntie: Met ultrasone cellyse en -extractie kunnen kleine, grote of meerdere monsters tegelijk worden behandeld, waardoor het efficiënter is dan andere methoden waarbij kleine monsters afzonderlijk moeten worden verwerkt.
3. Chemicaliënvrij: Ultrasone cellyse en -extractie is een niet-invasieve methode waarvoor geen agressieve chemicaliën of enzymen nodig zijn. Dit maakt het ideaal voor toepassingen waarbij de integriteit van de celinhoud moet worden gehandhaafd. Ongewenste besmetting van monsters kan worden vermeden.
4. Hoge opbrengst: Ultrasone cellyse en -extractie kan een hoge opbrengst aan celinhoud, waaronder DNA, RNA en eiwitten, extraheren. Dit komt doordat de geluidsgolven met hoge frequentie de celwanden openbreken en de inhoud in de omringende oplossing loslaten.
5. Temperatuurregeling: Geavanceerde ultrasone apparaten maken een nauwkeurige temperatuurcontrole van het monster mogelijk. Hielscher digitale ultrasone apparaten zijn uitgerust met een insteekbare temperatuursensor en software voor temperatuurcontrole.
6. Reproduceerbaar: Protocollen voor ultrasone cellyse kunnen gemakkelijk worden gereproduceerd en zelfs worden afgestemd op verschillende grotere of kleinere monstervolumes door een eenvoudige lineaire schaalvergroting.
7. Veelzijdig: Ultrasone cellyse en -extractie kan worden gebruikt voor de extractie van een groot aantal celtypes, waaronder bacteriën, gist, schimmels, planten- en zoogdiercellen. Het kan ook worden gebruikt om verschillende soorten moleculen te extraheren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden.
8. Gelijktijdige bereiding van talrijke monsters: Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen om comfortabel meerdere monsters te verwerken onder exact dezelfde procescondities. Dit maakt de monstervoorbereidingsstap van lysis en extractie zeer efficiënt en tijdbesparend.
9. Gemakkelijk te gebruiken: Ultrasone cellyse- en extractieapparatuur is gemakkelijk te gebruiken en vereist een minimale opleiding. De apparatuur is ook economisch, omdat het om een eenmalige investering gaat zonder dat er opnieuw moet worden ingekocht. Dit maakt het aantrekkelijk voor een groot aantal onderzoekers en laboratoria.

In het algemeen is ultrasone cellyse en -extractie een snelle, efficiënte, nauwkeurig controleerbare en veelzijdige methode om cellulaire inhoud te extraheren. De voordelen ervan ten opzichte van alternatieve methoden maken het een aantrekkelijke keuze voor een breed scala van onderzoeks- en industriële toepassingen.

Werkingsprincipe van ultrasone cellyse

Ultrasone cellyse en extractie maakt gebruik van geluidsgolven met een hoge frequentie om cellen te verstoren en hun inhoud te extraheren. De geluidsgolven veroorzaken drukveranderingen in de omringende vloeistof, waardoor kleine belletjes ontstaan en ineenstorten in een proces dat cavitatie wordt genoemd. Deze belletjes genereren plaatselijke, zeer intense mechanische krachten die cellen kunnen openbreken en hun inhoud in de omringende oplossing kunnen vrijlaten.

Cellyse met behulp van een ultrasoonapparaat omvat gewoonlijk de volgende stappen:

• Het monster wordt in een buis of container met een vloeibare buffer geplaatst.
• Er wordt een ultrasone sonde in het monster gebracht en er worden hoogfrequente geluidsgolven van ongeveer 20-30 kHz toegepast.
• De ultrasone golven veroorzaken oscillatie en cavitatie in de omringende vloeistof, waardoor plaatselijke krachten ontstaan die cellen openbreken en hun inhoud vrijgeven.
• Het monster wordt gecentrifugeerd of gefiltreerd om eventuele celresten te verwijderen, en de geëxtraheerde inhoud wordt verzameld voor verdere analyse.

Krachtige ultrasone golven verstoren de celmatrix van biologische structuren en maken de bioactieve stoffen vrij. De massaoverdracht tussen het plantenmateriaal en het oplosmiddel (bv. buffer) wordt versterkt. (grafiek: ©Vilkhu et al., 2006)

Nadelen van gangbare lysismethoden

Tijdens uw werk in laboratoria hebt u misschien al ervaren hoe lastig cellyse is met traditionele mechanische of chemische lysis-protocollen.

• Mechanische lysis: Bij mechanische lysismethoden, zoals malen met mortier en stamper of homogeniseren met behulp van een fransche pers, parelmolen of rotor-statorsysteem, ontbreken vaak precieze controle- en instelmogelijkheden. Dit betekent dat het gebruik van malen en malen snel warmte en schuifkrachten kan genereren die het monster kunnen beschadigen en eiwitten kunnen denatureren. Ze kunnen ook tijdrovend zijn en vereisen grote hoeveelheden uitgangsmateriaal.
• Chemische lysis: Chemische lysismethoden, zoals lysis met detergentia, kunnen het monster beschadigen door de lipide bilaag te verstoren en eiwitten te denatureren. Zij kunnen ook meerdere stappen vereisen en kunnen restverontreinigingen achterlaten die de downstream-toepassingen hinderen. Het vinden van de optimale dosering van het detergens is een extra uitdaging.
• Vries-dooi cycli: Vries-dooicycli kunnen de celmembranen doen scheuren, maar herhaalde cycli kunnen ook eiwitdenaturatie en -degradatie veroorzaken. Deze methode kan ook meerdere cycli vereisen, wat tijdrovend kan zijn en vaak resulteert in lagere opbrengsten.
• Enzymatische lysis: Enzymatische lysemethoden kunnen specifiek zijn voor bepaalde celtypes en vereisen meerdere stappen, waardoor ze tijdrovend zijn. Zij genereren ook afval en vereisen zorgvuldige optimalisatie om degradatie van het monster te voorkomen. Enzymatische lysis kits zijn vaak duur. Als uw huidige enzymatische lysisprocedure onvoldoende resultaten oplevert, kan sonicatie als synergetische methode worden toegepast om de celdisruptie te intensiveren.

In tegenstelling tot conventionele mechanische en chemische cellysemethoden is sonicatie een zeer efficiënt en betrouwbaar instrument voor celdesintegratie dat een volledige controle over de sonicatieparameters mogelijk maakt. Dit zorgt voor een hoge selectiviteit op het gebied van materiaalvrijgave en productzuiverheid. [Zie Balasundaram et al., 2009].
Het is geschikt voor alle celtypes en gemakkelijk toepasbaar op kleine en grote schaal. – altijd onder gecontroleerde omstandigheden. Ultrasone machines zijn gemakkelijk te reinigen. Een ultrasone homogenisator is altijd voorzien van de functie clean-in-place (CIP) en sterilize-in-place (SIP). De sonotrode bestaat uit een massieve titanium hoorn die kan worden afgeveegd of gespoeld in water of oplosmiddel (afhankelijk van het werkmedium). Het onderhoud van ultrasoontoestellen is door hun robuustheid vrijwel verwaarloosbaar.

Ultrasone Lyse en Celverstoring

Over het algemeen duurt de lysis van monsters in het lab tussen 15 seconden en 2 minuten. Omdat de intensiteit van de sonicatie zeer eenvoudig kan worden aangepast door amplitude-instelling van een ultrasoonapparaattijd en door het kiezen van de juiste apparatuur, is het mogelijk om celmembranen heel voorzichtig of zeer abrupt te verstoren, afhankelijk van de celstructuur en het doel van lysis ( bijv. DNA-extractie vereist zachtere sonicatie, volledige eiwitextractie van bacteriën vereist een intensievere echografiebehandeling). De temperatuur tijdens het proces kan worden bewaakt door een geïntegreerde temperatuursensor en kan gemakkelijk worden geregeld door koeling (ijsbad of doorstroomcellen met koelmantels) of door sonicatie in gepulseerde modus. Tijdens puls-modus sonicatie, korte sonicatie burst-cycli van 1-15 seconden duur zorgen voor warmteafvoer en koeling tijdens de langere intermitterende perioden.
All-ultrageluid aangedreven processen zijn volledig reproduceerbaar en lineair schaalbaar.

Ultrasone homogenisatoren voor cellyse en -extractie

Verschillende typen ultrasone apparaten maken het mogelijk het doel van de monstervoorbereiding te bereiken en gebruiksvriendelijkheid en bedieningsgemak te garanderen. Ultrasoonapparaten van het sonde-type zijn de meest voorkomende apparaten in het laboratorium. Zij zijn het meest geschikt voor de bereiding van kleine en middelgrote monsters met volumes van 0,1mL tot 1000mL. Verschillende vermogens en sonotroden maken het mogelijk de ultrasoonapparaat aan te passen aan het monstervolume en het vat voor de meest effectieve en efficiënte sonificatieresultaten. Het ultrasoonapparaat is de beste keuze wanneer afzonderlijke monsters moeten worden bereid.

Als er meer monsters moeten worden bereid, bijvoorbeeld 8-10 flacons met celoplossing, is een intensieve indirecte sonificatie met ultrasone systemen zoals de VialTweeter of een ultrasone kopshoorn de meest geschikte homogenisatiemethode voor een efficiënte lysis. Verschillende vials worden tegelijkertijd met dezelfde intensiteit gesoneerd. Dit bespaart niet alleen tijd, maar zorgt ook voor dezelfde behandeling van alle monsters, waardoor de resultaten tussen de monsters onderling betrouwbaar en vergelijkbaar zijn. Bovendien wordt bij indirecte sonicatie kruisbesmetting door onderdompeling van de ultrasone sonotrode (ook bekend als ultrasone sonde, hoorn, tip of vinger) vermeden. Aangezien op de monstergrootte afgestemde flesjes worden gebruikt, vervallen de tijdrovende schoonmaakwerkzaamheden en het monsterverlies door het decanteren van de flesjes. Voor de uniforme sonicatie van multiwell- of microtiterplaten biedt Hielscher de UIP400MTP.
Bij grote hoeveelheden, b.v. voor de commerciële productie van celextracten continue ultrasone systemen met een doorstroomcel reactor meest geschikt. De continue en gelijkmatige stroming van het verwerkte materiaal verzekert een gelijkmatige sonificatie. Alle parameters van de ultrasone desintegratie werkwijze kan worden geoptimaliseerd en aangepast aan de vereisten van de toepassing en de specifieke celmateriaal.
 
 
Voorbeeldprocedure voor ultrasoon lyseren van de bacteriële cellen:

• Bereiding van de celsuspensie: celpellets moet volledig worden gesuspendeerd in een bufferoplossing van homogeniseren (kies compatibel met de volgende analyse, bijvoorbeeld specifieke chromatografiewerkwijze uw bufferoplossing). lysozymen en / of andere dergelijke middelen, indien nodig (ze moeten ook compatibel zijn met scheiding / zuiveringsmiddelen zijn). Mengen / homogeniseren van de oplossing zachtjes onder milde sonicatie tot volledige suspensie wordt verkregen.
• Ultrasone lysis: Plaats het monster in een ijsbad. Voor cel ontwrichting, ultrasone trillingen de suspensie bij 60-90 tweede uitbarstingen (met behulp van uw ultrasonicator pulse-modus).
• (. Bijvoorbeeld 10 min bij 10.000 x g bij 4degC): Scheiding Centrifugeer het lysaat. Scheid de bovenstaande vloeistof uit de cel pellet zorgvuldig. De supernatant is de totale cellysaat. Na filtratie van het supernatant, een geklaarde vloeistof van de oplosbare celeiwit verkrijgen.

 
 
De meest voorkomende toepassingen voor ultrasonicators in de biologie en biotechnologie zijn:

• Celextract voorbereiding
• Ontwrichting van gist, bacteriën, plantencellen, zacht of hard celweefsel, nucleïne materiaal
• eiwit extractie
• Bereiding en isolatie van enzymen
• Productie van antigenen
• DNA-extractie en / of gerichte fragmentatie
• liposoompreparaat