Extractie van extracellulaire matrix met de sonicator voor 96-wellsplaten UIP400MTP

Traditionele methoden voor de extractie van extracellulaire matrix (EM) omvatten vaak meerdere stappen om de biofilmmatrix te verstoren. Deze technieken kunnen echter tijdrovend zijn en inconsistente resultaten opleveren, waardoor variatie in de resultaten ontstaat. Met de sonicator voor 96-wellsplaten UIP400MTP wordt het EM-extractieproces aanzienlijk vergemakkelijkt en wordt een zeer efficiënte, nauwkeurige en uniforme verstoring van biofilms in formaten met hoge doorvoer mogelijk. De UIP400MTP gebruikt gefocust ultrageluid om gecontroleerde cavitatie op te wekken, waardoor de biofilmmatrix effectief wordt afgebroken terwijl de levensvatbaarheid en integriteit van de in de biofilm ingebedde cellen behouden blijven. Het gebruik van de UIP400MTP verbetert de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van vervolgassays, zoals metabolomische en proteomische analyses, levensvatbaarheidstests en onderzoeken naar antimicrobiële gevoeligheid. Door de EM-extractie te stroomlijnen, stelt de UIP400MTP onderzoekers in staat consistente en hoogwaardige resultaten te behalen, die diepere inzichten bieden in de dynamiek van biofilms en hun interacties met externe agentia.

Extractie van extracellulaire matrix

De extracellulaire matrix (EM) is een cruciaal bestanddeel van biofilms die worden gevormd door micro-organismen zoals Candida albicans. De EM bestaat uit polysachariden, eiwitten, lipiden en extracellulair DNA, zorgt voor structurele integriteit, bemiddelt de hechting aan oppervlakken en draagt aanzienlijk bij aan antimicrobiële resistentie. De extractie en analyse van de EM zijn essentieel om de biologie van biofilms te begrijpen, mechanismen van geneesmiddelresistentie op te helderen en nieuwe therapeutische aangrijpingspunten te identificeren.

Protocol voor de extractie van extracellulaire matrix (EM) uit biofilms van Candida albicans met de UIP400MTP

Dit protocol richt zich op de extractie van de extracellulaire matrix (EM) van statische biofilms van Candida albicans. De sonicator UIP400MTP wordt geïntegreerd ter vervanging van traditionele schraapstappen of stappen op basis van enzymen om de efficiëntie en reproduceerbaarheid te verbeteren.

Benodigde materialen

Stapsgewijze instructies voor EM-extractie

1. Vorming van een statische biofilm
   Ent voor statische biofilms C. albicans in de putjes van een 96-wellsplaat met RPMI-1640-medium. Elk putje moet een gelijk volume inoculum bevatten (bijv. 200 µL per putje).
   Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37°C onder statische omstandigheden om biofilmvorming op de oppervlakken van de putjes mogelijk te maken.
2. Voorbereiding van de biofilm voor extractie
   Zuig na de incubatie het gebruikte medium voorzichtig uit elk putje op en voer het af zonder de biofilm te verstoren.
   Spoel elk putje voorzichtig met steriele PBS (bijv. 200 µL) om los gehechte cellen en planktonische resten te verwijderen. Herhaal deze stap tweemaal.
   Voeg verse PBS of de extractiebuffer (bijv. 200 µL) toe aan elk putje ter voorbereiding op de sonicatie.
3. Sonicatie met de UIP400MTP
   Plaats de 96-wellsplaat met PBS of extractiebuffer in de plaathouder van de sonicator UIP400MTP. Volg de instructies in de handleiding om de multiwellplaat correct te plaatsen.
   Soniceer gedurende 5–6 minuten bij een milde instelling (60% amplitude, pulsmodus), waarbij u zorgt voor een uniforme verstoring van de biofilmstructuur en het vrijkomen van EM-componenten.
   Gebruik de temperatuurregeling van de sonicator UIP400MTP (temperatuursensor en instellingen) om overmatige opwarming of beschadiging van de monsters te voorkomen.
4. Behandeling met kationenwisselaarhars (CER)
   Breng de gesoniceerde vloeistof uit elk putje over naar een nieuwe 96-wellsplaat.
   Voeg aan elk putje een tweevoudig volume CER-suspensie toe (bereid in PBS of buffer) (bijv. 400 µL totaal volume per putje).
   Sluit de plaat af en incubeer deze gedurende 3 uur op een plaatschudder of rotator bij 400 rpm om binding en isolatie van EM-componenten mogelijk te maken.
5. Scheiding en filtratie
   Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten bij 2.000 × g om de hars en de cellen van het supernatant te scheiden.
   Breng het EM-bevattende supernatant uit elk putje voorzichtig over naar een nieuwe 96-wellsplaat.
   Filtreer het supernatant door een filter van 0,22 µm met een vacuümmanifoldsysteem voor platen of een gelijkwaardig systeem om een zuiver EM-extract te verkrijgen.
6. Analyse van de EM
   Gebruik technieken zoals UPLC-Q-TOF-MS voor niet-gerichte metabolietprofilering, of gebruik specifieke assays (bijv. BCA voor eiwitten en kwantificeringskits voor triglyceriden en koolhydraten) om EM-componenten te karakteriseren.

Extractie van extracellulaire matrix met hoge doorvoer

De hoge efficiëntie van de extractie van extracellulaire matrix (EM) met de sonicator UIP400MTP heeft een revolutie teweeggebracht in de monstervoorbereiding voor assays die een nauwkeurige analyse van biofilmeigenschappen vereisen. De UIP400MTP gebruikt ultrasone golven om de biofilmmatrix nauwkeurig en uniform te verstoren, waardoor EM-componenten effectief vrijkomen terwijl de levensvatbaarheid en integriteit van de cellen behouden blijven. Deze aanpak verbetert de betrouwbaarheid van assays zoals levensvatbaarheidstests voor biofilms, proteomische en metabolomische onderzoeken en beoordelingen van antimicrobiële gevoeligheid aanzienlijk.

Bij assays voor het terugwinnen van biofilms, zoals het tellen van kolonievormende eenheden (CFU), zorgt EM-extractie met de UIP400MTP ervoor dat reagentia ongehinderd toegang hebben tot de in de biofilm ingebedde cellen. Ook proteomische en metabolomische analyses, zoals UPLC-Q-TOF-MS, profiteren van de isolatie van eiwitten, lipiden en metabolieten met een hoge opbrengst. De UIP400MTP ondersteunt daarnaast nauwkeurige tests van antimicrobiële gevoeligheid, waardoor de MIC- en MBEC-waarden van biofilms nauwkeurig kunnen worden bepaald. Bovendien ondersteunt de efficiënte extractie met de UIP400MTP assays voor enzymactiviteit, kwantificering van componenten en structurele onderzoeken, wat waardevolle inzichten biedt in de rol van extracellulaire matrices bij de architectuur, hechting en resistentiemechanismen van biofilms.

Deze reproduceerbare extractiemethode met hoge doorvoer optimaliseert de EM-voorbereiding en zorgt voor superieure resultaten bij een reeks biofilmgerelateerde assays.