Protocol met Hielscher Multi-Sample Sonicators voor biofilm- en proteomische analyse

Het gebruik van sonicators voor meerdere monsters, zoals de VialTweeter Multi-Tube Sonicator en de UIP400MTP Microplate Sonicator, stroomlijnt laboratoriumworkflows voor high-throughput toepassingen. Beide apparaten maken een nauwkeurige en uniforme ultrasone verwerking van meerdere monsters mogelijk, waardoor de variabiliteit geminimaliseerd en de reproduceerbaarheid verbeterd wordt. Dit is met name een voordeel bij experimenten waarbij consistente monsterlyse, biofilmonthechting, eiwitextractie of proteolytische ontsluiting nodig is, waar handmatige of single-sample methoden minder efficiënt zijn en vatbaar voor inconsistentie.

Workflows stroomlijnen met multi-sample Sonicators

De UIP400MTP maakt bijvoorbeeld gelijktijdige ultrasone behandeling van microtiterplaatwells mogelijk, waardoor biofilms of cellulair materiaal gelijkmatig worden losgemaakt. Ondertussen biedt de VialTweeter nauwkeurige lysis en homogenisatie van meerdere buismonsters zonder kruisbesmetting. Deze sonicators verkorten de verwerkingstijd aanzienlijk, verbeteren de experimentele reproduceerbaarheid en handhaven een hoge monsterintegriteit, waardoor ze onmisbare hulpmiddelen zijn bij microbiologisch, proteomisch en moleculair biologisch onderzoek.
Hieronder staat een gedetailleerd protocol dat het gebruik van de Hielscher ultrasone modellen met meerdere monsters, de VialTweeter Multi-Tube Sonicator en de Microplate Sonicator UIP400MTP, illustreert in een onderzoek naar E. coli-biofilmvorming en daaropvolgende proteomische analyse.

Protocol: Biofilmvorming, onthechting en proteomische analyse met behulp van Hielscher Multi-Sample Sonicators

1. Voorbereiding van de bacteriekweek

• Kweek E. coli-bacteriën (stam W3110) bij 30°C, een temperatuur die gunstig is voor E. coli-biofilmvorming, in tryptonbouillonmedium (TB) met:
  – 10 g/L trypton
  – 5 g/L NaCl
• Vul zo nodig aan met antibiotica om ervoor te zorgen dat het plasmide behouden blijft.
• Gebruik voor microscopie en onderzoek naar de activiteit van de promotor de W3110 E. coli-stam met een genomic enhanced GFP (eGFP)-reporter onder controle van de rplL-promotor.
• Gebruik GFP-reporterplasmiden voor verschillende promoters (bijv, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) om promotoractiviteiten te meten.

2. Biofilm kweken en losmaken

• Zaad 1,5 ml verdunde bacteriecultuur per well in een 12-well plaat (CellStar 12-well platen, Greiner Bio-One).
• Incubeer om biofilmvorming mogelijk te maken.
• Verwijder de planktonkweek (niet-klevend) voorzichtig.

– Was elk putje met 500 µL PBS.
– Maak vastzittende cellen los door de 12-wells-plaat te sonificeren in de UIP400MTP microplaat sonicator. De UIP400MTP zorgt voor een uniforme ontkoppeling door consistente ultrasone energie te leveren in alle wells.
– Sonicatie-instellingen: 60% amplitude, cyclusmodus: 60 sec AAN / 30 sec UIT.

3. Oogsten en lyseren van cellen

• Centrifugeer losgemaakte biofilmcellen bij 4.500 g gedurende 5 minuten.
• Was de gepelleteerde cellen met PBS.
• Resuspendeer de cellen in 100 µL 2% natriumlaurroylsarcosinaat (SLS) en incubeer 15 minuten bij 95°C.
• Sonificeer met de VialTweeter Multi-Tube Sonicator om volledige cellyse te verzekeren.
  – Sonicatie-instellingen: 100% amplitude, 50 s AAN / 10 s UIT voor 10 min totale looptijd; bewaar monsters in ijs.

4. Reductie en alkylering

• Voeg 5 mM Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) toe om disulfidebindingen te reduceren en incubeer 15 minuten bij 95°C.
• Alkyleer eiwitten met 10 mM iodoacetamide gedurende 30 minuten bij 25°C.

5. Eiwitkwantificering en -vertering

• Centrifugeer de lysaten om brokstukken te verwijderen.
• Kwantificeer het totale eiwitgehalte met de Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digest 50 µg totaal eiwit met 1 µg trypsine in een oplossing met 2% SLS en 100 mM ammoniumbicarbonaat.
• Incubeer de digestiereactie overnacht bij 30°C.

6. 6. Peptide zuivering

• SLS neerslaan door 1,5% trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen en vervolgens centrifugeren.
• Peptiden zuiveren met C18 microspin kolommen.
• Droog de gezuiverde peptiden en resuspendeer ze in 0,1% TFA.

7. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS)

• Analyseer peptiden op een Q-Exactive Plus massaspectrometer gekoppeld aan een Ultimate 3000 RSLC nano systeem.
• Scheid peptiden met een omgekeerde fase HPLC-kolom (75 µm × 42 cm) gevuld met C18-hars (2,4 µm).
• Pas een gradiënt toe van 2% tot 35% oplosmiddel B (acetonitril met 0,15% mierenzuur) over 140 minuten.
• Verzamel gegevens met hoge-resolutie MS-scans gevolgd door tandem MS/MS-scans van de 10 meest intense ionen.

8. Gegevensanalyse

• Verwerk ruwe LC-MS gegevens met Progenesis software.
• Exporteer .mgf-bestanden en analyseer ze met MASCOT.
• Voer peptidekwantificering uit met SafeQuant voor kwaliteitscontrole en aanpassing voor false-discovery.
• Voer alle experimenten in duplo of triplo uit om reproduceerbaarheid te garanderen.

Multi-sample Sonicators voor snelle monstervoorbereiding

De sonicatormodellen VialTweeter en UIP400MTP met meerdere monsters verbeteren de precisie en efficiëntie van experimentele workflows aanzienlijk, vooral bij biofilmonderzoek en proteomics. Hun vermogen om meerdere monsters uniform te verwerken zorgt voor een hoge doorvoercapaciteit zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens. Deze voordelen, gecombineerd met de gestroomlijnde workflows zoals hierboven beschreven, maken Hielscher multi-sample sonicators tot essentiële hulpmiddelen voor modern biologisch onderzoek.

Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit Made in Germany

Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasoonapparatuur in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasoontoestellen aangepakt.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.