Ultrasone toepassingen bij het apenpokkenvirus

Sonicatie is een belangrijke verwerkingsmethode voor de isolatie van het apenpokkenvirus (MPXV) uit analytische monsters, voor de fragmentatie van viraal DNA en voor de productie van apenpokkenvaccins. Bij de monstervoorbereiding vóór diagnostiek en analyse (PCR, ELISA enz.) wordt sonicatie gebruikt om cellen te lyseren, zodat het apenpokkenvirus uit het binnenste van de cel vrijkomt en / of om DNA te fragmenteren. Bij de vaccinproductie lopen de toepassingen uiteen van de voorbereiding van virusdeeltjes / DNA en inkapseling in geneesmiddeldragers tot het formuleren van de inocula.
Hieronder vindt u gedetailleerde informatie over ultrasone monstervoorbereiding voor het apenpokkenvirus en over ultrasoon ondersteunde productie van MPXV-vaccins.

Wat u op deze pagina vindt:

• Ultrasone lysis voor de extractie van het apenpokkenvirus
• Ultrasone fragmentatie van DNA van het apenpokkenvirus
• Ultrasone toepassingen bij de productie van MPXV-vaccins

Ultrasone lysis en DNA-fragmentatie vóór de polymerasekettingreactie (PCR)

Een infectie met het apenpokkenvirus wordt aangetoond met een nucleïnezuuramplificatietest (NAAT), waarbij een realtime- of conventionele polymerasekettingreactie (PCR) wordt gebruikt om unieke sequenties van viraal DNA te detecteren. Het monster (bijvoorbeeld van een nasofaryngeaal uitstrijkje of huidbiopten) bevat het virus in cellen.
Voor de analyse moet het virus uit de cellen worden vrijgemaakt en moet het virale DNA voor PCR worden gefragmenteerd.

Ultrasone lysis:

Ultrasone celontsluiting / lysis is een betrouwbare en efficiënte methode om virussen uit celmonsters te isoleren en verdient daardoor de voorkeur boven chemische middelen, zoals lysozym, proteïnase K en verschillende detergentia die als alternatief worden gebruikt om cellysis en het vrijkomen van DNA te bereiken.
Het gebruik van dergelijke chemische reagentia vereist echter een tijdrovende monstervoorbereiding in meerdere stappen vóór de PCR-analyse om remming van de PCR-reactie te voorkomen. Aangezien PCR-remmers de efficiëntie van de amplificatie beïnvloeden, kunnen kleine variaties in de hoeveelheid remmers die niet worden verwijderd tot grote variaties in de amplificatie van het PCR-product leiden (Diaco, 1995).
Het voordeel van sonicatie voor lysis is dat volledige ontsluiting van celstructuren en het vrijkomen van DNA zonder lysisreagentia en tijdrovende monstervoorbereiding wenselijk zijn. (vgl. Fykse et al., 2003)

Ultrasone DNA-fragmentatie:

Ultrasone DNA-fragmentatie is eenvoudig en betrouwbaar, omdat deze DNA-fragmenten oplevert waarvan de lengte kan worden ingesteld (basenparen, bp). Met ultrageluid kan DNA effectief tot de beoogde DNA-lengte worden gefragmenteerd. Nauwkeurige controle van de ultrasone parameters en geavanceerde koelmogelijkheden voorkomen DNA-afbraak.
Lees meer over ultrasone DNA-fragmentatie!

Ultrasone toepassingen bij vaccins tegen het apenpokkenvirus

Vaccins die tegen het apenpokkenvirus worden gebruikt, zijn momenteel vaccins met levend virus. Nieuw ontwikkelde vaccins zouden andere platforms kunnen gebruiken, zoals op DNA gebaseerde… Bevat momenteel een gemodificeerd Vaccinia Ankara-virus, een verzwakt, niet-replicerend orthopoxvirus. Bevat ook Tris (tris-aminomethaan) en natriumchloride. Het vaccin kan ook kleine hoeveelheden DNA en eiwit bevatten uit de fibroblastcellen van kippenembryo’s die worden gebruikt om het vaccinvirus te kweken, evenals benzonase en antibiotische verbindingen zoals gentamicine en ciprofloxacine.

Ultrasone homogenisatie wordt gebruikt bij de productie van vaccins met levend verzwakt virus, DNA-vaccins, multivalente DNA-cocktails, mRNA-vaccins, vaccins op basis van recombinante eiwitten, vaccins op basis van virusachtige deeltjes, enz.

Hier vindt u uitgebreidere informatie over ultrasone toepassingen voor een verbeterde vaccinproductie!

Protocol voor ultrasone isolatie van het apenpokkenvirus

Het onderzoeksteam van Stittelaar (2005) gebruikte ultrasone lysis om het apenpokkenvirus vrij te maken uit de gastheercelcultuur waarin het werd gekweekt en uit cellen die via keeluitstrijkjes van geïnfecteerde primaten werden verkregen.

Bereiding van apenpokkenvaccins:

Apenpokkenvirussen werden gekweekt op fibroblastcellen van kippenembryo’s die vrij waren van specifieke pathogenen. Na incubatie gedurende 1 tot 2 dagen werd de virus-celsuspensie geoogst door één cyclus van invriezen en ontdooien en vervolgens geconcentreerd door centrifugatie. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd en onderworpen aan meerdere rondes van ultrasone homogenisatie.

Isolatie van het apenpokkenvirus uit gevaccineerde makaken:

De monsters werden driemaal ingevroren en ontdooid en gesoniceerd in een ultrasone CupHorn. Twee verdunningen (1:10 en 1:100) in transportmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum werden gebruikt om monolagen van Vero-cellen in platen met zes wells te inoculeren. Na 1 h incubatie bij 37°C werden de inocula verwijderd en vervangen door kweekmedium aangevuld met 1% foetaal runderserum. De monolagen werden gedurende 5 dagen bij 37°C gekweekt en gekleurd met een kristalvioletoplossing.
(vgl. Stittelaar et al., 2005)

Sonicatoren voor virusanalyse en vaccinproductie

Het brede productportfolio van Hielscher Ultrasonics biedt de ideale sonicator voor onderzoeks- en analytische laboratoria en voor industriële vaccinproductie.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerp, de productie en de distributie van sonicatoren en sonobioreactoren met hoge prestaties voor gebruik in onderzoeks- en analytische laboratoria en voor toepassing in de industriële vaccinproductie (bijv. vaccins, API’s).
Sonicatie kan worden toegepast in open vaten, gesloten continu geroerde reactoren en reactoren met continue doorstroming. Alle onderdelen van de ultrasone systemen die in contact komen met het vloeibare medium zijn gemaakt van roestvast staal, titanium of glas. Autoclaveerbare onderdelen en sanitaire aansluitingen garanderen productie onder omstandigheden van farmaceutische kwaliteit.
Automatische gegevensregistratie: Intelligente software registreert de parameters van het sonicatieproces automatisch op de geïntegreerde SD-geheugenkaart. De nauwkeurige controle van alle procesparameters garandeert de reproduceerbaarheid, standaardisatie van de productie, en vergemakkelijkt het voldoen aan de normen voor de veiligheid van farmaceutische producten.
De ultrasone processoren van Hielscher Ultrasonics zijn zeer betrouwbaar en kunnen nauwkeurig worden aangestuurd. Alle industriële sonicatoren kunnen worden ingesteld om het volledige bereik van lagere tot zeer hoge amplitudes te leveren. De robuustheid van de ultrasone systemen van Hielscher maakt 24/7-gebruik mogelijk bij zware belasting en in veeleisende omgevingen.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze sonicatoren: