Protocol voor de MBEC-assay met de sonicator UIP400MTP voor platen met 96 wells

De MBEC-assay wordt gebruikt om de concentratie antimicrobiële middelen te bepalen die nodig is om biofilms te elimineren die op deksels met pinnen zijn gevormd. Om de levensvatbaarheid van biofilms te beoordelen, moeten de biofilms eerst worden losgemaakt van de deksels met pinnen van een plaat met 96 wells. Sonicatie is de betrouwbaarste en efficiëntste methode voor dit losmaken. De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten is specifiek ontworpen om assayplaten met maximale efficiëntie en gebruiksgemak te verwerken, waardoor MBEC-assays met een hoge verwerkingscapaciteit worden gestroomlijnd en versneld.

Sonicatie voor het losmaken van biofilms

Sonicatie is een cruciale stap in assays voor de minimale biofilmeradicatieconcentratie (MBEC), waarmee biofilmcellen effectief kunnen worden losgemaakt van het oppervlak waaraan ze gehecht zijn. Biofilms zijn van nature gestructureerde gemeenschappen van micro-organismen die zijn omgeven door een extracellulaire matrix, waardoor ze aanzienlijk resistenter zijn tegen antimicrobiële middelen dan planktonische cellen. Tijdens MBEC-assays worden bij sonicatie ultrasone golven gebruikt om gecontroleerde cavitatie op te wekken, waardoor de biofilmmatrix wordt verstoord en de daarin ingebedde cellen in een suspensie vrijkomen. Deze stap zorgt ervoor dat de biofilmcellen gelijkmatig worden gedispergeerd in het herstelmedium, wat nauwkeurige beoordelingen van de levensvatbaarheid door uitplaten, verdunnen of spectrofotometrische methoden mogelijk maakt. Als biofilms niet goed worden losgemaakt, kunnen resterende matrixcomponenten cellen afschermen, wat tot onderschatting van de werkzaamheid van antimicrobiële middelen kan leiden. Sonicatie is daarom onmisbaar voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare MBEC-waarden die het werkelijke eradicatiepotentieel van de geteste middelen weerspiegelen. De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten maakt eenvoudige monstervoorbereiding met een hoge verwerkingscapaciteit in assayplaten mogelijk.

Protocol voor de assay voor de minimale biofilmeradicatieconcentratie (MBEC)

Stap 1: Biofilmvorming

1. Bereid de bacteriesuspensie voor:
   Kweek bacteriën in geschikte media tot de logaritmische groeifase.
   Verdun de bacteriecultuur tot een vastgestelde optische dichtheid (bijv. OD600 ~0,1).
2. Inoculeer de plaat met 96 wells:
   Voeg de bacteriesuspensie (bijv. 150–200 µL) toe aan elke well van een standaardmicrotiterplaat met 96 wells.
3. Bevestig het deksel met pinnen:
   Plaats het deksel met pinnen op de geïnoculeerde plaat om biofilmvorming op de oppervlakken van de pinnen mogelijk te maken.
4. Incubeer de plaat:
   Incubeer de opstelling gedurende 24–48 uur bij een geschikte temperatuur (bijv. 37°C) zonder te schudden om de groei van biofilms te bevorderen.

Stap 2: Behandeling met antimicrobiële middelen

• Bereid antimicrobiële oplossingen voor:
  Bereid in verse media een reeks concentraties van antimicrobiële middelen voor.
  Stel biofilms bloot aan antimicrobiële middelen:
  Verwijder het deksel met pinnen uit de bacteriecultuur en spoel het in steriele zoutoplossing of PBS om planktonische cellen te verwijderen.
  Plaats het deksel met pinnen in een nieuwe plaat met 96 wells die de antimicrobiële oplossingen bevat.
• Incubeer de plaat:
  Incubeer gedurende een vastgestelde periode (bijv. 24 uur) om blootstelling aan de antimicrobiële middelen mogelijk te maken.

Stap 3: Sonicatie met de sonicator UIP400MTP voor platen met 96 wells

De sonicatiestap is cruciaal om biofilms van de deksels met pinnen los te maken voor beoordeling van de levensvatbaarheid. Volg deze stappen voor de sonicator UIP400MTP:

1. Bereid de opstelling voor:
   Vul elke well van een nieuwe plaat met 96 wells met herstelmedium (bijv. neutraliserende bouillon of vers groeimedium).
2. Breng het deksel met pinnen over:
   Verwijder het deksel met pinnen uit de plaat voor antimicrobiële behandeling.
   Spoel het deksel met pinnen in steriele zoutoplossing of PBS om resterende antimicrobiële middelen te verwijderen.
3. Positioneer de plaat en de sonicator:
   Bevestig het deksel met pinnen op de plaat met herstelmedium.
   Plaats de plaat met herstelmedium op het platform van de sonicator UIP400MTP en zorg ervoor dat de plaat gecentreerd en stabiel staat.
4. Pas de sonicatieparameters aan:
   Stel de sonicatieparameters op de UIP400MTP in (de instellingen kunnen op de biofilm worden afgestemd):
   Amplitude: 70–100%.
   Sonicatietijd: 1–3 minuten (aanpassen op basis van de robuustheid van de biofilm) in cyclusmodus.
5. Voer sonicatie uit:
   Start het sonicatieproces. De ultrasone trilling maakt de biofilms los van de oppervlakken van de pinnen, waarna ze in het herstelmedium terechtkomen.
6. Bewaak het proces:
   Gebruik de aansluitbare temperatuursensor om de temperatuur van de monsters in de wells te bewaken. De UIP400MTP kan voor koeling worden aangesloten op een laboratoriumkoeler.
7. Verwerking na sonicatie:
   Breng het herstelmedium (dat nu losgemaakte biofilms bevat) onmiddellijk over naar een nieuwe steriele plaat voor verdere analyse.

(A) Plaat met TSB met 2% glucose, gebruikt voor biofilmvorming, het terugwinnen van cellen en
bepaling van MIC en MBCB; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms. bepaling van MIC en MBCB; (B) Deksel met pinnen voor de vorming van stafylokokkenbiofilms.
De biofilmcellen die op de pinnen waren gevormd, werden losgemaakt door sonicatie (Hielscher Ultrasound Technology) gedurende 5 min in platen met 96 wells met vers kweekmedium voor het terugwinnen van de cellen.
(Afbeelding en studie: ©de Oliveira et al., 2016)

Stap 4: Beoordeling van de levensvatbaarheid

Plaat de losgemaakte biofilms uit en kweek ze:

1. Voer seriële verdunningen van het herstelmedium uit en plaat deze uit op agar om kolonievormende eenheden (CFU) te tellen.
   Gebruik als alternatief een colorimetrische of op fluorescentie gebaseerde levensvatbaarheidsassay.
2. Leg de resultaten vast:
   Bepaal de MBEC als de laagste concentratie van het antimicrobiële middel die de aantoonbare levensvatbaarheid van de biofilm heeft geëlimineerd.

Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit uit Duitsland

De ultrasone apparaten van Hielscher staan bekend om hun kwaliteits- en ontwerpnormen van het hoogste niveau. Robuustheid en eenvoudige bediening maken een soepele integratie van onze ultrasone apparaten in industriële installaties mogelijk. De sonicators van Hielscher kunnen zware omstandigheden en veeleisende omgevingen gemakkelijk aan.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op ultrasone apparaten met hoge prestaties, de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen de ultrasone apparaten van Hielscher aan de CE-eisen en aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

Lees hier hoe de UIP400MTP wordt gebruikt om biofilms los te maken als stap in de monstervoorbereiding tijdens het ASTM E2799-protocol voor het testen van de werkzaamheid van desinfectiemiddelen tegen biofilm van Pseudomonas aeruginosa met behulp van de MBEC-assay.