Ultrasone toepassingen bij apenpokkenvirus
Ultrasoon is een belangrijke verwerkingsmethode voor de isolatie van het monkeypoxvirus (MPXV) uit analysemonsters, voor virus-DNA-fragmentatie en bij de productie van monkeypoxvaccins. Voor monstervoorbereiding vóór diagnostiek en analyse (PCR, ELISA enz.) wordt ultrasoonbehandeling gebruikt om cellen te lyseeren om het monkeypoxvirus los te maken uit het inwendige van de cel en/of om DNA te fragmenteren. Bij de productie van vaccins variëren de toepassingen van virusdeeltjes / DNA-preparatie, inkapseling in medicijndragers en het formuleren van de inocula.
Hieronder vindt u gedetailleerde informatie over ultrasone monkeypoxvirusmonstervoorbereiding en ultrasoon ondersteunde MPXV-vaccinproductie.
Wat je op deze pagina vindt:
- Ultrasone Lysis voor Monkeypox Virus Extractie
- Ultrasone fragmentatie van DNA van het Monkeypoxvirus
- Ultrasone toepassingen in MPXV-vaccinproductie
Dit systeem van 2x 1kW ultrasone apparaten voor continue werking is geïnstalleerd in een vaccinproductiefaciliteit.
Ultrasone lysis en DNA-fragmentatie vóór polymerasekettingreactie (PCR)
Een infectie met het monkeypoxvirus wordt opgespoord door middel van nucleïnezuuramplificatietests (NAAT), waarbij gebruik wordt gemaakt van realtime of conventionele polymerasekettingreactie (PCR) voor de detectie van unieke sequenties van viraal DNA. Het monster (bijvoorbeeld van nasofaryngeale swap of huidbiopten) bevat het virus in cellen.
Voor analyse moet het virus uit de cellen worden vrijgemaakt en moet het virale DNA worden gefragmenteerd voor PCR.
Ultrasone lysis:
Ultrasone celdisruptie/-lyse is een betrouwbare en efficiënte methode om virussen uit celmonsters te isoleren en verdient daarom de voorkeur boven chemische middelen, zoals lysozym, proteïnase K en verschillende detergenten die als alternatief worden gebruikt om cellyse en het vrijkomen van DNA te bereiken.
Het gebruik van dergelijke chemische reagentia vereist echter een tijdrovende monstervoorbereiding in verschillende stappen vóór de PCR-analyse om remming van de PCR-reactie te voorkomen. Aangezien PCR-remmers de efficiëntie van de amplificatie beïnvloeden, kunnen kleine variaties in de hoeveelheid remmers die niet worden verwijderd, leiden tot grote variaties in de amplificatie van het PCR-product (Diaco, 1995).
Het voordeel van ultrasoonbehandeling voor lysis is dat een volledige verstoring van de celstructuren en het vrijkomen van DNA zonder de noodzaak van lyserende reagentia en tijdrovende monstervoorbereiding wenselijk zijn. (cf. Fykse et al., 2003)
Ultrasone DNA-fragmentatie:
Ultrasone DNA-fragmentatie is eenvoudig en betrouwbaar omdat het DNA-fragmenten produceert met een instelbare lengte (baseparen, bp). Met ultrasoon geluid kan DNA effectief worden gefragmenteerd tot de beoogde DNA-lengte. Nauwkeurige controle over de ultrasone parameters en geavanceerde koelopties voorkomen DNA-degradatie.
Lees meer over ultrasone DNA-fragmentatie!
Ultrasone toepassingen in het apenpokkenvirusvaccin
Vaccins tegen het monkeypoxvirus zijn momenteel levende virusvaccins. Nieuw ontwikkelde vaccins zouden andere platforms kunnen gebruiken, zoals op DNA gebaseerde vaccins. Het bevat momenteel een gemodificeerd Vaccinia Ankara-virus, een verzwakt, niet-replicerend orthopoxvirus. Het bevat ook tris (tris-aminomethaan) en natriumchloride. Het vaccin kan ook kleine hoeveelheden DNA en eiwit bevatten van de Chicken Embryo Fibroblast-cellen, die worden gebruikt om het vaccinvirus te kweken, benzonase en antibiotische verbindingen zoals gentamicine en ciprofloxacine.
Ultrasone homogenisatie wordt gebruikt bij de productie van levend-verzwakte virusvaccins, DNA-vaccins, multivalente DNA-cocktails, mRNA-vaccins, recombinante eiwitvaccins, virusachtige deeltjesvaccins, enz.
- dispersie van virusdeeltjes en agentia
- Emulgering
- inactivatie van virussen
- geneesmiddeldragerformulering (NLC, SLN)
- inkapseling
- oplossen van middelen
- bereiding van hulpstoffen
- Ontgassing / Ontluchting
Hier vindt u meer diepgaande informatie over ultrasone toepassingen voor verbeterde vaccinproductie!
Protocol voor ultrasone isolatie van het apenpokkenvirus
Het onderzoeksteam van Stittelaar (2005) gebruikte ultrasone lysis om het monkeypoxvirus vrij te maken uit de celcultuur van de groeigastheer en uit cellen verkregen via keelruil van geïnfecteerde primaten.
Monkeypox-vaccinpreparaat:
Monkeypoxvirussen werden gekweekt op specifiek pathogeenvrije kippenembryofibroblastcellen. Na incubatie gedurende 1 tot 2 dagen werd de virus-celsuspensie geoogst door één keer te vriesdooien en vervolgens geconcentreerd door centrifugeren. De pellet werd geresuspendeerd en onderworpen aan verschillende ultrasonische homogenisatierondes.
Isolatie van het Monkeypoxvirus uit gevaccineerde makaken:
De monsters werden drie keer gevriesdroogd en gesonitiseerd in een ultrasone CupHorn. Twee verdunningen (1:10 en 1:100) in transportmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum werden gebruikt om Vero-celmonolayers in zes-wellplaten te inoculeren. Na 1 uur incubatie bij 37°C werden de inocula verwijderd en vervangen door kweekmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum. De monolagen werden gedurende 5 dagen bij 37°C gekweekt en gekleurd met een kristalvioletoplossing.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasone apparaten voor virusanalyse en vaccinproductie
Het brede productassortiment van Hielscher Ultrasonics biedt de ideale ultrasoonmachine voor onderzoeks- en analyselaboratoria en voor de industriële productie van vaccins.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerp, de productie en distributie van hoogwaardige ultrasone apparaten en sono-bioreactoren voor gebruik in onderzoeks- en analyselaboratoria en voor industriële vaccinproductie (bijv. vaccins, API's).
Sonificatie kan worden toegepast op open vaten, gesloten reactoren met continue roering en reactoren met continue doorstroming. Alle onderdelen van de ultrasone systemen die in contact komen met het vloeibare medium zijn gemaakt van roestvrij staal, titanium of glas. Autoclaveerbare onderdelen en sanitaire fittingen garanderen de productie onder omstandigheden van farmaceutische kwaliteit.
Automatische gegevensregistratie: Intelligente software registreert de parameters van het sonicatieproces automatisch op de geïntegreerde SD-geheugenkaart. De nauwkeurige regeling van alle procesparameters zorgt voor de reproduceerbaarheid, standaardisatie van productieen vergemakkelijkt de naleving van de veiligheidsnormen voor farmaceutische producten.
Hielscher Ultrasonics’ ultrasone processoren zijn uiterst betrouwbaar en kunnen nauwkeurig worden geregeld. Alle industriële ultrasoonprocessoren kunnen worden ingesteld om het volledige bereik van lage tot zeer hoge amplitudes te leveren. Dankzij de robuustheid van Hielschers ultrasone systemen kunnen ze 24/7 worden gebruikt onder zware omstandigheden en in veeleisende omgevingen.
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone machines:
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| multi-well/microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100 liter | 2 tot 10 l/min | UIP4000hdT |
| n.v.t. | 10 tot 100 l/min | UIP16000 |
| n.v.t. | groter | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
Ultrasoon DNA-scheren
Aangepast van Jkwchui onder CC-BY-SA.03
Literatuur / Referenties
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Wetenswaardigheden
Monkeypoxvirus
Monkeypox (MPV, MPXV of hMPXV) is een dubbelstrengs DNA-virus dat een virale zoönose veroorzaakt. Deze ziekte staat bekend als monkeypoxinfectie en kan voorkomen bij mensen en dieren. Het behoort tot het geslacht Orthopoxvirus in de familie Poxviridae. Monkeypoxvirus is een van de menselijke orthopoxvirussen samen met variola- (VARV), cowpox- (CPX) en vaccinia- (VACV) virussen. Orthopoxvirussen worden gekenmerkt door grote, baksteenvormige virusdeeltjes met een dubbelstrengs DNA-genoom van ongeveer 200.000 bp.
ELISA-test
ELISA staat voor Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay en is een gelabelde immunoassay die wordt beschouwd als de gouden standaard van immunoassays. ELISA is een immunologische test die wordt gewaardeerd om zijn hoge diagnostische gevoeligheid en wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van moleculen, waaronder antilichamen, antigenen, eiwitten, glycoproteïnen en hormonen. Het principe van ELISA is gebaseerd op een antigeen-antilichaaminteractie. Door deze antigeen-antilichaaminteractie binden de specifieke antilichamen zich aan het doelantigeen. Alleen wanneer de interactie plaatsvindt, kan het substraat zich aan het enzym binden en kan een daaropvolgende substraatomzetting worden waargenomen, wat betekent dat een positief resultaat wordt verkregen.
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.