ASTM E2799-22-protocol voor antimicrobiële evaluatie

De Hielscher UIP400MTP is een krachtige en efficiënte sonicator voor multiwellplaten, ontworpen om de sonicatiestap in het ASTM E2799-22-protocol te stroomlijnen. Door gelijkmatige ultrasone energie over de volledige microtiterplaat te leveren, zorgt de UIP400MTP voor een consistente en betrouwbare losmaking van biofilms van deksels met pinnen, zonder de cellen te beschadigen of de integriteit van de monsters aan te tasten. De hoge verwerkingscapaciteit en gebruiksvriendelijke bediening verkorten de verwerkingstijd aanzienlijk en verbeteren tegelijkertijd de reproduceerbaarheid. Dit maakt het apparaat een ideale oplossing voor laboratoria die assays voor biofilmviabiliteit en tests van antimicrobiële werkzaamheid uitvoeren.

ASTM E2799

ASTM E2799 is een gestandaardiseerde testmethode voor het evalueren van de werkzaamheid van antimicrobiële middelen tegen biofilms, met specifieke aandacht voor Pseudomonas aeruginosa. Biofilms zijn complexe microbiële gemeenschappen die zich aan oppervlakken hechten en een verhoogde resistentie tegen antimicrobiële behandelingen vertonen. Daardoor vormen ze een aanzienlijke uitdaging in de gezondheidszorg, de industrie en milieucontexten. Deze methode gebruikt de assay voor de minimale biofilmeradicatieconcentratie (MBEC) om een betrouwbaar en reproduceerbaar kader te bieden voor het testen van desinfectiemiddelen onder realistische biofilmomstandigheden.

Hoe draagt sonicatie bij aan ASTM E2799?

Sonicatie speelt een cruciale rol in het ASTM E2799-protocol door het losmaken van biofilms van testoppervlakken te vergemakkelijken, waardoor de microbiële viabiliteit na behandeling nauwkeurig kan worden beoordeeld. Door gecontroleerde ultrasone energie te gebruiken, zorgt het protocol voor een efficiënte en consistente verstoring van de biofilm zonder de cellen te beschadigen, wat nauwkeurige en reproduceerbare resultaten mogelijk maakt. Dit maakt ASTM E2799 tot een essentieel hulpmiddel voor het bevorderen van biofilmonderzoek en het ontwikkelen van effectieve antimicrobiële strategieën.

De MBEC-assay uitvoeren volgens ASTM E2799-22

Het protocol ASTM E2799-22 beschrijft de stappen voor het evalueren van de werkzaamheid van antimicrobiële middelen tegen biofilms. Bij gebruik van de sonicator Hielscher UIP400MTP voor microtiterplaten kan het protocol worden aangepast om deze geavanceerde sonicatiemethode voor het losmaken van biofilms op te nemen. Hieronder worden de stappen beschreven, afgestemd op het gebruik van de sonicator UIP400MTP voor microplaten:

1. Voorbereiding van biofilms
   Bereid een steriele microtiterplaat met 96 wells en afneembare deksels met pinnen voor.
   Inoculeer de wells met een gestandaardiseerde bacteriesuspensie in een geschikt groeimedium.
   Plaats het deksel met pinnen op de plaat en zorg ervoor dat de pinnen volledig in de bacteriesuspensie zijn ondergedompeld.
   Incubeer de plaat onder gecontroleerde omstandigheden (bijvoorbeeld temperatuur en tijd) om biofilmvorming op de pinnen mogelijk te maken.
2. Behandeling met antimicrobiële middelen
   Vervang na de biofilmvorming het medium door vers medium dat de te testen antimicrobiële middelen in verschillende concentraties bevat.
   Plaats het deksel met pinnen terug en incubeer onder de omstandigheden die in de testopzet zijn gespecificeerd.
3. Voorbereiding op het losmaken van biofilms
   Spoel na de behandeling het deksel met pinnen door het onder te dompelen in een steriele spoeloplossing om resterende antimicrobiële middelen en los aangehechte planktonische cellen te verwijderen.
4. Biofilms losmaken met de sonicator UIP400MTP
   Bereid een nieuwe microtiterplaat met 96 wells voor die een herstelmedium bevat (bijvoorbeeld neutraliserende bouillon).
   Maak de biofilms los door het deksel met pinnen in de wells van de plaat met herstelmedium te plaatsen.
   Plaats de plaat in de sonicator UIP400MTP en zorg ervoor dat het deksel en de plaat correct zijn uitgelijnd.
   Stel de sonicator in op 70%–80% amplitude en soniceer gedurende 3–4 minuten in cyclische modus om een consistente losmaking van biofilms zonder cellysis te waarborgen.
5. Beoordeling van de biofilmviabiliteit
   Verwerk na de sonicatie het herstelmedium met de losgemaakte biofilmcellen met behulp van standaard microbiologische of analytische technieken, zoals:
   • Tellingen van kolonievormende eenheden (CFU): Voer seriële verdunningen uit en plaat uit op agar om levensvatbare cellen te tellen.
   • Metingen van de optische dichtheid (OD): Gebruik spectrofotometrische analyse om de celdichtheid te beoordelen.
   • Viabiliteitsassays op basis van fluorescentie: Kwantificeer levende en dode cellen met fluorescerende kleurstoffen.
6. Gegevensanalyse
   Vergelijk de viabiliteitsgegevens van behandelde en onbehandelde biofilms om de werkzaamheid van de antimicrobiële middelen te bepalen.
   Bereken de minimale biofilmeradicatieconcentratie (MBEC) op basis van de concentratie die nodig is om levensvatbare biofilmcellen te elimineren.
7. Kwaliteitscontrole
   Zorg voor consistente sonicatieomstandigheden door de UIP400MTP regelmatig te kalibreren en te controleren of het proces voor het losmaken van biofilms niet leidt tot significante cellysis of celvernietiging.
   Neem geschikte controles op, zoals onbehandelde biofilms en blanco’s met uitsluitend medium, om de resultaten te valideren.

De biofilmcellen die zich op de pinnen hadden gevormd, werden losgemaakt door sonicatie (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland, UIP250MTP) gedurende 5 min in platen met 96 wells die vers kweekmedium bevatten voor het herstel van de cellen.
(Afbeelding en studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Door de UIP400MTP in de ASTM E2799-22-workflow te integreren, wordt het proces voor het losmaken van biofilms geoptimaliseerd voor consistentie, efficiëntie en toepassingen met hoge verwerkingscapaciteit.