Protocol voor de bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC)

De biofilmgebaseerde bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC) is een essentiële methode om de effectiviteit van antimicrobiële middelen tegen biofilmgeassocieerde micro-organismen te beoordelen. Deze vertonen een verhoogde resistentie door hun beschermende extracellulaire matrix. Een cruciale stap in deze bepaling is het losmaken van biofilmstructuren om ingebedde cellen vrij te maken voor een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid. De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP vergemakkelijkt dit proces door gericht ultrageluid te gebruiken om gecontroleerde cavitatie te genereren, waardoor biofilmcellen efficiënt worden losgemaakt en in een uniforme suspensie worden gedispergeerd. Deze nauwkeurige en reproduceerbare verstoring van de biofilm verhoogt de betrouwbaarheid en doorvoer van MIC-bepalingen, waardoor de UIP400MTP een essentieel hulpmiddel is voor de vooruitgang van biofilmonderzoek.

Waarom zou ik sonicatie gebruiken tijdens MIC-bepalingen?

• Nauwkeurige, reproduceerbare gegevens: Verkrijg uniforme celsuspensies die afscherming door de matrix elimineren, zodat uw kolonietellingen en metingen van de optische dichtheid de effectiviteit van antimicrobiële middelen werkelijk weerspiegelen.
• Efficiëntie bij hoge doorvoer: Verwerk een volledige plaat met 96 wells tegelijkertijd in slechts 1–3 minuten en vervang langzaam, inconsistent handmatig schrapen door een gestroomlijnde workflow.
• Behoud van de levensvatbaarheid van cellen: Maak ingebedde cellen voorzichtig los zonder de fysieke schade die door schrapen wordt veroorzaakt, waardoor hogere overlevingspercentages behouden blijven voor betrouwbare MIC/MBEC-berekeningen.
• Geen risico op kruisbesmetting: Profiteer van een contactloos cup-horn-ontwerp dat alle wells uniform behandelt zonder dat sondes afzonderlijke monsters of wells aanraken.
• Naleving van normen: Stem uw methodologie af op gevalideerde industriële protocollen zoals ASTM E2799-22, waardoor uw gegevens geloofwaardiger worden voor regelgevings- of publicatiedoeleinden.
• Betrouwbare screening van geneesmiddelen en behandelingen: Vertrouw op uw gevoeligheidsresultaten om beter onderbouwde beslissingen te nemen over antimicrobiële werkzaamheid, resistentieprofilering of therapeutische ontwikkeling.

Sonicatie voor het losmaken van biofilms

De biofilmgebaseerde MIC-bepaling meet doorgaans de levensvatbaarheid van bacteriën of de remming van hun groei met methoden zoals uitplaten, kolonietelling of metingen van de optische dichtheid. Sonicatie is een cruciale stap bij biofilmgebaseerde MIC-bepalingen wanneer de antimicrobiële gevoeligheid van biofilmgeassocieerde micro-organismen wordt beoordeeld. De primaire functie ervan is het losmaken en dispergeren van cellen die in de biofilmmatrix zijn ingebed tot een uniforme suspensie voor nauwkeurige analyse.
Biofilms zijn aanzienlijk resistenter tegen antimicrobiële middelen dan planktonische cellen, waardoor een goede losmaking cruciaal is voor nauwkeurige analyse. Tijdens dit proces genereren ultrasone golven gecontroleerde cavitatie, waardoor de biofilmmatrix uiteenvalt en ingebedde cellen vrijkomen in een uniforme suspensie in het herstelmedium. Deze stap maakt nauwkeurige beoordelingen van de levensvatbaarheid van uit de biofilm gedispergeerde cellen mogelijk met methoden zoals uitplaten, verdunnen en kolonietelling. Een goede verstoring van de biofilm door sonicatie voorkomt dat resterende matrixcomponenten de cellen afschermen, wat anders tot een onderschatting van de antimicrobiële activiteit zou kunnen leiden. De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP is hiervoor bijzonder geschikt en biedt nauwkeurige en reproduceerbare sonicatieomstandigheden om een betrouwbare voorbereiding van assayplaten met hoge doorvoer te garanderen.

Waarom sonicatie noodzakelijk is bij biofilmgebaseerde bepalingen van de minimale inhiberende concentratie

Voor metingen van de levensvatbaarheid en celtellingen is een volledige en betrouwbare losmaking en dispersie van afzonderlijke cellen vereist. De UIP400MTP bevordert een uniforme losmaking van biofilms en dispersie van cellen zonder beschadiging, voor robuuste assayresultaten.

• Complexiteit van biofilms: Biofilms zijn gestructureerde microbiële gemeenschappen die zijn omhuld door een matrix van extracellulaire polymere stoffen (EPS), die de micro-organismen beschermt en hen resistenter maakt tegen antimicrobiële middelen.
• Uniforme dispersie: Om de levensvatbaarheid van in een biofilm ingebedde cellen of hun gevoeligheid voor antimicrobiële middelen nauwkeurig te meten, moet de biofilm eerst worden losgemaakt en uiteengehaald tot een homogene suspensie.

Protocol voor de biofilmgebaseerde bepaling van de minimale inhiberende concentratie

De bepaling van de minimale inhiberende concentratie (MIC) bepaalt de laagste concentratie van een antimicrobieel middel die nodig is om de zichtbare groei van micro-organismen te remmen. Dit protocol is ontworpen voor biofilmgeassocieerde micro-organismen en gebruikt de sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP om biofilms te verstoren.

Stap 1: Voorbereiding van het bacteriële inoculum

1. Bereid de bacteriesuspensie voor:
   Kweek bacteriën in geschikte media tot de midden-logaritmische fase.
   Verdun de cultuur om een gestandaardiseerde celdichtheid te bereiken (bijv. de 0,5 McFarland-standaard of OD600 ~0,1).
2. Bereid antimicrobiële oplossingen voor:
   Verdun het antimicrobiële middel in een geschikt medium om een reeks concentraties te maken (bijv. tweevoudige seriële verdunningen).
3. Verdeel over de plaat met 96 wells:
   Voeg de antimicrobiële oplossingen toe aan de wells van een standaardplaat met 96 wells, met een eindvolume per well van ~150–200 µL.
   Neem groeicontroles (zonder antimicrobieel middel) en steriliteitscontroles (zonder bacterieel inoculum) op.

Stap 2: Biofilmvorming op een deksel met pinnen

• Breng het deksel met pinnen aan:
  Plaats het speciale deksel met pinnen op de geïnoculeerde wells en zorg ervoor dat de pinnen volledig zijn ondergedompeld in de bacteriesuspensie.
• Incubeer de plaat:
  Incubeer bij de geschikte temperatuur (bijv. 37°C) gedurende een vastgestelde tijd (bijv. 24 uur) onder statische omstandigheden om biofilmvorming op de pinnen mogelijk te maken.

Stap 3: Blootstelling aan antimicrobiële middelen

• Spoel de pinnen:
  Verwijder het deksel met pinnen uit de bacteriesuspensie en spoel het voorzichtig in steriele zoutoplossing of PBS om los gehechte planktonische cellen te verwijderen.
• Stel bloot aan antimicrobiële middelen:
  Breng het deksel met pinnen over naar een nieuwe plaat met 96 wells die de eerder bereide antimicrobiële verdunningen bevat.
  Incubeer gedurende een vastgestelde periode (bijv. 24 uur) onder statische omstandigheden zodat het antimicrobiële middel op de biofilms kan inwerken.

Stap 4: Sonicatie met de sonicator voor microplaten UIP400MTP

De sonicatiestap is cruciaal om biofilms van de deksels met pinnen los te maken voor de beoordeling van de levensvatbaarheid. Volg deze stappen voor de sonicator UIP400MTP:

1. Bereid de opstelling voor:
   Vul elke well van een nieuwe plaat met 96 wells met herstelmedium (bijv. neutraliserende bouillon of steriel groeimedium).
2. Breng het deksel met pinnen over:
   Verwijder het deksel met pinnen van de plaat voor antimicrobiële behandeling.
   Spoel het deksel met pinnen in steriele zoutoplossing of PBS om resterende antimicrobiële middelen te verwijderen.
3. Plaats de plaat in de sonicator:
   Breng het deksel met pinnen aan op de plaat met herstelmedium.
   Plaats de plaat met herstelmedium in de sonicator UIP400MTP en zorg ervoor dat de plaat gecentreerd en stabiel staat, zoals beschreven in de handleiding.
4. Stel de sonicatieparameters in:
   Stel de sonicatieparameters op de UIP400MTP in (de instellingen kunnen aan de biofilm worden aangepast):
   Amplitude: 70–100%.
   Sonocatieduur: 1–3 minuten (aanpassen op basis van de biofilmstructuur) in cyclische modus.
5. Voer sonicatie uit:
   Start het sonicatieproces. De ultrasone golven zullen de biofilmmatrix verstoren en de cellen losmaken in het herstelmedium.
6. Bewaak het proces:
   Gebruik de aansluitbare temperatuursensor om de monstertemperatuur in de wells te bewaken. De UIP400MTP kan voor koeling worden aangesloten op een laboratoriumkoeler.
7. Verwerking na sonicatie:
   Breng het herstelmedium met de losgemaakte biofilms onmiddellijk over naar een nieuwe steriele plaat voor verdere analyse.

(A) Plaat met TSB met 2% glucose, gebruikt voor biofilmvorming, het terugwinnen van cellen en de bepaling van MIC en MBEC; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms.
De op de pinnen gevormde biofilmcellen werden door sonicatie (Hielscher Ultrasound Technology) gedurende 5 min losgemaakt in platen met 96 wells die vers kweekmedium bevatten voor het terugwinnen van de cellen.
(Afbeelding en onderzoek: ©de Oliveira et al., 2016)

Stap 4: Beoordeling van de levensvatbaarheid

Plaat de losgemaakte biofilms uit en kweek ze:

1. Voer seriële verdunningen van het herstelmedium uit en plaat uit op agar om kolonievormende eenheden (CFU) te tellen.
2. Beoordeel de MIC:
   Bepaal de MIC als de laagste antimicrobiële concentratie die zichtbare microbiële groei in het herstelmedium volledig remt.

MIC – minimale inhiberende concentratie: voorbeeld van een microtiterplaat en interpretatie van microverdunningsresultaten.
(Onderzoek en afbeelding: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Wie profiteert van sonicatie tijdens MIC-bepalingen?

• Fabrikanten van medische hulpmiddelen: Om de werkzaamheid van oppervlaktecoatings te testen en reinigingsprotocollen te valideren voor hulpmiddelen die vatbaar zijn voor biofilmvorming.
• Klinisch microbiologen: Om implantaatgeassocieerde infecties (zoals PJI) nauwkeurig te diagnosticeren door bacteriën van medische implantaten en andere medische onderdelen terug te winnen.
• Farmaceutische ontwikkelaars: Om de effectiviteit van nieuwe antimicrobiële middelen tegen weerbare, in biofilms ingebedde pathogenen te beoordelen.
• Academische onderzoekers: Om reproduceerbaar onderzoek met hoge doorvoer uit te voeren naar biofilmbiologie en mechanismen van antimicrobiële resistentie.
• Industriële kwaliteitscontroleteams: Om biologische aangroei en de werkzaamheid van desinfectiemiddelen in industriële omgevingen te beoordelen (bijv. met behulp van ASTM E2799-22-normen).

Ontwerp, productie en advies – kwaliteit uit Duitsland

De ultrasoonapparaten van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening maken een soepele integratie van onze ultrasoonapparaten in industriële installaties mogelijk. De sonicators van Hielscher kunnen ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen gemakkelijk aan.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op ultrasoonapparaten met hoge prestaties met de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen de ultrasoonapparaten van Hielscher aan de CE-normen en aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

Lees hier hoe de UIP400MTP wordt gebruikt voor het losmaken van biofilms in het ASTM E2799-protocol – het testen van de werkzaamheid van desinfectiemiddelen tegen biofilms van Pseudomonas aeruginosa met de MBEC-assay.