Deparaffinering en eiwitextractie uit FFPE

Vergemakkelijk de eiwitextractie uit formalinegefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselcoupes met een geoptimaliseerde combinatie van deparaffinering, solubilisatie en sonicatie met een VialTweeter ultrasoonapparaat voor meerdere buisjes. Dit protocol ondersteunt daaropvolgende proteomica op basis van massaspectrometrie en is compatibel met workflows voor SP3-zuivering en enzymatische digestie.

Deze SOP is bedoeld voor laboratoriumpersoneel dat betrokken is bij de proteomische analyse van FFPE-weefselmonsters met sonicatie met hoge prestaties. Het protocol is geoptimaliseerd voor maximaal tien FFPE-monsters die parallel worden verwerkt met de VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protocol: eiwitextractie uit FFPE-monsters met de VialTweeter

Materialen en reagentia

Reagentia

• Xyleen (kwaliteit voor histologie)
• Ethanol (absoluut 96%)
• Lysisbuffer:

6 M guanidinehydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)fosfine)
40 mM CAA (2-chlooracetamide)

• Proteaseremmer (optioneel; bijvoorbeeld cOmplete™ mini EDTA-free)

Apparatuur

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• Microcentrifugebuisjes van 1,5 mL of 2,0 mL met lage binding
• Verwarmingsblok of incubator (instellingen van 95°C en 80°C)
• Microcentrifuge
• Thermomixer (optioneel maar aanbevolen)

Monstermateriaal

• 1–2 coupes van 10 µm dik FFPE-weefsel per monster (d.w.z. per buisje)

OF

• In totaal ~100 µg weefsel per monster (d.w.z. per buisje)

Opmerking: gebruik nieuwe mesjes voor microtomie om verontreiniging met paraffineresten tot een minimum te beperken.

Procedure

1. Deparaffinering
   1. Breng FFPE-coupes over in microcentrifugebuisjes met lage binding.
   2. Voeg 1 mL xyleen toe en vortex kort.
   3. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 14.000 × g; verwijder het supernatant.
   5. Herhaal de wasstap met xyleen nog één keer (stappen 2–4).
   6. Was de pellet met 1 mL ethanol van 96%, vortex en centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten bij 14.000 × g. Verwijder het supernatant.
   7. Herhaal de wasstap met ethanol nog één keer (in totaal 2 wasstappen met ethanol).
   8. Laat de pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur aan de lucht drogen met geopende deksels om de resterende ethanol te laten verdampen.
2. Eiwitextractie en sonicatie
   1. Voeg 200 µL lysisbuffer toe aan elke droge pellet.

      Opmerking: hoewel de sonicator geschikt is voor maximaal 1 mL, is 200 µL optimaal voor de daaropvolgende verwerking.

   2. Meng door te vortexen of voorzichtig te pipetteren.
3. Eerste thermische incubatie
   1. Incubeer de buisjes gedurende 30 min bij 95 °C, onder schudden bij 400 rpm met een thermomixer of verwarmingsblok.
   2. Laat de monsters gedurende 5 min bij kamertemperatuur afkoelen.
4. Eerste sonicatie met de VialTweeter
   1. Plaats de buisjes in de VialTweeter.
   2. Stel de VialTweeter UP200St in op de onderstaande waarden en voer sonicatie uit.
Instellingen van de sonicator
• Stel de amplitude (A) in op 100%
• Stel de pulsatiemodus (C) in op 100%
• Periodeklok: aan
• Inschakeltijd: 60s
• Uitschakeltijd: 30s
• Grenswaarde: 15 min (komt overeen met 10 cycli)
(Toelichting bij de berekening: (60 s aan + 30 s uit) × 10 cycli = 900 s = 15 min)
5. Tweede thermische incubatie
   Verwijder de buisjes en incubeer opnieuw gedurende 15 min bij 95 °C, 400 rpm.
6. Tweede sonicatie
   Herhaal de sonicatie met de VialTweeter met dezelfde instellingen (zoals hierboven) gedurende nog eens 10 cycli (15 min in totaal).
7. Klaring van het lysaat
   1. Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 13.000 × g en 23°C (kamertemperatuur).
   2. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuw Safe-lock Eppendorf-buisje van 2,0 mL. Zorg dat de pellet niet wordt verstoord.
8. Daaropvolgende verwerking
   Het lysaat is nu klaar voor SP3-zuivering en enzymatische digestie.

Opmerkingen en aanbevolen werkwijzen

1. Het risico op oververhitting tijdens sonicatie wordt beperkt door geprogrammeerde AAN/UIT-cycli.
2. Vermijd vortexen na sonicatie om eiwitaggregatie te voorkomen.

Afvalverwerking en veiligheid

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasoonapparaten voor het laboratorium: