Sonicatie voor cellysis: celontsluiting en extractie

Ultrasone cellysis is een veelgebruikte techniek voor monstervoorbereiding in moderne biotechnologische laboratoria. Het primaire doel is celmembranen of volledige cellen te ontwrichten om intracellulaire componenten zoals eiwitten, nucleïnezuren of organellen vrij te maken. In het dagelijkse laboratoriumwerk betekent dit dat sonicatie een standaardmethode is voor gecontroleerde celontsluiting en efficiënte extractie van biomoleculen. Het belangrijkste voordeel van sonicatoren ligt in hun vermogen om kritische procesparameters nauwkeurig te moduleren, waaronder de ultrasone intensiteit, pulsatie en temperatuurregeling. Dankzij deze controle kunnen onderzoekers betrouwbare lysis bereiken en tegelijkertijd thermische of mechanische schade aan gevoelige biomoleculen tot een minimum beperken, wat resulteert in een mild maar zeer efficiënt extractieproces.

Cellysis met sonicatoren

Ultrasone cellysis maakt gebruik van akoestische cavitatie om celmembranen te ontwrichten en intracellulaire moleculen vrij te maken. Hielscher Ultrasonics biedt zowel de klassieke sonicator met sonde als sonicatoren voor meerdere monsters voor steriele verwerking: de VialTweeter voor meerdere buisjes en monsterflesjes en de sonicator voor platen met 96 wells UIP400MTP voor standaardmicroplaten.

Hielscher Ultrasonics levert krachtige contactloze sonicatoren voor monstervoorbereiding en klinische analyse. De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP, de VialTweeter, de CupHorn en de doorstroomsonicator GDmini2 verwerken de monsters onder steriele omstandigheden.

Sonicatie met de laboratoriumdesintegratoren UP100H en UP400St voor monstervoorbereiding. (homogenisatie, cellysis, extractie)

Ultrasone homogenisatoren UP100H (100 watt) en UP400St (400 watt): sonicatie voor cellysis en extractie.

Ultrasone homogenisatoren voor cellysis en extractie

Type ultrasoon apparaat	Toepassingsgebied	Monstervolume	Typische toepassing	Voordelen	Voorbeeldmodellen
Sonicatoren met sonde	Sonicatie van één monster	0,1 mL tot ~1000 mL	Cellysis, eiwitextractie, DNA/RNA-fragmentatie	Nauwkeurige energieregeling; diverse sonotroden; optimaal voor kleine tot middelgrote monsters	UP100H, UP200St, UP400St
VialTweeter / CupHorn	Parallelle verwerking van meerdere afgesloten monsterflesjes	8–10 monsterflesjes (elk ~1–20 mL)	Gestandaardiseerde lysis van meerdere celsuspensies	Uniforme sonicatie; voorkomt kruisbesmetting; reproduceerbare resultaten	VialTweeter, CupHorn
Sonicator voor platen met 96 wells	Sonicatie van multiwell- en microtiterplaten	Microplaatformaat	Screening met hoge verwerkingscapaciteit, proteomica, celassays	Gelijktijdige, gelijkmatige sonicatie in alle wells; ideaal voor workflows met meerdere monsters	UIP400MTP
Doorstroomcelreactoren	Continue sonicatie voor grotere volumes	>1 L, schaalbaar	Celontsluiting op industriële schaal, extractproductie	Continue verwerking; schaalbaar; volledige procescontrole (amplitude, druk, temperatuur)	UIP1000hdT, UIP2000hdT + doorstroomcel
Steriele / indirecte sonicatiesystemen	Contaminatievrije monsterverwerking	Afhankelijk van monsterflesje/buisje/microplaat	Gevoelige monsters, steriele omgevingen, omgevingen met wettelijke voorschriften	Geen contact met de sonde; voorkomt versleping; minimale reinigingsinspanning	VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP

Voordelen van sonicatie voor cellysis

Vergeleken met andere methoden voor cellysis en extractie biedt ultrasone cellysis verschillende voordelen:

Snelheid: Ultrasone cellysis en extractie is een snelle methode die cellen in enkele seconden kan openbreken. Dit is veel sneller dan andere methoden, zoals homogenisatie, invriezen en ontdooien of malen met een parelmolen.
Efficiëntie: Ultrasone cellysis en extractie kan worden gebruikt om kleine, grote of meerdere monsters tegelijk te behandelen, waardoor deze methode efficiënter is dan andere methoden die afzonderlijke verwerking van kleine monsters vereisen.
Zonder chemicaliën: Ultrasone cellysis en extractie is een niet-invasieve methode waarvoor geen agressieve chemicaliën of enzymen nodig zijn. Dit maakt de methode ideaal voor toepassingen waarbij de integriteit van de celinhoud behouden moet blijven. Ongewenste contaminatie van monsters kan worden vermeden.
Hoge opbrengst: Met ultrasone cellysis en extractie kan een hoge opbrengst aan celinhoud worden geëxtraheerd, waaronder DNA, RNA en eiwitten. Dit komt doordat de hoogfrequente geluidsgolven de celwanden openbreken en de inhoud vrijmaken in de omringende oplossing.
Temperatuurregeling: Geavanceerde sonicatoren maken nauwkeurige temperatuurregeling van het monster mogelijk. Digitale sonicatoren van Hielscher zijn uitgerust met een aansluitbare temperatuursensor en software voor temperatuurbewaking.
Reproduceerbaar: Protocollen voor ultrasone cellysis kunnen eenvoudig worden gereproduceerd en zelfs worden aangepast aan verschillende grotere of kleinere monstervolumes door eenvoudige lineaire opschaling.
Veelzijdig: Ultrasone cellysis en extractie kan worden gebruikt voor de extractie van een breed scala aan celtypen, waaronder bacteriën, gisten, schimmels, plantencellen en zoogdiercellen. De methode kan ook worden gebruikt om verschillende soorten moleculen te extraheren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden.
Gelijktijdige voorbereiding van talrijke monsters: Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen om talrijke monsters gemakkelijk onder exact dezelfde procesomstandigheden te verwerken. Dit maakt de monstervoorbereidingsstap van lysis en extractie zeer efficiënt en tijdbesparend.
Eenvoudig in gebruik: Apparatuur voor ultrasone cellysis en extractie is eenvoudig in gebruik en vereist minimale training. De apparatuur is ook economisch, omdat het om een eenmalige investering gaat waarbij geen vervangende wegwerpartikelen hoeven te worden aangeschaft. Dit maakt de apparatuur aantrekkelijk voor een breed scala aan onderzoekers en laboratoria.

Over het geheel genomen is ultrasone cellysis en extractie een snelle, efficiënte, nauwkeurig regelbare en veelzijdige methode om celinhoud te extraheren. De voordelen ten opzichte van alternatieve methoden maken deze methode een aantrekkelijke keuze voor een breed scala aan onderzoeks- en industriële toepassingen.

Deze instructievideo legt uit welk type sonicator het meest geschikt is voor uw monstervoorbereiding, zoals lyse, celontsluiting, eiwitisolatie en fragmentatie van DNA en RNA in laboratoria, analyse en onderzoek. Kies het ideale type sonicator voor uw toepassing, monstervolume, aantal monsters en verwerkingscapaciteit. Hielscher Ultrasonics heeft de ideale ultrasone homogenisator voor u!

Werkingsprincipe van ultrasone cellysis

Ultrasone cellysis en extractie maakt gebruik van hoogfrequente geluidsgolven om cellen te ontsluiten en hun inhoud te extraheren. De geluidsgolven veroorzaken drukveranderingen in de omringende vloeistof, waardoor kleine belletjes ontstaan en instorten in een proces dat cavitatie wordt genoemd. Deze belletjes genereren plaatselijk zeer intense mechanische krachten die cellen kunnen openbreken en hun inhoud in de omringende oplossing kunnen vrijmaken.

Cellysis met een sonicator omvat doorgaans de volgende stappen:

Het monster wordt in een buisje of houder met een vloeibare buffer geplaatst.
Een ultrasone sonde wordt in het monster gebracht en er worden hoogfrequente geluidsgolven van circa 20–30 kHz toegepast.
De ultrasone golven veroorzaken oscillatie en cavitatie in de omringende vloeistof, waardoor plaatselijke krachten ontstaan die cellen openbreken en hun inhoud vrijmaken.
Het monster wordt gecentrifugeerd of gefilterd om eventuele celresten te verwijderen, waarna de geëxtraheerde inhoud wordt verzameld voor verdere analyse.

Nadelen van gangbare lysismethoden

Tijdens uw werk in laboratoria hebt u mogelijk al ervaren hoe omslachtig cellysis met traditionele mechanische of chemische lysisprotocollen kan zijn.

Mechanische lysis: Mechanische lysismethoden, zoals vermalen met een vijzel en stamper of homogenisatie met een French press, parelmolen of rotor-statorsysteem, bieden vaak onvoldoende mogelijkheden voor nauwkeurige regeling en aanpassing. Dit betekent dat malen en vermalen snel warmte en afschuifkrachten kunnen genereren die het monster kunnen beschadigen en eiwitten kunnen denatureren. Deze methoden kunnen ook tijdrovend zijn en grote hoeveelheden uitgangsmateriaal vereisen.
Chemische lysis: Chemische lysismethoden, zoals lysis op basis van detergentia, kunnen het monster beschadigen door de lipidendubbellaag te ontwrichten en eiwitten te denatureren. Ze kunnen ook meerdere stappen vereisen en restverontreinigingen achterlaten die vervolgtoepassingen verstoren. Het vinden van de optimale dosering van het detergens vormt een extra uitdaging.
Vries-dooicycli: Vries-dooicycli kunnen celmembranen doen scheuren, maar herhaalde cycli kunnen ook eiwitdenaturatie en -afbraak veroorzaken. Deze methode kan ook meerdere cycli vereisen, wat tijdrovend kan zijn en vaak tot lagere opbrengsten leidt.
Enzymatische lysis: Enzymatische lysismethoden kunnen specifiek zijn voor bepaalde celtypen en vereisen meerdere stappen, waardoor ze tijdrovend zijn. Ze produceren ook afval en vereisen zorgvuldige optimalisatie om afbraak van het monster te voorkomen. Kits voor enzymatische lysis zijn vaak duur. Als uw huidige procedure voor enzymatische lysis onvoldoende resultaten oplevert, kan sonicatie als synergistische methode worden toegepast om de celontsluiting te intensiveren.

In tegenstelling tot conventionele mechanische en chemische cellysismethoden is sonicatie een zeer efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor celontsluiting dat volledige controle over de sonicatieparameters mogelijk maakt. Dit waarborgt een hoge selectiviteit bij het vrijmaken van materiaal en een hoge productzuiverheid. [cf. Balasundaram et al., 2009]
De methode is geschikt voor alle celtypen en eenvoudig toepasbaar op kleine en grote schaal – altijd onder gecontroleerde omstandigheden. Sonicatoren zijn eenvoudig te reinigen. Een ultrasone homogenisator beschikt altijd over een functie voor clean-in-place (CIP) en sterilize-in-place (SIP). De sonotrode bestaat uit een massieve titanium hoorn die kan worden afgeveegd of doorgespoeld met water of oplosmiddel (afhankelijk van het gebruikte medium). Dankzij hun robuustheid is het onderhoud van sonicatoren vrijwel verwaarloosbaar.

Ultrasone lysis en celontsluiting

Doorgaans duurt de lysis van monsters in het laboratorium tussen 15 seconden en 2 minuten. Omdat de intensiteit van sonicatie heel eenvoudig kan worden aangepast via de amplitude-instelling en de sonicatieduur en door de juiste apparatuur te kiezen, is het mogelijk celmembranen zeer voorzichtig of zeer abrupt te ontwrichten, afhankelijk van de celstructuur en het doel van de lysis (bijvoorbeeld: DNA-extractie vereist mildere sonicatie, volledige eiwitextractie uit bacteriën vereist een intensievere ultrasone behandeling). De temperatuur tijdens het proces kan met een geïntegreerde temperatuursensor worden bewaakt en eenvoudig worden geregeld door koeling (een ijsbad of doorstroomcellen met koelmantels) of door sonicatie in pulsmodus. Tijdens sonicatie in pulsmodus maken korte sonicatiecycli van 1–15 seconden warmteafvoer en koeling tijdens de langere tussenliggende pauzes mogelijk.
Alle door ultrasoon geluid aangedreven processen zijn volledig reproduceerbaar en lineair schaalbaar.

De VialTweeter is een sonicator voor meerdere monsters die betrouwbare monsterhomogenisatie onder steriele omstandigheden mogelijk maakt.

De VialTweeter is een ultrasone homogenisator voor de gelijktijdige, uniforme en snelle steriele voorbereiding van talrijke monsters.

Voorbeeldprocedure voor de ultrasone lysis van bacteriële cellen:

Voorbereiding van de celsuspensie: Celpellets moeten door homogenisatie volledig in een bufferoplossing worden gesuspendeerd (kies een bufferoplossing die verenigbaar is met de daaropvolgende analyse, bijvoorbeeld een specifieke chromatografiemethode). Voeg indien nodig lysozymen en/of andere additieven toe (deze moeten ook verenigbaar zijn met de middelen voor scheiding/zuivering). Meng/homogeniseer de oplossing voorzichtig met milde sonicatie totdat een volledige suspensie is bereikt.
Lees meer over de synergieën van lysozymen in combinatie met sonicatie!
Ultrasone lysis: Plaats het monster in een ijsbad. Soniceer de suspensie voor celontsluiting in pulsen van 60–90 seconden (met de pulsmodus van uw sonicator).
Scheiding: Centrifugeer het lysaat (bijvoorbeeld 10 min. bij 10.000 x g; bij 4degC). Scheid het supernatant voorzichtig van de celpellet. Het supernatant is het totale cellysaat. Na filtratie van het supernatant verkrijgt u een geklaarde vloeistof met het oplosbare celeiwit.

De video toont het ultrasone monstervoorbereidingssysteem UIP400MTP, waarmee alle gangbare multiwellplaten betrouwbaar kunnen worden behandeld met ultrageluid van hoge intensiteit. Typische toepassingen van de UIP400MTP zijn cellyse, fragmentatie van DNA, RNA en chromatine, en eiwitextractie.

De meest voorkomende toepassingen van sonicatoren in de biologie en biotechnologie zijn:

Bereiding van celextracten
Ontsluiting van gisten, bacteriën, plantencellen, zacht of hard celweefsel, nucleïnemateriaal
Eiwitextractie
Bereiding en isolatie van enzymen
Productie van antigenen
DNA-extractie en/of gerichte fragmentatie
Bereiding van liposomen

Celontsluiting, lysis en extractie met ultrasoon geluid is een efficiënte methode voor monstervoorbereiding in laboratoria.

Celontsluiting met een sonicator met sonde is een efficiënte methode voor monstervoorbereiding.

Verwante onderwerpen

De talrijke toepassingen van ultrasoon geluid strekken zich uit over de sectoren biotechnologie, bio-engineering, microbiologie, moleculaire biologie, biochemie, immunologie, bacteriologie, virologie, proteomica, genetica, fysiologie, celbiologie, hematologie en plantkunde.

Lysis: het afbreken van celstructuren

Cellen worden beschermd door een semipermeabel plasmamembraan dat bestaat uit een fosfolipidendubbellaag (ook een eiwit-lipidendubbellaag; gevormd door hydrofobe lipiden en hydrofiele fosformoleculen met ingebedde eiwitmoleculen) en een barrière vormt tussen het binnenste van de cel (cytoplasma) en de extracellulaire omgeving. Plantencellen en prokaryotische cellen zijn omgeven door een celwand. Door hun celwand van cellulose, die meerdere lagen dik is, zijn plantencellen moeilijker te lyseren dan dierlijke cellen. Het inwendige van de cel, zoals organellen, de celkern en het mitochondrion, wordt gestabiliseerd door het cytoskelet.
Het lyseren van de cellen heeft als doel organellen, eiwitten, DNA, mRNA of andere biomoleculen te extraheren en te scheiden.

Conventionele methoden voor cellysis en hun nadelen

Er zijn verschillende methoden om cellen te lyseren, die kunnen worden onderverdeeld in mechanische en chemische methoden. Deze omvatten het gebruik van detergentia of oplosmiddelen, het toepassen van hoge druk of het gebruik van een parelmolen of een French press. Het meest problematische nadeel van deze methoden is dat de procesparameters en daarmee het effect moeilijk te regelen en aan te passen zijn.
De onderstaande tabel toont de belangrijkste nadelen van gangbare lysismethoden:

De tabel vermeldt conventionele methoden voor celontsluiting en lysis en toont de belangrijkste nadelen van elke methode.

Tabel: conventionele methoden voor cellysis hebben grote nadelen

Lysisprocedure

Lysis is een gevoelig proces. Tijdens de lysis wordt de bescherming van het celmembraan vernietigd, maar inactivering, denaturatie en afbraak van de geëxtraheerde eiwitten door een onfysiologische omgeving (afwijking van de pH-waarde) moeten worden voorkomen. Daarom wordt lysis doorgaans uitgevoerd in een bufferoplossing. De meeste moeilijkheden ontstaan door ongecontroleerde celontsluiting, die leidt tot het ongericht vrijmaken van al het intracellulaire materiaal en/of denaturatie van het doelproduct.

Veelgestelde vragen over sonicatie en cellysis

Kunt u cellen lyseren met sonicatie? Ja, sonicatie lyseert cellen effectief met hoogfrequente ultrasone golven die cavitatie opwekken, een verschijnsel waarbij kleine dampbelletjes in de celsuspensie ontstaan en met grote kracht instorten. De resulterende mechanische krachten ontwrichten celmembranen en bevorderen het vrijkomen van intracellulaire componenten in de vloeistof.
Hoe gebruikt u een sonicator voor cellysis? Het gebruik van een sonicator voor cellysis omvat het onderdompelen van de sonicatorsonde in een celsuspensie en het instellen van parameters zoals amplitude en pulsduur. Het proces moet nauwlettend worden bewaakt om de celontsluiting te optimaliseren en tegelijkertijd eiwitdenaturatie en enzyminactivering tot een minimum te beperken.
Wat is het principe van sonicatie voor cellysis? Sonicatie werkt volgens het principe van akoestische cavitatie. Ultrasone energie wordt overgebracht naar het vloeibare medium, waardoor snelle drukschommelingen ontstaan die tot de vorming en implosie van microbelletjes leiden. Deze implosies genereren intense afschuifkrachten en plaatselijk hoge temperaturen, waardoor celstructuren worden ontwricht en de homogeniteit van het lysaat wordt verbeterd.
Hoe lang duurt sonicatie voor cellysis? De duur van sonicatie voor cellysis kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van factoren zoals het celtype, de celdichtheid, het vermogen van de sonicator en het specifieke gebruikte protocol. Typische procedures kunnen enkele seconden tot enkele minuten duren en worden vaak in cycli uitgevoerd om de warmteontwikkeling te beheersen en een uniforme celontsluiting te waarborgen.
Wat is het doel van sonicatie bij eiwitextractie? Bij eiwitextractie dient sonicatie om celmembranen efficiënt open te breken en eiwitten oplosbaar te maken. Deze methode is bijzonder nuttig om eiwitten uit cellulaire compartimenten vrij te maken en is daardoor essentieel voor het bereiden van lysaten waaruit eiwitten moeten worden gezuiverd of geanalyseerd.
Waarom wordt sonicatie gebruikt voor extractie? Sonicatie geniet de voorkeur voor extractie vanwege de snelle werking en het vermogen om gericht energie toe te passen, waardoor celstructuren worden afgebroken om bioactieve moleculen vrij te maken zonder agressieve chemische behandelingen. Hierdoor blijft de functionele integriteit van de geëxtraheerde verbindingen behouden.
Verstoort sonicatie eiwit-eiwitinteracties? Hoewel sonicatie celmembranen effectief kan ontwrichten, kan deze ook eiwit-eiwitinteracties verstoren. De mate van verstoring hangt af van de sonicatie-intensiteit en de blootstellingsduur en kan leiden tot denaturatie of dissociatie van eiwitcomplexen, wat daaropvolgende analytische of functionele onderzoeken zou kunnen beïnvloeden.
Kan sonicatie worden gebruikt om E. coli te lyseren? Sonicatoren van Hielscher zijn bijzonder effectief voor het lyseren van bacteriële cellen zoals E. coli, die stevige celwanden hebben. De techniek biedt een fysieke methode om de celwand en het celmembraan door afschuiving te ontwrichten, waardoor het een voorkeursmethode is voor het bereiden van bacteriële lysaten in laboratoria voor moleculaire biologie en biochemie.
Welke processen volgen op de sonicatiestap?
Vervolgstappen na ultrasone lysis omvatten doorgaans fractionering van het lysaat, gerichte isolatie van organellen en verdere eiwitextractie of -zuivering.
Het verwerkte lysaat wordt vervolgens gescheiden en voorbereid voor analytische of functionele toepassingen, zoals proteomica met hoge resolutie, transcriptomica of receptorbindingsonderzoek.

Literatuur/Referenties

Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.