Protocol voor het kweken en losmaken van biofilms van Staphylococcus

Gestandaardiseerde methoden zijn essentieel voor betrouwbare onderzoeksresultaten. Hier vindt u een protocol voor het kweken en losmaken van biofilms van stafylokokken. Dit protocol richt zich op gestroomlijnde monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit met behulp van de sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP, om biofilms efficiënt en met hoge verwerkingscapaciteit los te maken in 96-wellplaten. Het protocol bevat ook belangrijke stappen voor het kweken, wassen en visualiseren van biofilms, met de nadruk op het minimaliseren van variabiliteit en het waarborgen van reproduceerbaarheid.

Onderzoek naar biofilms van Staphylococcus en antibiotica

Biofilms van Staphylococcus spelen een cruciale rol bij aanhoudende infecties doordat ze bestand zijn tegen antibiotica en immuunreacties. Biofilmvorming biedt bacteriën een beschermende omgeving, waardoor infecties moeilijk te behandelen zijn. Onderzoek naar biofilms richt zich vaak op het begrijpen van hun vorming, gedrag en gevoeligheid voor antimicrobiële middelen, met de nadruk op methoden met hoge verwerkingscapaciteit om experimentele werkprocessen te stroomlijnen.
De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP biedt een aanzienlijk voordeel bij biofilmonderzoek doordat biofilms snel en efficiënt van 96-wellplaten kunnen worden losgemaakt. Dit apparaat levert uniforme ultrasone energie aan alle wells, waardoor consistente resultaten worden gewaarborgd en de variabiliteit wordt geminimaliseerd.

Protocol voor het kweken en losmaken van biofilms van Staphylococcus

Hieronder begeleiden we u met stapsgewijze instructies bij het kweken en losmaken van een biofilm van Staphylococcus. Als voorbeeld van een analytische stap laten we zien hoe u de gekweekte biomassa spectrofotometrisch kunt kwantificeren met behulp van kristalvioletkleuring.

Kweken van biofilms van Staphylococcus

Benodigde materialen:

• Steriele 96-wellmicrotiterplaten van polystyreen met een vlakke bodem en deksels, behandeld voor weefselkweek
• Tryptische sojabouillon (TSB) met 0,25% glucose
• Biologische veiligheidskast

Stappen:

1. Bereid een steriele werkomgeving in een biologische veiligheidskast voor om contaminatie te minimaliseren.
2. Voeg TSB met 0,25% glucose toe aan de wells van de microtiterplaat. TSB zonder glucose ondersteunt doorgaans geen biofilmvorming en mag alleen indien nodig als controle worden gebruikt.
3. Ent de wells met bacteriestammen die zijn voorbereid zoals hieronder beschreven:
4. Bereid bacteriële suspensies en zorg ervoor dat er geen reeds aanwezige celclusters zijn door de suspensies met sonicatie te homogeniseren of door clusters met een 23-gaugenaald en kort vortexen uiteen te halen.
5. Sluit de plaat af met het deksel en incubeer onder optimale omstandigheden voor biofilmvorming (bijv. 37°C gedurende 24 uur).
6. Voer het experiment voor elke bacteriestam in drievoud uit (drie wells per stam) om de betrouwbaarheid te waarborgen.
7. Reserveer zes wells per plaat voor negatieve controles. Per 96-wellplaat kunnen maximaal 30 stammen worden getest.

Visualiseren en wassen van biofilms

1. Verwijder na de incubatie het medium voorzichtig om de biofilm niet te verstoren.
2. Was elke well viermaal met fysiologische zoutoplossing om planktonische bacteriën te verwijderen.
3. Inspecteer de bodem van de wells op witte plekken die op de aanwezigheid van biofilm wijzen.

Losmaken van biofilms met de sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP

Apparaatconfiguratie en parameters:

• Sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP
• Bedrijfsinstellingen: 60% amplitude, cyclische modus met 60 seconden AAN / 30 seconden UIT

Stappen:

1. Plaats de gewassen microtiterplaat op het platform van de UIP400MTP.
2. Soniceer de monsters met de aanbevolen instellingen (60% amplitude, 60 seconden AAN, 30 seconden UIT). Stem de instellingen af op de bacteriestam.
3. Start het sonicatieproces om de biofilm los te maken. De ultrasone golven breken de biofilmmatrix open, waardoor de aangehechte bacteriën vrijkomen.
4. De UIP400MTP zorgt voor een uniforme blootstelling in alle wells, zodat consistente resultaten bij het losmaken worden verkregen.

Analytische stap: kwantificering van de biomassa van losgemaakte biofilms van Staphylococcus met kristalviolet (CV)

Benodigde materialen:

• 0,1% kristalvioletoplossing (CV)
• 95% ethanol of 30% azijnzuur (voor solubilisatie)
• Microplaatlezer die bij 570 nm kan meten
• Steriele microtiterplaten voor kleuring

Stappen:

1. Voorbereiding van de kleuringsplaat: breng 100 µL van de suspensie van losgemaakte biofilm uit elke well van de gesoniceerde plaat over naar de overeenkomstige wells van een schone, steriele 96-wellmicrotiterplaat. Dit zorgt voor een schone en uniforme omgeving voor de kleuring.
2. Kleuring van de losgemaakte biofilm: voeg 150 µL 0,1% kristalvioletoplossing toe aan elke well die de suspensie van losgemaakte biofilm bevat. Pipetteer voorzichtig om de biofilmsuspensie en het kristalviolet gelijkmatig te mengen.
3. Incubatie: laat de plaat 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen, zodat het kristalviolet de biomassa effectief kan kleuren.
4. Wassen: verwijder na de incubatie de kristalvioletoplossing voorzichtig uit de wells zonder de biomassa te verstoren. Was elke well driemaal met steriele fysiologische zoutoplossing om ongebonden kleurstof te verwijderen.
5. Drogen: laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of onder een kap met steriele luchtstroom. Vermijd verwarming, aangezien dit de resultaten kan veranderen.
6. Solubilisatie: voeg 200 µL 95% ethanol (of 30% azijnzuur, afhankelijk van de standaardlaboratoriumpraktijken) toe aan elke well om het gebonden kristalviolet te solubiliseren. Meng voorzichtig door te pipetteren of door de plaat 10 minuten bij kamertemperatuur te schudden.
7. Meting: meet de optische dichtheid (OD) van de gesolubiliseerde kristalvioletoplossing bij 570 nm met een microplaatlezer.
8. Gegevensanalyse: trek de gemiddelde OD570-waarde van de negatieve controles (wells met TSB maar zonder bacterieel inoculum) af van de waarden van de experimentele wells om voor achtergrondkleuring te corrigeren. Registreer en analyseer de gegevens.

Opmerking: voer het experiment voor elke conditie in drievoud uit om de reproduceerbaarheid te waarborgen. Zorg voor een correcte omgang met kristalviolet en ethanol en volg de veiligheids- en afvalverwijderingsprotocollen.
 

De belangrijkste voordelen van de UIP400MTP in één oogopslag:

• Verwerking met hoge verwerkingscapaciteit: Speciaal ontworpen voor multiwellplaten, waardoor u meerdere monsters gelijktijdig kunt verwerken.
• Uniforme verdeling van ultrasone energie: Zorgt voor een gelijke ultrasone intensiteit in alle wells, waardoor alle monsters consistente resultaten opleveren.
• Gebruik elke standaardplaat: De UIP400MTP kan alle standaardmultiwellplaten, petrischalen en buisrekken verwerken. Er zijn geen dure fabrikantspecifieke platen nodig!
• Gebruiksvriendelijke interface: Eenvoudig in te stellen en te bedienen, waardoor het een uitstekend hulpmiddel is om de productiviteit van het laboratorium te verhogen. Programmeerbare instellingen en automatisering vergemakkelijken processtandaardisatie!