Sonication Lysis: Celverstoring & extractie

Celafbraak of lysis is een gebruikelijk onderdeel van de dagelijkse monstervoorbereiding in biotech-laboratoria. Het doel van lysis is om delen van de celwand of de volledige cel te verstoren om biologische moleculen vrij te maken. Het zogenaamde lysaat kan bijvoorbeeld bestaan ​​uit plasmide, receptortests, eiwitten, DNA, RNA, enz. De volgende stappen van de lysis zijn fractionering, organelisolatie en / of eiwitextractie en -zuivering. Het geëxtraheerde materiaal (= lysaat) moet worden gescheiden en is onderworpen aan verder onderzoek of toepassingen, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek. Ultrasone homogeniseerders zijn een algemeen hulpmiddel voor succesvolle cellysis. Omdat de ultrasone intensiteit kan worden genivelleerd door de procesparameters aan te passen, kan de optimale ultrasoonapparaatintensiteit van zeer zacht tot zeer hard individueel worden ingesteld voor elke stof en elk medium om aan de specifieke applicatievereiste te voldoen.

Cel structuur

Cellen worden beschermd door een semi-permeabel plasmamembraan die bestaat uit een fosfo-lipide bilaag (ook eiwit-lipide bilaag, gevormd door hydrofobe lipiden en hydrofiele fosfor moleculen ingesloten eiwitmoleculen) en een belemmering tussen de mobiele inrichting (cytoplasma) en de extracellulaire omgeving. Plantencellen en prokaryote cellen zijn omgeven door een celwand. Als gevolg van meerdere lagen dikke celwand van cellulose, plantencellen moeilijker te lyseren dan dierlijke cellen. De cel interieur, zoals organellen, kern, mitochondrion, wordt gestabiliseerd door het cytoskelet.
Door het lyseren van de cellen is het doel het extraheren en scheiden van de organellen, eiwitten, DNA, mRNA of andere biomoleculen.

Ultrasone extractie uit plantencellen: de microscopische dwarsdoorsnede (TS) toont het werkingsmechanisme bij ultrasone extractie uit cellen (vergroting 2000x) [bron: Vilkhu et al. 2011].

methoden

Er zijn verschillende methoden om cellen, die kunnen worden onderverdeeld in mechanische en chemische werkwijzen, die het gebruik van detergenten of oplosmiddelen, de toepassing van hoge druk of het gebruik van een parelmolen of een Franse pers omvatten lysaat. De meest problematische nadeel van deze werkwijzen is de moeilijke controle en aanpassing van de procesparameters en daardoor effect.
De belangrijkste nadelen van gemeenschappelijke lysis methoden:

Tabel: Traditionele methodes om cellysis hebben grote nadelen

Integendeel, sonicatie is een zeer efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor cel desintegratie die het mogelijk maakt voor een volledige controle over de ultrasoonapparaat parameters. Dit zorgt voor een hoge selectiviteit op materiaal vrijkomen en zuiverheid van het product. [Balasundaram et al. 2009] Het is geschikt voor alle celtypes en gemakkelijk toepasbaar op kleine en grote schaal. Ultrasonicators zijn gemakkelijk te reinigen. Een ultrasone homogenisator voorzien altijd clean-in-place (CIP) en steriliseer-in-place (SIP) functie. De sonotrode bestaat uit een massieve titaanhoorn die kan worden afgeveegd of gespoeld in water of oplosmiddel (afhankelijk van het werkmedium). Het onderhoud van ultrasonicators is te wijten aan hun robuustheid bijna verwaarloosbaar.

lysis

Lysis is een gevoelig proces. Tijdens de lysis bescherming van celmembraan wordt vernietigd, maar de inactivatie, denaturatie en degradatie van de geëxtraheerde eiwitten met een niet-fysiologische omgeving (afwijking van pH) moet worden vermeden. Daarom, in het algemeen lyse wordt uitgevoerd in een bufferoplossing uitgevoerd. De meeste problemen ontstaan ​​door ongecontroleerde cel verstoring leidt tot een irrelevante afgifte van intracellulair materiaal of / en denaturatie van het doelproduct.

ultrasone Lysis

Over het algemeen duurt de lysis van monsters in het lab tussen 15 seconden en 2 minuten. Omdat de intensiteit van de sonicatie zeer eenvoudig kan worden aangepast door amplitude-instelling van een ultrasoonapparaattijd en door het kiezen van de juiste apparatuur, is het mogelijk om celmembranen heel voorzichtig of zeer abrupt te verstoren, afhankelijk van de celstructuur en het doel van lysis ( bijv. DNA-extractie vereist zachtere sonicatie, volledige eiwitextractie van bacteriën vereist een intensievere echografiebehandeling). De temperatuur tijdens het proces kan worden bewaakt door een geïntegreerde temperatuursensor en kan gemakkelijk worden geregeld door koeling (ijsbad of doorstroomcellen met koelmantels) of door sonicatie in gepulseerde modus. Tijdens puls-modus sonicatie, korte sonicatie burst-cycli van 1-15 seconden duur zorgen voor warmteafvoer en koeling tijdens de langere intermitterende perioden.
All-ultrageluid aangedreven processen zijn volledig reproduceerbaar en lineair schaalbaar.

ultrasone Homogenisatoren

Verschillende soorten ultrasone apparaten zorgen voor het afstemmen van de monsterbereiding doel en gebruiksvriendelijkheid en bedieningscomfort te verzekeren. Probe-type ultrasonicators zijn de meest voorkomende apparaten in het lab. Ze zijn het meest geschikt voor de bereiding van kleine en mid-size monsters met volumes van 0,1 ml tot 1000 ml. Verschillende power maten en sonotrodes mogelijk maken om de ultrasonicator aan te passen aan het monster volume en het vat voor de meest effectieve en efficiënte sonicating resultaten. De ultrasone sonde apparaat is de beste keuze als enkele monsters te bereiden.

Als er meer monsters moeten worden bereid, bijvoorbeeld 8 injectieflacons met een celoplossing, zijn apparaten zoals de VialTweeter of een ultrasone cuphorn de meest geschikte homogenisator voor lysis. Verschillende flesjes worden gelijktijdig met dezelfde intensiteit gesoniceerd. Dit bespaart niet alleen tijd, maar zorgt ook voor dezelfde behandeling van alle monsters, waardoor de resultaten van de monsters betrouwbaar en vergelijkbaar zijn. Verder wordt kruiscontaminatie door onderdompeling van de ultrasone sonotrode (ook bekend als ultrasone sonde, hoorn, tip of vinger) vermeden. Omdat flacons worden gebruikt, zijn tijdrovende saneringen en monsterverlies als gevolg van decanteren van bloedvaten achterwege gelaten.
Bij grote hoeveelheden, b.v. voor de commerciële productie van celextracten continue ultrasone systemen met een doorstroomcel reactor meest geschikt. De continue en gelijkmatige stroming van het verwerkte materiaal verzekert een gelijkmatige sonificatie. Alle parameters van de ultrasone desintegratie werkwijze kan worden geoptimaliseerd en aangepast aan de vereisten van de toepassing en de specifieke celmateriaal.
Voorbeeldprocedure voor ultrasoon lyseren van de bacteriële cellen:

• Bereiding van de celsuspensie: celpellets moet volledig worden gesuspendeerd in een bufferoplossing van homogeniseren (kies compatibel met de volgende analyse, bijvoorbeeld specifieke chromatografiewerkwijze uw bufferoplossing). lysozymen en / of andere dergelijke middelen, indien nodig (ze moeten ook compatibel zijn met scheiding / zuiveringsmiddelen zijn). Mengen / homogeniseren van de oplossing zachtjes onder milde sonicatie tot volledige suspensie wordt verkregen.
• Ultrasone lysis: Plaats het monster in een ijsbad. Voor cel ontwrichting, ultrasone trillingen de suspensie bij 60-90 tweede uitbarstingen (met behulp van uw ultrasonicator pulse-modus).
• (. Bijvoorbeeld 10 min bij 10.000 x g bij 4degC): Scheiding Centrifugeer het lysaat. Scheid de bovenstaande vloeistof uit de cel pellet zorgvuldig. De supernatant is de totale cellysaat. Na filtratie van het supernatant, een geklaarde vloeistof van de oplosbare celeiwit verkrijgen.

De meest voorkomende toepassingen voor ultrasonicators in de biologie en biotechnologie zijn:

• Celextract voorbereiding
• ontwrichting gist, bacteriën, plantencellen, zachte & harde celweefsel, nucleic materiaal
• eiwit extractie
• Bereiding en isolatie van enzymen
• Productie van antigenen
• DNA-extractie en / of gerichte fragmentatie
• liposoompreparaat