Ultrasone toepassingen in MonkeyPox Virus
Ultrasoonbehandeling is een belangrijke verwerkingsmethode voor de isolatie van het monkeypoxvirus (MPXV) uit analysemonsters, voor de fragmentatie van virus-DNA en bij de productie van monkeypoxvaccins. Voor monstervoorbereiding vóór diagnostiek en analyse (PCR, ELISA enz.) wordt ultrasoonbehandeling gebruikt om cellen te lyseren teneinde het monkeypoxvirus uit het celinterieur vrij te maken en/of om DNA te fragmenteren. Bij de productie van vaccins variëren de toepassingen van virusdeeltjes / DNA-preparatie, inkapseling in geneesmiddeldragers en formulering van de inocula.
Hieronder vindt u gedetailleerde informatie over de ultrasone bereiding van monsters van het monkeypoxvirus en over de ultrasoon ondersteunde productie van het MPXV-vaccin.
Wat u op deze pagina zult vinden:
- Ultrasone lysis voor Monkeypox Virus Extractie
- Ultrasone fragmentatie van het DNA van het apenpokkenvirus
- Ultrasone toepassingen in MPXV-vaccinproductie
Dit systeem van 2x 1kW ultrasoonapparaten voor continu-bedrijf is geïnstalleerd in een vaccinproductiefaciliteit.
Ultrasone lysis en DNA-fragmentatie vóór polymerasekettingreactie (PCR)
Een infectie met het monkeypoxvirus wordt opgespoord door middel van nucleïnezuuramplificatietests (NAAT), waarbij gebruik wordt gemaakt van real-time of conventionele polymerasekettingreactie (PCR), voor de opsporing van unieke sequenties van viraal DNA. Het monster (bv. van nasofaryngeale uitstrijkjes of huidbiopten) bevat het virus in cellen.
Voor analyse moet het virus worden vrijgemaakt uit de cellen en moet het virale DNA worden gefragmenteerd voor PCR.
Ultrasone lysis:
Ultrasone celdisruptie / lysis is een betrouwbare en efficiënte methode om virussen uit celmonsters te isoleren en daardoor een techniek die de voorkeur verdient boven chemische middelen, zoals lysozym, proteïnase K en verschillende detergenten die als alternatief worden gebruikt om cellysis en het vrijkomen van DNA te bereiken.
Het gebruik van dergelijke chemische reagentia vereist echter een tijdrovende monstervoorbereiding in verschillende stappen vóór de PCR-analyse om remming van de PCR-reactie te voorkomen. Aangezien PCR-remmers de efficiëntie van de amplificatie beïnvloeden, kunnen kleine variaties van de hoeveelheid remmers die niet worden verwijderd, leiden tot grote variaties in de amplificatie van het PCR-product (Diaco, 1995).
Het voordeel van ultrasoonbehandeling voor de lysis is dat een volledige ontwrichting van de celstructuren en het vrijkomen van DNA zonder de noodzaak van lysereagentia en een tijdrovende monstervoorbereiding wenselijk zijn. (cf. Fykse et al., 2003)
Ultrasone DNA Fragmentatie:
Ultrasone DNA-fragmentatie is eenvoudig en betrouwbaar omdat het DNA-fragmenten produceert die in lengte (baseparen, bp) kunnen worden afgestemd. Met behulp van ultrageluid kan DNA effectief worden gefragmenteerd tot de beoogde DNA-lengte. Nauwkeurige controle over ultrasone parameters en geavanceerde koelopties voorkomen DNA-degradatie.
Lees meer over ultrasone DNA fragmentatie!
Ultrasone toepassingen in Monkeypox Virus Vaccin
De vaccins die tegen het monkeypoxvirus worden gebruikt, zijn momenteel levende virusvaccins. Voor nieuw te ontwikkelen vaccins kunnen andere platforms worden gebruikt, zoals op DNA gebaseerde vaccins. Het bevat momenteel een gemodificeerd Vaccinia Ankara-virus, een verzwakt, zich niet replicerend orthopoxvirus. Het bevat ook Tris (tris-aminomethaan) en natriumchloride. Het vaccin kan ook kleine hoeveelheden DNA en eiwit bevatten van de Chicken Embryo Fibroblast-cellen, die worden gebruikt om het vaccinvirus te kweken, benzonase en antibiotische verbindingen zoals gentamicine en ciprofloxacine.
Ultrasone homogenisatie wordt gebruikt bij de productie van levend-geattenueerde virusvaccins, DNA-vaccins, multivalente DNA-cocktails, mRNA-vaccins, recombinante eiwitvaccins, virusachtige deeltjesvaccins, enz.
- verspreiding van virusdeeltjes en agentia
- emulgering
- inactivering van virussen
- formulering van de geneesmiddelendrager (NLC, SLN)
- inkapseling
- oplossen van agentia
- bereiding van hulpstoffen
- Ontgassing / Ontluchting
Protocol voor ultrasone isolatie van het apenpokkenvirus
Het onderzoeksteam van Stittelaar (2005) gebruikte ultrasone lysis om het monkeypoxvirus vrij te maken uit de celcultuur van de groeigastheer en uit cellen die via keelwissels van besmette primaten waren verkregen.
Monkeypox Vaccin Voorbereiding:
Monkeypoxvirussen werden gekweekt op specifieke pathogeenvrije kippenembryofibroblastcellen. Na incubatie gedurende 1 à 2 dagen werd de virus-celsuspensie geoogst door één vries-dooironde en vervolgens geconcentreerd door centrifugeren. De pellet werd geresuspendeerd en onderworpen aan verschillende ultrasone homogenisatierondes.
Monkeypox Virus Isolatie van gevaccineerde makaken:
De monsters werden driemaal gevriesdroogd en gesoniseerd in een ultrasone CupHorn. Twee verdunningen (1:10 en 1:100) in transportmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum werden gebruikt om Vero-celmonolayers in zes-wellsplaten te inoculeren. Na 1 uur incubatie bij 37°C werden de inocula verwijderd en vervangen door kweekmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum. De monolayers werden gedurende 5 dagen bij 37°C gekweekt en gekleurd met een kristalvioletoplossing.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasone apparaten voor virusanalyse en vaccinproductie
Hielscher Ultrasonics brede productportfolio biedt de ideale ultrasoonmachine voor onderzoeks- en analyselaboratoria en voor de industriële productie van vaccins.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerp, de fabricage en distributie van hoogwaardige ultrasoonapparatuur en sono-bioreactoren voor gebruik in onderzoeks- en analyselaboratoria, alsmede voor toepassing bij de industriële productie van vaccins (bijv. vaccins, API's).
Sonificatie kan worden toegepast in open vaten, gesloten continu geroerde reactoren en continu doorstroomreactoren. Alle onderdelen van de ultrasone systemen die in contact komen met het vloeibare medium, zijn vervaardigd van roestvrij staal, titanium of glas. Autoclaveerbare onderdelen en sanitaire armaturen garanderen de productie onder farmaceutische condities.
Automatische gegevensregistratie: Intelligente software registreert automatisch de parameters van het geluidsproces op de geïntegreerde SD-geheugenkaart. De nauwkeurige regeling van alle procesparameters zorgt ervoor dat de reproduceerbaarheid, standaardisatie van de productieen vergemakkelijkt de naleving van de veiligheidsnormen voor farmaceutische producten.
Hielscher Ultrasonics’ ultrasoonprocessoren zijn uiterst betrouwbaar en kunnen nauwkeurig worden geregeld. Alle industriële ultrasoonprocessoren kunnen worden ingesteld om het volledige bereik van lage tot zeer hoge amplitudes te leveren. De robuustheid van Hielscher's ultrasoon systemen maakt het mogelijk om 24/7 onder zware belasting en in veeleisende omgevingen te werken.
Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators:
| batch Volume | Stroomsnelheid | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| multi-well / microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml / min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100L | 2 tot 10 l / min | UIP4000hdT |
| n.v.t. | 10 tot 100 l / min | UIP16000 |
| n.v.t. | grotere | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Vraag ons!
Ultrasone DNA Shearing
Aangepast van Jkwchui onder CC-BY-SA.03
Literatuur / Referenties
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Feiten die de moeite waard zijn om te weten
Monkeypox Virus
Monkeypox (MPV, MPXV, of hMPXV) is een soort dubbelstrengs DNA-virus, dat een virale zoönose veroorzaakt. Deze ziekte staat bekend als monkeypoxinfectie en kan bij mens en dier voorkomen. Het behoort tot het geslacht Orthopoxvirus in de familie Poxviridae. Het monkeypoxvirus behoort tot de humane orthopoxvirussen, samen met het variola- (VARV), het koepokken- (CPX) en het vaccinia- (VACV) virus. Orthopoxvirussen worden gekenmerkt door grote baksteenvormige virusdeeltjes, die een dubbelstrengs DNA-genoom van ongeveer 200.000 bp bevatten.
ELISA-test
ELISA staat voor Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay en is een gelabelde immunoassay die als de gouden standaard van immunoassays wordt beschouwd. ELISA is een immunologische test, gewaardeerd om zijn hoge diagnostische gevoeligheid, die wordt gebruikt voor het opsporen en kwantificeren van moleculen, waaronder antilichamen, antigenen, eiwitten, glycoproteïnen en hormonen. Het principe van ELISA is gebaseerd op een antigeen-antilichaam interactie. Door deze antigeen-antilichaam interactie binden de specifieke antilichamen zich aan het doelantigeen. Alleen wanneer de interactie plaatsvindt, kan het substraat zich aan het enzym binden en kan een daaropvolgende omzetting van het substraat worden waargenomen, wat een positief resultaat betekent.
Hielscher Ultrasonics vervaardigt hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van Laboratorium naar industrieel formaat.