Sonificatie voor cellyse: Celdisruptie en -extractie
Ultrasone cellyse is een veel toegepaste techniek voor monsterbereiding in moderne biotechnologische laboratoria. Het primaire doel is om celmembranen of hele cellen te verstoren om intracellulaire componenten zoals eiwitten, nucleïnezuren of organellen vrij te maken. In het dagelijkse labwerk betekent dit dat sonicatie een standaardmethode is voor gecontroleerde celdisruptie en efficiënte extractie van biomoleculen. Het belangrijkste voordeel van sonicators ligt in hun vermogen om kritieke procesparameters nauwkeurig te moduleren, waaronder ultrasone intensiteit, pulsatie en temperatuurregeling. Deze regeling stelt onderzoekers in staat om betrouwbare lysis te bereiken en tegelijkertijd thermische of mechanische schade aan gevoelige biomoleculen te minimaliseren, wat resulteert in een zacht maar zeer efficiënt extractieproces.
Cellyse met behulp van Sonicators
Ultrasone cellyse maakt gebruik van akoestische cavitatie om celmembranen te verstoren en intracellulaire moleculen vrij te maken. Hielscher Ultrasonics biedt zowel de klassieke sonicator van het probe-type als sonicators voor meerdere monsters voor steriele verwerking: de VialTweeter voor meerdere buizen en flacons en de 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP voor standaard microtiterplaten.
Hielscher Ultrasonics levert krachtige contactloze sonicators voor monstervoorbereiding en klinische analyse. De multi-wells sonicator UIP400MTP, De VialTweeter, de BekerHoorn en de GDmini2 flowsonator verwerk de monsters onder steriele omstandigheden.
Ultrasone homogenisatoren UP100H (100 watt) en UP400St (400 watt): Sonificatie voor cellyse en -extractie.
Ultrasone homogenisatoren voor cellyse en -extractie
| Type ultrasoon apparaat | Focus op toepassingen | Monstervolume | Typisch gebruik | Voordelen | Voorbeeldmodellen |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonde-type Sonicators | Sonicatie van één monster | 0.1 ml tot ~1000 ml | Cellyse, eiwitextractie, DNA/RNA-fragmentatie | Nauwkeurige energieregeling; verschillende sonotroden; optimaal voor kleine tot middelgrote monsters | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / KopHoorn | Parallelle verwerking van meerdere verzegelde flacons | 8-10 flesjes (~1-20 ml elk) | Gestandaardiseerde lysis van meerdere celsuspensies | Uniforme sonicatie; voorkomt kruisbesmetting; reproduceerbare resultaten | VialTweeter, kopshoorn |
| 96-well plaat Sonicator | Sonificatie van multiwell- en microtiterplaten | Microtiterplaatformaat | Screening met hoge doorvoer, proteomica, celtests | Gelijktijdige, gelijkmatige sonicatie over wells; ideaal voor workflows met meerdere samples | UIP400MTP |
| doorstroomcelreactoren | Continue sonicatie voor hogere volumes | >1 L, schaalbaar | Celdisruptie en productie van extracten op industriële schaal | Continue verwerking; schaalbaar; volledige procesregeling (amplitude, druk, temperatuur) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + doorstroomcel |
| Steriele / Indirecte Sonificatiesystemen | Verwerking van monsters zonder verontreiniging | Afhankelijk van flacon/buisje/microtiterplaat | Gevoelige monsters, steriele omgevingen, regelgevende instellingen | Geen contact met de sonde; voorkomt carry-over; minimale reinigingsinspanning | VialTweeter, kopshoorn, UIP400MTP |
Voordelen van het gebruik van Sonicatie voor cellyse
Vergeleken met andere cellyse- en extractiemethoden heeft ultrasone cellyse verschillende voordelen:
- Snelheid: Ultrasone cellyse en -extractie is een snelle methode die cellen binnen enkele seconden kan openbreken. Dit is veel sneller dan andere methoden zoals homogeniseren, vriesdooien of parelmalen.
- Efficiëntie: Ultrasone cellyse en -extractie kan worden gebruikt om kleine, grote of meerdere monsters tegelijk te behandelen, waardoor het efficiënter is dan andere methoden waarbij kleine monsters afzonderlijk moeten worden verwerkt.
- Chemicaliënvrij: Ultrasone cellyse en -extractie is een niet-invasieve methode waarbij geen agressieve chemicaliën of enzymen nodig zijn. Hierdoor is het ideaal voor toepassingen waarbij de integriteit van de celinhoud behouden moet blijven. Ongewenste contaminatie van monsters kan worden vermeden.
- Hoog rendement: Ultrasone cellyse en -extractie kan een hoge opbrengst aan celinhoud, waaronder DNA, RNA en eiwitten, extraheren. Dit komt doordat de geluidsgolven met een hoge frequentie de celwanden openbreken en de inhoud vrijlaten in de omringende oplossing.
- Temperatuurregeling: Geavanceerde ultrasone sensoren maken een nauwkeurige temperatuurregeling van het monster mogelijk. Hielscher digitale sonicators zijn uitgerust met een insteekbare temperatuursensor en software voor temperatuurbewaking.
- Reproduceerbaar: Protocollen voor ultrasone cellyse kunnen eenvoudig worden gereproduceerd en zelfs worden aangepast aan verschillende grotere of kleinere monstervolumes door een eenvoudige lineaire schaalvergroting.
- Veelzijdig: Ultrasone cellyse en -extractie kan worden gebruikt om een groot aantal celtypen te extraheren, waaronder bacteriën, gist, schimmels, planten- en zoogdiercellen. Het kan ook worden gebruikt om verschillende soorten moleculen te extraheren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden.
- Gelijktijdige bereiding van talrijke monsters: Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen om op comfortabele wijze meerdere monsters onder exact dezelfde procescondities te verwerken. Dit maakt de monstervoorbereidingsstap van lysis en extractie zeer efficiënt en tijdbesparend.
- Gemakkelijk te gebruiken: Ultrasone cellyse- en extractieapparatuur is eenvoudig te gebruiken en vereist minimale training. De apparatuur is ook zuinig omdat het een eenmalige investering is zonder dat er opnieuw apparatuur hoeft te worden aangeschaft. Dit maakt de apparatuur aantrekkelijk voor een breed scala aan onderzoekers en laboratoria.
Over het geheel genomen is ultrasone cellyse en -extractie een snelle, efficiënte, nauwkeurig controleerbare en veelzijdige methode om cellulaire inhoud te extraheren. De voordelen ten opzichte van alternatieve methoden maken het een aantrekkelijke keuze voor een breed scala aan onderzoeks- en industriële toepassingen.
Werkingsprincipe van ultrasone cellyse
Ultrasone cellyse en -extractie maakt gebruik van geluidsgolven met een hoge frequentie om cellen te verstoren en hun inhoud te extraheren. De geluidsgolven creëren drukveranderingen in de omringende vloeistof, waardoor kleine belletjes worden gevormd en ineenstorten in een proces dat cavitatie wordt genoemd. Deze belletjes genereren lokale, zeer intense mechanische krachten die cellen kunnen openbreken en hun inhoud in de omringende oplossing kunnen vrijlaten.
Cellyse met behulp van een ultrasoonapparaat omvat gewoonlijk de volgende stappen:
- Het monster wordt in een buis of container met een vloeibare buffer geplaatst.
- Een ultrasone sonde wordt in het monster gebracht en er worden geluidsgolven met een hoge frequentie van ongeveer 20-30 kHz toegepast.
- De ultrasone golven veroorzaken oscillatie en cavitatie in de omringende vloeistof, waardoor lokale krachten ontstaan die cellen openbreken en hun inhoud vrijgeven.
- Het monster wordt gecentrifugeerd of gefiltreerd om eventuele celresten te verwijderen en de geëxtraheerde inhoud wordt verzameld voor verdere analyse.
Nadelen van gangbare lysemethoden
Tijdens je werk in laboratoria heb je misschien al ervaren hoe lastig cellyse is met traditionele mechanische of chemische lysisprotocollen.
- Mechanische lysis: Mechanische lysemethoden, zoals malen met mortier en stamper of homogeniseren met behulp van een franspers, parelmolen of rotor-stator systeem hebben vaak geen precieze controle en instelmogelijkheden. Dit betekent dat het gebruik van malen en malen snel hitte en schuifkrachten kan genereren die het monster kunnen beschadigen en eiwitten kunnen denatureren. Ze kunnen ook tijdrovend zijn en vereisen grote hoeveelheden uitgangsmateriaal.
- Chemische lysis: Chemische lysemethoden, zoals lysis met detergentia, kunnen het monster beschadigen door de lipide bilaag te verstoren en eiwitten te denatureren. Ze kunnen ook meerdere stappen vereisen en restverontreinigingen achterlaten die interfereren met downstream toepassingen. Het vinden van de optimale dosering van het detergens is een extra uitdaging.
- Vries-dooi cycli: Vries-dooi cycli kunnen ervoor zorgen dat celmembranen scheuren, maar herhaalde cycli kunnen ook leiden tot denaturatie en degradatie van eiwitten. Deze methode kan ook meerdere cycli vereisen, wat tijdrovend kan zijn en vaak resulteert in lagere opbrengsten.
- Enzymatische lysis: Enzymatische lysemethoden kunnen specifiek zijn voor bepaalde celtypen en vereisen meerdere stappen, waardoor ze tijdrovend zijn. Ze genereren ook afval en vereisen zorgvuldige optimalisatie om degradatie van het monster te voorkomen. Enzymatische lysis kits zijn vaak duur. Als uw huidige enzymatische lysisprocedure onvoldoende resultaten oplevert, kan sonicatie als synergetische methode worden toegepast om de celdisruptie te intensiveren.
In tegenstelling tot conventionele mechanische en chemische cellysemethoden is sonicatie een zeer efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor celdesintegratie dat volledige controle over de sonicatieparameters mogelijk maakt. Dit zorgt voor een hoge selectiviteit wat betreft materiaalvrijgave en productzuiverheid. [Zie Balasundaram et al., 2009].
Het is geschikt voor alle celtypen en gemakkelijk toepasbaar op kleine en grote schaal. – altijd onder gecontroleerde omstandigheden. Ultrasone apparaten zijn eenvoudig te reinigen. Een ultrasone homogenisator heeft altijd een functie voor clean-in-place (CIP) en sterilize-in-place (SIP). De sonotrode bestaat uit een massieve titanium hoorn die kan worden afgeveegd of gespoeld in water of oplosmiddel (afhankelijk van het werkmedium). Het onderhoud van ultrasone apparaten is dankzij hun robuustheid bijna verwaarloosbaar.
Ultrasone lysis en celdisruptie
Over het algemeen duurt het lyseren van monsters in het laboratorium tussen de 15 seconden en 2 minuten. Aangezien de intensiteit van de sonicatie zeer eenvoudig kan worden aangepast door de amplitude en de sonicatietijd in te stellen en door de juiste apparatuur te kiezen, is het mogelijk om de celmembranen zeer zacht of zeer abrupt te verstoren, afhankelijk van de celstructuur en het doel van de lysis (voor DNA-extractie is bijvoorbeeld een zachtere sonicatie nodig, voor volledige eiwitextractie van bacteriën is een intensievere ultrasone behandeling nodig). De temperatuur tijdens het proces kan worden bewaakt door een geïntegreerde temperatuursensor en kan eenvoudig worden geregeld door koeling (ijsbad of doorstroomcellen met koelmantels) of door sonicatie in gepulseerde modus. Tijdens sonicatie in pulsmodus zorgen korte sonicatieburstcycli van 1-15 seconden voor warmteafvoer en koeling tijdens de langere intermitterende perioden.
Alle ultrasoon gestuurde processen zijn volledig reproduceerbaar en lineair schaalbaar.
De VialTweeter is een ultrasone homogenisator voor gelijktijdige, uniforme en snelle steriele bereiding van een groot aantal monsters.
- Bereiding van de celsuspensie: Celpellets moeten volledig gesuspendeerd worden in een bufferoplossing door homogeniseren (kies een bufferoplossing die compatibel is met de volgende analyse, bijv. specifieke chromatografiemethode). Voeg indien nodig lysozymes en/of andere additieven toe (deze moeten ook compatibel zijn met de scheidings-/zuiveringsmethode). Meng/homogeniseer de oplossing voorzichtig onder milde sonicatie tot volledige suspensie is bereikt.
Lees meer over de synergieën van lysozymes in combinatie met sonicatie! - Ultrasone lysis: Plaats het monster in een ijsbad. Soniceer voor celdisruptie de suspensie met uitbarstingen van 60-90 seconden (gebruik de pulsmodus van je sonicator).
- Scheiden: Centrifugeer het lysaat (bijvoorbeeld 10 minuten bij 10.000 xg; bij 4°C). Scheid het supernatant zorgvuldig van de celpellet. Het supernatant is het totale cellysaat. Na filtratie van het supernatans verkrijg je een geklaarde vloeistof van het oplosbare celeiwit.
De meest voorkomende toepassingen voor ultrasone apparaten in de biologie en biotechnologie zijn:
- Bereiding celextract
- Ontwrichting van gist, bacteriën, plantencellen, zacht of hard celweefsel, nucleair materiaal
- eiwitextractie
- Bereiding en isolatie van enzymen
- Productie van antigenen
- DNA-extractie en/of gerichte fragmentatie
- liposoompreparaat
Celdisruptie met een ultrasone sonde is een efficiënte methode voor monstervoorbereiding.
De vele toepassingen van ultrageluid strekken zich uit over de sectoren biotechnologie, bio-engineering, microbiologie, moleculaire biologie, biochemie, immunologie, bacteriologie, virologie, proteomica, genetica, fysiologie, celbiologie, hematologie en plantkunde.
Lysis: Celstructuren doorbreken
Cellen worden beschermd door een semi-permeabel plasmamembraan dat bestaat uit een fosfo-lipide bilaag (ook eiwit-lipide bilaag; gevormd door hydrofobe lipiden en hydrofiele fosformoleculen met ingebedde eiwitmoleculen) en een barrière vormt tussen het celinterieur (cytoplasma) en de extracellulaire omgeving. Plantencellen en prokaryote cellen zijn omgeven door een celwand. Door de meerdere lagen dikke celwand van cellulose zijn plantencellen moeilijker te ontsmetten dan dierlijke cellen. Het inwendige van de cel, zoals organellen, kernen en mitochondriën, wordt gestabiliseerd door het cytoskelet.
Door de cellen te lyseren, worden de organellen, eiwitten, DNA, mRNA of andere biomoleculen geëxtraheerd en gescheiden.
Conventionele methoden voor cellyse en hun nadelen
Er zijn verschillende methoden om cellen te lyseren, die kunnen worden onderverdeeld in mechanische en chemische methoden, waaronder het gebruik van detergenten of oplosmiddelen, de toepassing van hoge druk of het gebruik van een parelmolen of franspers. Het meest problematische nadeel van deze methoden is de moeilijke controle en aanpassing van de procesparameters en daardoor de impact.
De onderstaande tabel toont de belangrijkste nadelen van gangbare lysemethoden:
Tabel: Conventionele methoden voor cellyse hebben grote nadelen
Lysisprocedure
Lysis is een gevoelig proces. Tijdens de lysis wordt de bescherming van het celmembraan vernietigd, maar inactivering, denaturatie en afbraak van de geëxtraheerde eiwitten door een niet-fysiologische omgeving (afwijking van de pH-waarde) moet worden voorkomen. Daarom wordt lysis over het algemeen uitgevoerd in een bufferoplossing. De meeste problemen ontstaan door ongecontroleerde celdisruptie met als gevolg een ongerichte vrijgave van al het intracellulaire materiaal en/of denaturatie van het doelproduct.
Veelgestelde vragen over Sonicatie en cellyse
- Kun je cellen lyseren met sonicatie? Ja, sonicatie is een effectieve manier om cellen te lyseren met behulp van ultrasone golven met een hoge frequentie die cavitatie induceren, een fenomeen waarbij kleine dampbelletjes ontstaan en heftig in elkaar klappen binnen de celsuspensie. De resulterende mechanische krachten verstoren de celmembranen en vergemakkelijken het vrijkomen van intracellulaire componenten in de vloeistof.
- Hoe gebruik je een sonicator voor cellyse? Bij het gebruik van een sonicator voor cellyse wordt de sonicatorsonde in een celsuspensie gedompeld en worden parameters als amplitude en pulsduur aangepast. Het proces moet nauwlettend in de gaten worden gehouden om de celdisruptie te optimaliseren en tegelijkertijd denaturatie van eiwitten en inactivering van enzymen te minimaliseren.
- Wat is het principe van sonicatie voor cellyse? Sonificatie werkt volgens het principe van akoestische cavitatie. Ultrasone energie wordt in het vloeibare medium overgebracht en veroorzaakt snelle drukschommelingen die leiden tot de vorming en implosie van microbelletjes. Deze implosies genereren intense schuifkrachten en plaatselijke hoge temperaturen, waardoor celstructuren worden verstoord en de homogeniteit van het lysaat wordt verbeterd.
- Hoe lang duurt cellyse-sonisatie? De duur van sonicatie voor cellyse kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van factoren zoals celtype, celdichtheid, vermogen van de sonicator en het specifieke protocol dat wordt gebruikt. Typische procedures kunnen variëren van enkele seconden tot enkele minuten, vaak uitgevoerd in cycli om de warmteontwikkeling te beheersen en een uniforme celdisruptie te garanderen.
- Wat is het doel van sonicatie bij eiwitextractie? Bij eiwitextractie dient sonicatie om efficiënt celmembranen te scheuren en eiwitten op te lossen. Deze methode is vooral nuttig voor het vrijmaken van eiwitten uit cellulaire compartimenten, waardoor het essentieel is voor het bereiden van lysaten waaruit eiwitten gezuiverd of geanalyseerd moeten worden.
- Waarom wordt sonicatie gebruikt voor extractie? Sonificatie wordt geprefereerd voor extractie vanwege de snelle werking en het vermogen om gerichte energie toe te passen, waardoor celstructuren worden afgebroken om bioactieve moleculen vrij te maken zonder het gebruik van agressieve chemische behandelingen, waardoor de functionele integriteit van de geëxtraheerde verbindingen behouden blijft.
- Verstoort sonicatie eiwit-eiwit interacties? Hoewel sonicatie celmembranen effectief kan verstoren, kan het ook eiwit-eiwit interacties verstoren. De mate van verstoring hangt af van de intensiteit van de sonicatie en de duur van de blootstelling, wat kan leiden tot denaturatie of dissociatie van eiwitcomplexen, wat latere analytische of functionele studies kan beïnvloeden.
- Kan sonicatie worden gebruikt om E. coli te lyseren? Hielscher sonicators zijn bijzonder effectief voor het lyseren van bacteriële cellen zoals E. coli, die robuuste celwanden hebben. De techniek biedt een fysieke methode om de celwand en het membraan af te schuiven, waardoor het een voorkeursmethode is voor het bereiden van bacteriële lysaten in laboratoria voor moleculaire biologie en biochemie.
- Wat zijn de volgende processen na de sonicatiestap?
Downstreamstappen na ultrasone lysis omvatten meestal fractionering van het lysaat, gerichte isolatie van organellen en verdere eiwitextractie of -zuivering.
Het verwerkte lysaat wordt vervolgens gescheiden en voorbereid voor analytische of functionele toepassingen, zoals proteomics met hoge resolutie, transcriptomics of receptorbindingsstudies.
Literatuur/referenties
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.