Protocol voor het gebruik van sonicatoren van Hielscher voor meerdere monsters bij biofilm- en proteoomanalyse

Het gebruik van sonicatoren voor meerdere monsters, zoals de VialTweeter Multi-Tube Sonicator en de UIP400MTP Microplate Sonicator, stroomlijnt laboratoriumwerkprocessen voor toepassingen met een hoge verwerkingscapaciteit. Beide apparaten maken een nauwkeurige en uniforme ultrasone verwerking van meerdere monsters mogelijk, waardoor de variabiliteit wordt geminimaliseerd en de reproduceerbaarheid wordt verbeterd. Dit is vooral gunstig bij experimenten die consistente monsterlyse, losmaking van biofilms, eiwitextractie of proteolytische digestie vereisen, waarbij handmatige methoden of methoden voor afzonderlijke monsters minder efficiënt zijn en gevoelig zijn voor inconsistentie.

Stroomlijn werkprocessen met sonicatoren voor meerdere monsters

De UIP400MTP maakt bijvoorbeeld gelijktijdige ultrasone behandeling van wells in microplaten mogelijk, waardoor biofilms of celmateriaal uniform worden losgemaakt. De VialTweeter biedt nauwkeurige lyse en homogenisatie van meerdere monsters in buisjes zonder kruisbesmetting. Deze sonicatoren verkorten de verwerkingstijden aanzienlijk, verbeteren de reproduceerbaarheid van experimenten en behouden een hoge monsterintegriteit, waardoor ze onmisbare hulpmiddelen zijn voor onderzoek in de microbiologie, proteomica en moleculaire biologie.
Hieronder staat een gedetailleerd protocol dat het gebruik illustreert van de sonicatormodellen van Hielscher voor meerdere monsters, de VialTweeter Multi-Tube Sonicator en de Microplate Sonicator UIP400MTP, in een onderzoek naar biofilmvorming door E. coli en daaropvolgende proteoomanalyse.

Protocol: biofilmvorming, losmaking en proteoomanalyse met sonicatoren van Hielscher voor meerdere monsters

1. Voorbereiding van de bacteriecultuur

• Kweek E. coli-bacteriën (stam W3110) bij 30°C, een temperatuur die gunstig is voor biofilmvorming door E. coli, in een tryptonbouillonmedium (TB) met:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• Voeg zo nodig antibiotica toe om het behoud van plasmiden te waarborgen.
• Gebruik voor microscopie en onderzoek naar promotoractiviteit de E. coli-stam W3110 met een genomische enhanced GFP-reporter (eGFP) onder controle van de rplL-promotor.
• Gebruik GFP-reporterplasmiden voor verschillende promotors (bijv., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) om promotoractiviteiten te meten.

2. Biofilmkweek en losmaking

• Ent 1,5 mL verdunde bacteriecultuur per well in een plaat met 12 wells (CellStar-platen met 12 wells, Greiner Bio-One).
• Incubeer om biofilmvorming mogelijk te maken.
• Verwijder de planktonische (niet-gehechte) cultuur voorzichtig.

– Was elke well met 500 µL PBS.
– Maak gehechte cellen los door de plaat met 12 wells te soniceren in de microplaatsonicator UIP400MTP. De UIP400MTP zorgt voor uniforme losmaking door in alle wells consistente ultrasone energie toe te dienen.
– Sonicatie-instellingen: 60% amplitude, cyclusmodus: 60 sec AAN / 30 sec UIT.

3. Celoogst en lyse

• Centrifugeer losgemaakte biofilmcellen gedurende 5 minuten bij 4.500 g.
• Was de gepelleteerde cellen met PBS.
• Resuspendeer de cellen in 100 µL 2% natriumlauroylsarcosinaat (SLS) en incubeer gedurende 15 minuten bij 95°C.
• Soniceer met de VialTweeter Multi-Tube Sonicator om volledige cellyse te waarborgen.
  – Sonicatie-instellingen: 100% amplitude, 50 s AAN / 10 s UIT met een totale looptijd van 10 min; houd de monsters op ijs.

4. Reductie en alkylering

• Voeg 5 mM tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) toe om disulfidebindingen te reduceren en incubeer gedurende 15 minuten bij 95°C.
• Alkyleer eiwitten met 10 mM joodacetamide gedurende 30 minuten bij 25°C.

5. Eiwitkwantificering en digestie

• Centrifugeer de lysaten om celresten te verwijderen.
• Kwantificeer het totale eiwitgehalte met de Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Voer digestie uit van 50 µg totaal eiwit met 1 µg trypsine in een oplossing met 2% SLS en 100 mM ammoniumbicarbonaat.
• Incubeer de digestiereactie een nacht bij 30°C.

6. Peptidezuivering

• Sla SLS neer door 1,5% trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen en centrifugeer vervolgens.
• Zuiver peptiden met C18-microspinkolommen.
• Droog de gezuiverde peptiden en resuspendeer ze in 0,1% TFA.

7. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS)

• Analyseer peptiden met een Q-Exactive Plus-massaspectrometer gekoppeld aan een Ultimate 3000 RSLC nano-systeem.
• Scheid peptiden met een HPLC-kolom met omgekeerde fase (75 µm × 42 cm), gepakt met C18-hars (2,4 µm).
• Pas gedurende 140 minuten een gradiënt toe van 2% tot 35% oplosmiddel B (acetonitril met 0,15% mierenzuur).
• Verzamel gegevens met scans met MS met hoge resolutie, gevolgd door tandemscans met MS/MS van de 10 ionen met de hoogste intensiteit.

8. Gegevensanalyse

• Verwerk ruwe gegevens van LC-MS met de software van Progenesis.
• Exporteer .mgf-bestanden en analyseer ze met MASCOT.
• Voer peptidekwantificering uit met SafeQuant voor kwaliteitscontrole en correctie voor fout-positieve identificaties.
• Voer alle experimenten in duplo of triplo uit om de reproduceerbaarheid te waarborgen.

Sonicatoren voor meerdere monsters voor monstervoorbereiding met een hoge verwerkingscapaciteit

De sonicatormodellen VialTweeter en UIP400MTP voor meerdere monsters verbeteren de nauwkeurigheid en efficiëntie van experimentele werkprocessen aanzienlijk, vooral bij biofilmonderzoek en proteomica. Hun vermogen om meerdere monsters uniform te verwerken waarborgt een hoge verwerkingscapaciteit zonder afbreuk te doen aan de gegevenskwaliteit. Deze voordelen, gecombineerd met de hierboven beschreven gestroomlijnde werkprocessen, maken de sonicatoren van Hielscher voor meerdere monsters tot essentiële hulpmiddelen voor modern biologisch onderzoek.

Ontwerp, productie en advies – kwaliteit uit Duitsland

De sonicatoren van Hielscher staan bekend om hun hoogste normen voor kwaliteit en ontwerp. Robuustheid en eenvoudige bediening maken een soepele integratie van onze sonicatoren in industriële installaties mogelijk. De sonicatoren van Hielscher kunnen moeiteloos omgaan met zware omstandigheden en veeleisende omgevingen.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op sonicatoren met hoge prestaties, de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen de sonicatoren van Hielscher aan de CE-eisen en aan de vereisten van UL, CSA en RoHs.