Staphylococcus biofilm kweek- en losmaakprotocol

Gestandaardiseerde methoden zijn essentieel voor betrouwbare onderzoeksresultaten. Hier vindt u een kweek- en onthechtingsprotocol voor stafylokokkenbiofilms. Dit protocol richt zich op gestroomlijnde monstervoorbereiding met hoge doorvoer met behulp van de UIP400MTP sonicator voor meerdere platen voor efficiënte, hoge doorvoer biofilmonthechting in 96-wells platen. Het protocol bevat ook belangrijke stappen voor biofilm kweken, wassen en visualisatie, met een focus op het minimaliseren van variabiliteit en zorgen voor reproduceerbaarheid.

Staphylococcus biofilm en antibiotica onderzoek

Staphylococcus biofilms spelen een cruciale rol in hardnekkige infecties vanwege hun resistentie tegen antibiotica en immuunreacties. Biofilmvorming biedt een beschermende omgeving voor bacteriën, waardoor infecties moeilijk te behandelen zijn. Onderzoek naar biofilms richt zich vaak op het begrijpen van hun vorming, gedrag en gevoeligheid voor antimicrobiële stoffen, met de nadruk op high-throughput methoden om experimentele workflows te stroomlijnen.
De UIP400MTP sonicator voor meerdere platen biedt een aanzienlijk voordeel bij biofilmonderzoek doordat biofilms snel en efficiënt kunnen worden losgemaakt van 96-wells platen. Dit apparaat levert uniforme ultrasone energie aan alle wells, waardoor consistente resultaten worden gegarandeerd en variabiliteit wordt geminimaliseerd.

Protocol voor Staphylococcus Biofilm Kweken en losmaken

Hieronder begeleiden we je met een stap-voor-stap instructie door het proces van het kweken en losmaken van een staphylococcus biofilm. Als voorbeeld van een analytische stap laten we zien hoe je de gekweekte biomassa spectrofotometrisch kunt kwantificeren door middel van kristalvioletkleuring.

Kweken van Staphylococcus Biofilm

Benodigde materialen:

• Steriele 96-wells polystyreen microtiterplaten met vlakke bodem en behandeld met weefselkweek, met deksel
• Tryptic Soy Broth (TSB) met 0,25% glucose
• Biologisch veiligheidskabinet

Stappen:

1. Zorg voor een steriele werkomgeving in een biologisch veiligheidskabinet om contaminatie tot een minimum te beperken.
2. Voeg TSB met 0,25% glucose toe aan de putjes van de microtiterplaat. TSB zonder glucose ondersteunt over het algemeen geen biofilmvorming en mag alleen als controle worden gebruikt indien nodig.
3. Inoculeer de wells met bacteriestammen die zijn bereid zoals hieronder beschreven:
4. Bereid bacteriesuspensies en zorg ervoor dat er geen reeds bestaande celclusters zijn door de suspensies te homogeniseren met behulp van sonicatie of door clusters op te breken met een naald van 23 gauge en kort te vortexen.
5. Sluit de plaat af met het deksel en incubeer onder omstandigheden die optimaal zijn voor biofilmvorming (bijv. 37°C gedurende 24 uur).
6. Voer het experiment voor elke bacteriestam in drievoud uit (drie putjes per stam) om de betrouwbaarheid te garanderen.
7. Wijs zes wells per plaat toe voor negatieve controles. Per 96-wells-plaat kunnen maximaal 30 stammen worden getest.

Biofilm visualiseren en wassen

1. Gooi het medium na incubatie voorzichtig weg om verstoring van de biofilm te voorkomen.
2. Was elke well vier keer met fysiologische zoutoplossing om planktonische bacteriën te verwijderen.
3. Inspecteer de bodem van de wells op witte vlekken die wijzen op de aanwezigheid van biofilm.

Biofilmverwijdering met de Multi-Well Plate Sonicator UIP400MTP

Apparaatinstellingen en -parameters:

• UIP400MTP sonicator voor meerdere wells
• Bedrijfsinstellingen: 60% amplitude, cyclusmodus met 60 seconden AAN / 30 seconden UIT

Stappen:

1. Plaats de gewassen microtiterplaat op het UIP400MTP platform.
2. Sonificeer de monsters bij de aanbevolen instellingen (60% amplitude, 60 seconden AAN, 30 seconden UIT). Pas de instellingen aan de bacteriestam aan.
3. Start het sonicatieproces om de biofilm los te maken. De ultrasone golven verstoren de biofilmmatrix, waardoor de aanhangende bacteriën vrijkomen.
4. De UIP400MTP zorgt voor een uniforme belichting in alle wells voor consistente onthechtingsresultaten.

Analytische stap: Kwantificering van losgemaakte Staphylococcus Biofilm Biomassa met behulp van kristalviolet (CV)

Benodigde materialen:

• 0.1% kristalviolet (CV) oplossing
• 95% ethanol of 30% azijnzuur (voor oplossen)
• Microtiterplaatlezer die kan lezen bij 570 nm
• Steriele microtiterplaten voor kleuring

Stappen:

1. Voorbereiding van de kleuringplaat: Breng 100 µL van de losgemaakte biofilmsuspensie van elk putje van de gesoniseerde plaat over in de overeenkomstige putjes van een schone, steriele 96-wells microtiterplaat. Dit zorgt voor een heldere en uniforme omgeving voor het kleuren.
2. Kleuring van de losgemaakte biofilm: Voeg 150 µL 0,1% kristalvioletoplossing toe aan elk putje met de losgemaakte biofilmsuspensie. Pipetteer voorzichtig om ervoor te zorgen dat de biofilmsuspensie en het kristalviolet zich gelijkmatig vermengen.
3. Incubatie: Laat de plaat 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen zodat het kristalviolet de biomassa effectief kan kleuren.
4. Wassen: Na incubatie de kristalvioletoplossing voorzichtig uit de wells verwijderen zonder de biomassa te verstoren. Was elke well drie keer met steriele fysiologische zoutoplossing om ongebonden vlekken te verwijderen.
5. Drogen: Laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of onder een steriele luchtkap. Vermijd verhitting, omdat dit de resultaten kan veranderen.
6. Oplossen: Voeg 200 µL ethanol 95% (of azijnzuur 30%, afhankelijk van de standaard laboratoriumpraktijken) toe aan elk putje om het gebonden kristalviolet op te lossen. Voorzichtig mengen door pipetteren of de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur schudden.
7. Meting: Meet de optische dichtheid (OD) van de opgeloste kristalvioletoplossing bij 570 nm met een microplaatlezer.
8. Gegevensanalyse: Trek de gemiddelde OD570-waarde van de negatieve controles (putjes met TSB maar zonder bacterieel inoculum) af van de experimentele putjes om rekening te houden met achtergrondkleuring. Sla de gegevens op en analyseer ze.

Opmerking: Voer het experiment voor elke conditie in drievoud uit om reproduceerbaarheid te garanderen. Zorg voor een juiste hantering van kristalviolet en ethanol, waarbij de veiligheids- en verwijderingsprotocollen in acht worden genomen.
 

De belangrijkste voordelen van de UIP400MTP in één oogopslag:

• Snelle verwerking: Speciaal ontworpen voor platen met meerdere putjes, zodat u meerdere monsters tegelijk kunt verwerken.
• Uniforme ultrasone distributie: Zorgt voor een gelijke ultrasone intensiteit in de wells, waardoor consistente resultaten voor alle monsters worden verkregen.
• Gebruik elke standaardplaat: De UIP400MTP kan alle standaard multi-well platen, petrischalen en buisrekken aan. Geen dure merkgebonden platen nodig!
• Gebruiksvriendelijke interface: Eenvoudig in te stellen en te bedienen, waardoor het een uitstekend hulpmiddel is om de productiviteit in het lab te verhogen. Programmeerbare instellingen en automatisering vergemakkelijken processtandaardisatie!