Protocol voor bepaling van de minimale remmende concentratie (MIC)

De Biofilm-gebaseerde Minimum Inhibitory Concentration (MIC)-test is een essentiële methode voor het evalueren van de effectiviteit van antimicrobiële stoffen tegen biofilm-geassocieerde micro-organismen, die een verhoogde weerstand vertonen vanwege hun beschermende extracellulaire matrix. Een cruciale stap in deze test is de verstoring van biofilmstructuren om ingesloten cellen vrij te maken voor een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid. De UIP400MTP sonicator voor meerdere wells vergemakkelijkt dit proces door gebruik te maken van gefocust ultrasoon geluid om gecontroleerde cavitatie te genereren, waardoor biofilmcellen efficiënt worden losgemaakt en in een uniforme suspensie worden gedispergeerd. Deze nauwkeurige en reproduceerbare verstoring van de biofilm verbetert de betrouwbaarheid en verwerkingscapaciteit van MIC-tests, waardoor de UIP400MTP een essentieel hulpmiddel is voor de vooruitgang van biofilmonderzoek.

Sonificatie voor biofilmonthechting

De Biofilm-gebaseerde MIC-test meet gewoonlijk de levensvatbaarheid of groeiremming van bacteriën met behulp van methoden zoals uitplaten, kolonietelling of optische dichtheidsmetingen. Sonificatie is een cruciale stap in MIC-tests op basis van biofilm bij het bepalen van de antimicrobiële gevoeligheid van micro-organismen die met biofilm geassocieerd zijn. De belangrijkste functie is het losmaken en dispergeren van cellen in de biofilmmatrix tot een uniforme suspensie voor nauwkeurige analyse.
Biofilms zijn aanzienlijk resistenter tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met planktoncellen, waardoor een goede onthechting essentieel is voor een nauwkeurige analyse. Tijdens dit proces genereren ultrasone golven gecontroleerde cavitatie, waardoor de biofilmmatrix uiteenvalt en de ingebedde cellen vrijkomen in een uniforme suspensie in het herstelmedium. Deze stap maakt een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid van de biofilmcellen mogelijk door methoden zoals uitplaten, verdunnen en kolonietelling. Een juiste verstoring van de biofilm door sonicatie voorkomt dat achtergebleven matrixcomponenten de cellen afschermen, wat anders zou kunnen leiden tot een onderschatting van de antimicrobiële activiteit. De multi-well plaat sonicator UIP400MTP is bijzonder geschikt voor dit doel en biedt nauwkeurige en reproduceerbare sonicatiecondities voor een betrouwbare en high-throughput bereiding van testplaten.

Waarom Sonicatie nodig is in Biofilm-gebaseerde Minimum Inhibitrory Concentration Assays

Voor levensvatbaarheidsmetingen en celtellingen is een volledige en betrouwbare losmaking en dispersie van afzonderlijke cellen vereist. De UIP400MTP zorgt voor een uniforme, niet-schadelijke biofilmdetachering en celdispersie voor robuuste testresultaten.

• Complexiteit van de biofilm: Biofilms zijn gestructureerde microbiële gemeenschappen ingekapseld in een extracellulaire polymere substantie (EPS) matrix, die de micro-organismen beschermt en ze resistenter maakt tegen antimicrobiële middelen.
• Uniforme verspreiding: Om de levensvatbaarheid van in een biofilm ingebedde cellen of hun gevoeligheid voor antimicrobiële stoffen nauwkeurig te meten, moet de biofilm eerst losgemaakt worden en uiteenvallen in een homogene suspensie.

Biofilm-gebaseerd Minimum Inhibitory Concentration Assay Protocol

De MIC-test (Minimum Inhibitory Concentration) bepaalt de laagste concentratie van een antimicrobiële stof die nodig is om de zichtbare groei van micro-organismen te remmen. Dit protocol is ontworpen voor biofilm-geassocieerde micro-organismen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de UIP400MTP multi-well plaat sonicator voor biofilmverstoring.

Stap 1: Bereiding van bacterieel inoculum

1. Bereid de bacteriesuspensie:
   Laat bacteriën in geschikte media groeien tot de mid-logaritmische fase.
   Verdun de kweek om een gestandaardiseerde celdichtheid te bereiken (bijvoorbeeld 0,5 McFarland-standaard of OD600 ~0,1).
2. Bereid antimicrobiële oplossingen:
   Verdun het antimicrobiële middel in een geschikt medium om een reeks concentraties te maken (bijvoorbeeld tweevoudige seriële verdunningen).
3. Doseer in de 96well-plaat:
   Voeg de antimicrobiële oplossingen toe aan de wells van een standaard 96-wells plaat, met een uiteindelijk wellvolume van ~150-200 µL.
   Neem groeicontroles (geen antimicrobiële) en steriliteitscontroles (geen bacterieel inoculum) op.

Stap 2: Biofilmvorming op het knijperdeksel

• Bevestig het deksel van de knijper:
  Plaats het deksel van de speciale pin op de geënte wells en zorg ervoor dat de pinnen volledig ondergedompeld zijn in de bacteriesuspensie.
• Incubeer de plaat:
  Incubeer bij de juiste temperatuur (bijv. 37°C) gedurende een bepaalde tijd (bijv. 24 uur) onder statische omstandigheden om biofilmvorming op de pinnen mogelijk te maken.

Stap 3: Blootstelling aan antimicrobiële stoffen

• Spoel de wasknijpers af:
  Verwijder het knijperdeksel van de bacteriesuspensie en spoel voorzichtig in steriele zoutoplossing of PBS om loszittende planktoncellen te verwijderen.
• Blootstelling aan antimicrobiële stoffen:
  Breng de pindeksel over in een nieuwe 96well-plaat die de eerder bereide antimicrobiële verdunningen bevat.
  Incubeer gedurende een bepaalde periode (bijv. 24 uur) onder statische omstandigheden zodat het antimicrobiële middel op de biofilms kan inwerken.

Stap 4: Sonificeren met de microplaat Sonicator UIP400MTP

De sonicatiestap is cruciaal om biofilms los te maken van de deksels van de haringen om de levensvatbaarheid te beoordelen. Volg deze stappen voor de UIP400MTP sonicator:

1. Bereid de opstelling voor:
   Vul een nieuwe 96-well plaat met medium voor herstel (bijvoorbeeld neutralisatiebouillon of steriel groeimedium) in elke well.
2. Breng de knijperdeksel over:
   Verwijder het deksel van de antimicrobiële behandelingsplaat.
   Spoel het deksel van de pin in steriele zoutoplossing of PBS om achtergebleven antimicrobiële middelen te verwijderen.
3. Plaats de plaat in de sonicator:
   Bevestig het deksel van de pin op de plaat met medium voor herstel.
   Plaats de plaat met medium voor herstel in de UIP400MTP sonicator en zorg ervoor dat de plaat gecentreerd en stabiel staat zoals beschreven in de handleiding.
4. Pas de sonicatieparameters aan:
   Stel de sonicatieparameters in op de UIP400MTP (instellingen kunnen worden aangepast aan de biofilm):
   Amplitude: 70-100%.
   Sonificatietijd: 1-3 minuten (aanpassen op basis van de structuur van de biofilm) in cyclusmodus.
5. Sonicate:
   Start het sonicatieproces. De ultrasone golven zullen de biofilmmatrix verstoren en de cellen in het herstelmedium losmaken.
6. Bewaak het proces:
   Gebruik de insteekbare temperatuursensor om de monstertemperatuur in de wells te controleren. De UIP400MTP kan aangesloten worden op een koelmachine voor koeling.
7. Post-sonatiebehandeling:
   Breng het medium met losgemaakte biofilms onmiddellijk over in een nieuwe steriele plaat voor verdere analyse.

(A) Plaat met TSB met 2% glucose gebruikt voor biofilmvorming, celherstel en bepaling van MIC en MBEC; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms.
De biofilmcellen die zich op de pinnen vormden, werden door middel van sonicatie (Hielscher Ultrasound Technology) gedurende 5 minuten losgemaakt in 96-wellsplaten met vers kweekmedium voor herstel van de cellen.
(Afbeelding en studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Stap 4: Levensvatbaarheidsbeoordeling

Plaat en kweek losgemaakte biofilms:

1. Voer seriële verdunningen van het recovery medium uit en plaats deze op agar om kolonievormende eenheden (CFU) te tellen.
2. MIC evalueren:
   Bepaal de MIC als de laagste antimicrobiële concentratie die de zichtbare microbiële groei in het herstelmedium volledig remt.

MIC Minimale remmende concentratie: Voorbeeld van microtiterplaat en interpretatie van microdilutieresultaten.
(Studie en afbeelding: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit Made in Germany

Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasone machines in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasone machines aangepakt.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

Lees hier hoe de UIP400MTP wordt gebruikt voor biofilmdetachering in het ASTM E2799 protocol. – Testen van de werkzaamheid van ontsmettingsmiddelen tegen de biofilm van Pseudomonas aeruginosa met behulp van de MBEC-test.