Deparaffinisatie en eiwitextractie uit FFPE
Faciliteer eiwitextractie uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselsecties met behulp van een geoptimaliseerde combinatie van deparaffinisatie, oplosbaarheid en sonicatie met een VialTweeter multi-tube ultrasoonapparaat. Dit protocol ondersteunt downstream massaspectrometrie-gebaseerde proteomics en is compatibel met SP3-opruimings- en enzymatische verteringsworkflows.
Deze SOP is bedoeld voor laboratoriumpersoneel dat betrokken is bij proteomische analyse van FFPE-weefselmonsters met behulp van hoogwaardige sonicatie. Het is geoptimaliseerd voor maximaal tien FFPE-samples die parallel worden verwerkt met behulp van de VialTweeter Multi-Tube Sonicator.
VialTweeter sonicator voor de gelijktijdige sonicatie van 10 monsters, bijv. voor lysis en eiwitextractie uit FFPE-monsters
Protocol: Eiwitextractie uit FFPE-monsters met behulp van de VialTweeter
Materialen en reagentia
reagentia
- Xyleen (histologie graad)
- Ethanol (absoluut 96%)
- Lysisbuffer:
- Proteaseremmer (optioneel; bijv. cOmplete™ mini EDTA-vrij)
6 M Guanidine hydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl) fosfine)
40 mM CAA (2-chlooracetamide)
Uitrusting
- VialTweeter Multi-Tube Ultrasoonapparaat
- Microcentrifugebuisjes van 1,5 ml of 2,0 ml met lage binding
- Warmteblok of broedmachine (instellingen 95 °C en 80 °C)
- Microcentrifuge
- Thermomixer (optioneel maar aanbevolen)
Voorbeeld invoer
- 1-2 secties van 10 μm dik FFPE-weefsel per monster (d.w.z. per injectieflacon)
- Een totaal van ~100 μg weefsel per monster (d.w.z. per injectieflacon)
of
Opmerking: Gebruik nieuwe messen voor microtomie om verontreiniging door paraffineresten te minimaliseren.
Procedure
- deparaffinering
- Breng FFPE-secties over in microcentrifugebuisjes met een lage binding.
- Voeg 1 ml xyleen toe, vortex kort.
- Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 14.000 × g; Gooi Supernatant weg.
- Herhaal xyleenwas nog een keer (stappen 2-4).
- Was de pellet met 1 ml 96% ethanol, vortex en centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten op 14.000 × g. Gooi supernatant weg.
- Herhaal de ethanolwasbeurt nog een keer (in totaal 2 wasbeurten op ethanol).
- Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur met open deksels om resterende ethanol te verdampen.
- Eiwitextractie en sonicatie
- Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan elke droge pellet.
Opmerking: Hoewel de sonicator plaats biedt aan maximaal 1 ml, is 200 μl optimaal voor downstream-verwerking. - Meng door vortexen of voorzichtig pipetteren.
- Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan elke droge pellet.
- Eerste thermische incubatie
- Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij 95 °C, met roeren bij 400 tpm met behulp van een thermomixer of warmteblok.
- Laat de monsters 5 minuten afkoelen op kamertemperatuur.
- Eerste sonicatie met de VialTweeter
- Plaats de buisjes in de VialTweeter.
- Stel de VialTweeter UP200St in op de onderstaande waarden en sonicate.
- Tweede thermische incubatie
Verwijder de buisjes en incubeer opnieuw bij 95 °C gedurende 15 min, 400 tpm. - Tweede sonicatie
Herhaal de sonicatie op de VialTweeter met dezelfde instellingen (als hierboven) gedurende nog eens 10 cycli (15 minuten in totaal). - Verduidelijking van lysaat
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 13.000 × g bij 23°C (kamertemperatuur).
- Verzamel het bovenstaande voorzichtig in een nieuwe 2,0 ml Safe-lock Eppendorf-buis. Vermijd het verstoren van de pellet.
- Downstream verwerking
Het lysaat is nu klaar voor SP3-opruiming en enzymatische vertering.
• Stel de amplitude (A) in op 100%
• Stel de pulsatiemodus (C) in op 100%
• Periode Klok: Aan
• Op tijd: jaren '60
• Vrije tijd: 30s
• Limietwaarde: 15 min (komt overeen met 10 cycli)
(Berekeningsopmerking: (60 s Aan + 30 s Uit) × 10 cycli = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter met 10 Eppendorf buizen
Opmerkingen en best practices
- Het risico op oververhitting tijdens sonicatie wordt beperkt door geprogrammeerde AAN/UIT-cycli.
- Vermijd vortexing na sonicatie om eiwitaggregatie te voorkomen.
Afvalverwerking en veiligheid
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone apparaten op laboratoriumformaat:
| Aanbevolen apparaten | Batchvolume | Debiet |
|---|---|---|
| UIP400MTP sonificator voor 96-wells platen | multi-well/microtiterplaten | n.v.t. |
| Ultrasone kopHoorn | CupHorn voor flesjes of bekerglas | n.v.t. |
| GDmini2 | ultrasone microstroomreactor | n.v.t. |
| VialTweeter | 0.5 tot 1.5mL | n.v.t. |
| UP100H | 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St | 10 tot 1000 ml | 20 tot 200 ml/min |
| UP400St | 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min |
| Ultrasone zeefschudder | n.v.t. | n.v.t. |
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren voor mengtoepassingen, dispergeren, emulgeren en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.
Literatuur / Referenties
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
veelgestelde vragen
Waarom worden weefselmonsters gefixeerd als FFPE?
Formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) conservering stabiliseert weefselmorfologie en eiwitstructuren door covalente cross-links te vormen via formaldehyde. Inbedding in paraffine maakt langdurige opslag bij kamertemperatuur mogelijk, terwijl de histologische en moleculaire integriteit voor retrospectieve analyses behouden blijft.
Hoe deparaffiniseer ik FFPE-monsters?
Deparaffinisatie omvat opeenvolgende wasbeurten met oplosmiddelen om paraffine te verwijderen: meestal twee incubaties met xyleen, gevolgd door twee wasbeurten met ethanol (96%). Na centrifugeren en drogen is het weefsel klaar voor stroomafwaartse extractie. Dit proces herstelt de toegankelijkheid van het monster voor lysis en enzymatische vertering.
Wat is het doel van thermische incubatie?
Thermische incubatie verwijst naar de gecontroleerde blootstelling van een monster aan een bepaalde temperatuur gedurende een bepaalde periode om biochemische of fysische veranderingen te veroorzaken. In proteomics wordt het vaak gebruikt om eiwitten te denatureren, formaldehyde-crosslinks in FFPE-weefsels om te keren of de werkzaamheid van lysisbuffer te verbeteren. De temperatuur en duur zijn kritische parameters, afgestemd op de doelreactie of het monstertype.
Wat is SP3-spijsvertering?
Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) is een op kralen gebaseerde proteomics-workflow. Het maakt gebruik van paramagnetische kralen om eiwitten te binden, waardoor een efficiënte opruiming, concentratie en enzymatische vertering op de kraal onder denatureringsomstandigheden mogelijk is. SP3 minimaliseert monsterverlies en is zeer compatibel met low-input en FFPE-monsters.
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.