MBEC Assay-protocol met de 96-well Plate Sonicator UIP400MTP

De MBEC-test wordt gebruikt om de concentratie antimicrobiële stoffen te bepalen die nodig is om biofilms te elimineren die gevormd zijn op ping deksels. Om de levensvatbaarheid van de biofilm te bepalen, moeten de biofilms eerst worden losgemaakt van de knijperdeksels van een 96-wells-plaat. Sonificatie is de meest betrouwbare en efficiënte methode om dit los te maken. De multi-well plaat sonicator UIP400MTP is speciaal ontworpen om assayplaten met maximale efficiëntie en gemak te bewerken, waardoor high-throughput MBEC assays gestroomlijnd en versneld kunnen worden.

Sonificatie voor biofilmonthechting

Sonificatie is een cruciale stap in MBEC-tests (Minimum Biofilm Eradication Concentration) om biofilmcellen effectief los te maken van hun aanhechting aan het oppervlak. Biofilms zijn inherent gestructureerde gemeenschappen van micro-organismen ingekapseld in een extracellulaire matrix, waardoor ze aanzienlijk resistenter zijn tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met planktoncellen. Tijdens MBEC-tests maakt sonicatie gebruik van ultrasone golven om gecontroleerde cavitatie te genereren, waardoor de biofilmmatrix wordt verstoord en de ingebedde cellen vrijkomen in een suspensie. Deze stap zorgt ervoor dat de biofilmcellen gelijkmatig worden verspreid in het herstelmedium, waardoor de levensvatbaarheid nauwkeurig kan worden beoordeeld door uitplating, verdunning of spectrofotometrische methoden. Als de biofilm niet goed wordt losgemaakt, kunnen achtergebleven matrixcomponenten de cellen afschermen, waardoor de antimicrobiële werkzaamheid wordt onderschat. Daarom is sonicatie onmisbaar voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare MBEC-waarden die het werkelijke uitroeiingspotentieel van de geteste middelen weergeven. De multi-well plaat sonicator UIP400MTP maakt een eenvoudige high-throughput monstervoorbereiding in testplaten mogelijk.

Minimum Biofilm Uitroeiing Concentratie (MBEC) Assay Protocol

Stap 1: Biofilmvorming

1. Bereid de bacteriesuspensie:
   Laat bacteriën in geschikte media groeien tot de logfase.
   Verdun de bacteriecultuur tot een bepaalde optische dichtheid (bijvoorbeeld OD600 ~0,1).
2. Inoculeer de 96-wells plaat:
   Voeg de bacteriesuspensie (bijvoorbeeld 150-200 µL) toe aan elk putje van een standaard 96-wells microtiterplaat.
3. Bevestig het deksel van de knijper:
   Plaats het deksel van de knijper op de geënte plaat om biofilmvorming op de knijperoppervlakken mogelijk te maken.
4. Incubeer de plaat:
   Incubeer de opstelling bij een geschikte temperatuur (bijv. 37°C) gedurende 24-48 uur zonder te schudden om biofilmgroei te bevorderen.

Stap 2: Behandeling met antimicrobiële middelen

• Bereid antimicrobiële oplossingen:
  Bereid een reeks antimicrobiële concentraties in verse media.
  Biofilms blootstellen aan antimicrobiële middelen:
  Verwijder het knijperdeksel van de bacteriekweek en spoel deze in steriele zoutoplossing of PBS om planktoncellen te verwijderen.
  Plaats het knijperdeksel in een nieuwe 96-wells plaat met de antimicrobiële oplossingen.
• Incubeer de plaat:
  Incubeer gedurende een bepaalde periode (bijv. 24 uur) om blootstelling aan antimicrobiële stoffen mogelijk te maken.

Stap 3: Sonificeren met de 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP

De sonicatiestap is cruciaal om biofilms los te maken van de deksels van de haringen om de levensvatbaarheid te beoordelen. Volg deze stappen voor de UIP400MTP sonicator:

1. Bereid de opstelling voor:
   Vul een nieuwe 96-wells plaat met medium voor herstel (bijvoorbeeld neutralisatiebouillon of vers groeimedium) in elke well.
2. Breng de knijperdeksel over:
   Verwijder het deksel van de antimicrobiële behandelingsplaat.
   Spoel het deksel van de pin in steriele zoutoplossing of PBS om achtergebleven antimicrobiële middelen te verwijderen.
3. Plaats de plaat en de sonicator:
   Bevestig het deksel van de pin op de plaat met medium voor herstel.
   Plaats de plaat met medium voor herstel op het UIP400MTP sonicatorplatform en zorg ervoor dat de plaat gecentreerd en stabiel is.
4. Pas de sonicatieparameters aan:
   Stel de sonicatieparameters in op de UIP400MTP (Instellingen kunnen worden aangepast aan de biofilm):
   Amplitude: 70-100%.
   Sonificatietijd: 1-3 minuten (aanpassen op basis van de robuustheid van de biofilm) in cyclusmodus.
5. Sonicate:
   Start het sonicatieproces. De ultrasone trilling zal de biofilms van de pinoppervlakken in het recuperatiemedium doen terechtkomen.
6. Bewaak het proces:
   Gebruik de insteekbare temperatuursensor om de monstertemperatuur in de wells te controleren. De UIP400MTP kan aangesloten worden op een koelmachine voor koeling.
7. Post-sonatiebehandeling:
   Breng het recuperatiemedium (dat nu losgemaakte biofilms bevat) onmiddellijk over in een nieuwe steriele plaat voor downstream analyse.

(A) Plaat met TSB met 2% glucose gebruikt voor biofilmvorming, celherstel en
bepaling van MIC en MBCB; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms. bepaling van MIC en MBCB; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms.
De biofilmcellen die zich op de pinnen vormden, werden door middel van sonicatie (Hielscher Ultrasound Technology) gedurende 5 minuten losgemaakt in 96-wellsplaten met vers kweekmedium voor herstel van de cellen.
(Afbeelding en studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Stap 4: Levensvatbaarheidsbeoordeling

Plaat en kweek losgemaakte biofilms:

1. Voer seriële verdunningen van het recovery medium uit en plaats deze op agar om kolonievormende eenheden (CFU) te tellen.
   Als alternatief kan een colorimetrische of op fluorescentie gebaseerde levensvatbaarheidstest gebruikt worden.
2. Recordresultaten:
   Bepaal de MBEC als de laagste concentratie antimicrobiële stof die aantoonbare levensvatbaarheid van de biofilm uitroeide.

Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit Made in Germany

Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasone machines in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasone machines aangepakt.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

Lees hier hoe de UIP400MTP wordt gebruikt voor het losmaken van biofilm als een monstervoorbereidingsstap tijdens het ASTM E2799 protocol voor het testen van de werkzaamheid van ontsmettingsmiddelen tegen Pseudomonas aeruginosa biofilm met behulp van de MBEC assay.