FFPE monstervoorbereiding met hoge doorvoer: Eiwitextractie en nucleïnezuurschilfering
Met de high-throughput ultrasoon UIP400MTP pakt Hielscher Ultrasonics de uitdagingen aan van het prepareren van formalinefixatie en paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. Ontdek hoe ultrasoonbehandeling FFPE monsters in grote aantallen verwerkt voor FFPE deparaffinisatie, weefsellyse, homogenisatie, eiwitextractie en DNA/RNA afschuiving! Profiteer van ultrasone FFPE weefselpreparatie – verwerking van grote aantallen monsters in multiwellplaten! Verkrijg monsters van hoge kwaliteit en haal hoge aantallen monsters voor betrouwbare onderzoeksresultaten! En last but not least: bespaar tijd en geld!
Voorbereiding van FFPE-monsters vergemakkelijkt door ultrasone Sonicatie
Formalinefixatie en paraffine-inbedding (FFPE) is de meest gebruikte methode voor het bewaren en archiveren van vaste weefsels. De extractie van biomoleculen uit FFPE weefselmonsters vormt vaak een grote uitdaging vanwege de kwaliteit van de opgeslagen monsters. Deze monsters, die van onschatbare waarde zijn in moleculair biologisch en klinisch onderzoek, vormen een rijke bron van biologische informatie voor retrospectieve studies en diagnostische biomarker validatie. Het proces van formalinefixatie en paraffine-inbedding, waarbij de weefselarchitectuur en -morfologie behouden blijven, bemoeilijkt echter de extractie van hoogwaardige nucleïnezuren en eiwitten. Formaline induceert verknoping van nucleïnezuren en eiwitten, wat leidt tot moleculaire fragmentatie en chemische modificaties. Ontdek hoe de high-throughput ultrasoon UIP400MTP de uitdagingen van FFPE monstervoorbereiding overwint!
Ultrasoonapparaat voor efficiënte voorbereiding van FFPE-monsters
- Gebruiksvriendelijke workflow: Vereenvoudigde processen die gebruiksvriendelijk zijn.
- Deparafinisatie, Proteïne-extractie, DNA/RNA-scheren
- Snelle verwerking met hoge doorvoer: Efficiënte behandeling van platen met meerdere putjes.
- Effectieve deparaffinisatie: Verbeterde solubilisering van eiwitten.
- Niet-giftige oplosmiddelen: Vermijdt het gebruik van schadelijke organische oplosmiddelen zoals xyleen.
UIP400MTP sonicator met hoge verwerkingscapaciteit voor high-throughput verwerking van FFPE monsters in multiwellplaten
Vooruitgang in technieken voor eiwitextractie uit FFPE-weefsel
Hielscher Ultrasonics biedt een oplossing voor de uitdagingen in de high-throughput FFPE monstervoorbereiding. Sonificatie maakt gebruik van ultrasone golven om mechanische trillingen en gerichte cavitatie te genereren, waardoor celstructuren effectief worden verstoord en de oplosbaarheid van biomoleculen wordt verbeterd. Deze techniek heeft aan populariteit gewonnen vanwege de mogelijkheid om de efficiëntie en opbrengst van nucleïnezuur- en eiwitextractie uit FFPE-weefsels te verhogen, evenals het afschuiven van DNA en RNA voor bibliotheekpreparatie. Het is heel belangrijk om te benadrukken dat ultrasoonbehandeling met de UIP400MTP multiwell plaat sonicator de integriteit van deze biomoleculen voor downstream toepassingen behoudt.
Scheren van nucleïnezuur met behulp van ultrasone trillingen met hoge doorvoer
De multi-well ultrasoon UIP400MTP voor gebruik in high-throughput omgevingen brengt het prepareren van FFPE monsters naar een nieuw niveau. Deze sonicatiemethode met meerdere wells biedt een efficiënte en betrouwbare oplossing voor de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters. Het vergemakkelijkt de snelle en reproduceerbare extractie van DNA, RNA en eiwitten, die essentieel zijn voor verschillende analytische technieken, waaronder next-generation sequencing (NGS), kwantitatieve PCR en proteomische analyses. Optimalisatie van sonicatieparameters, zoals amplitude, duur en temperatuur, verbetert de kwaliteit en kwantiteit van de geëxtraheerde biomoleculen nog verder.
De UIP400MTP sonicator voor multiwellplaten biedt aanzienlijke voordelen voor het fragmenteren en knippen van DNA en RNA uit FFPE-weefsel. Een van de opvallendste eigenschappen van dit systeem is de mogelijkheid om smalle fragmentgroottes van DNA en RNA te bereiken, waarbij de sonicatie-intensiteit nauwkeurig kan worden afgesteld om korte fragmenten van 150-200 basenparen (bp) of langere fragmenten van 15-20 kilobasenparen (kbp) te verkrijgen. Deze veelzijdigheid maakt de UIP400MTP onmisbaar voor zowel short-read als long-read sequencing toepassingen, waardoor hoogwaardige resultaten voor next-generation sequencing (NGS) en whole-genome sequencing (WGS) gegarandeerd worden. De nauwkeurige controle over de fragmentgrootte is cruciaal voor onderzoekers op alle gebieden van genomics, omdat het mogelijk is om monsters te prepareren volgens specificaties.
Neem contact met ons op voor geavanceerde oplossingen in FFPE weefsel
Ontdek de UIP400MTP multiwell plaat sonicator voor efficiënt herstel van biomoleculen uit FFPE monsters, waarbij de integriteit van geëxtraheerde nucleïnezuren en eiwitten behouden blijft en de reproduceerbaarheid van resultaten gegarandeerd wordt. Deze technologie integreert naadloos met andere voorbereidende en analytische workflows, waardoor moleculaire onderzoeken met FFPE-weefselarchieven worden gestroomlijnd en verbeterd.
Fixeermiddelen en hun effecten
Fixatie is een cruciale stap in de monstervoorbereiding die de celstructuren behoudt, biochemische reacties stopt en degradatie voorkomt. Afhankelijk van de specifieke experimentele vereisten worden verschillende fixeermiddelen gebruikt. De twee meest gebruikte fixatieven zijn formaldehyde en paraformaldehyde, die eiwitten en nucleïnezuren crosslinken, waardoor de morfologie en antigeniciteit van cellen en weefsels behouden blijft. Andere fixatieven, zoals ethanol, methanol en glutaaraldehyde, worden gebruikt voor specifieke toepassingen.
Formaldehyde en paraformaldehyde fixeermiddelen vormen methyleenbruggen tussen aminogroepen, wat resulteert in crosslinking van eiwitten. Dit proces immobiliseert de cellulaire componenten op effectieve wijze, waardoor hun integriteit tijdens de volgende analysestappen behouden blijft. De effecten van deze fixatieven kunnen worden beïnvloed door factoren zoals concentratie, pH en temperatuur, en het optimaliseren van deze parameters is cruciaal om optimaal behoud van cellulaire structuren te garanderen.
Voordelen van ultrasoon FFPE prepareren
Ultrasoon is een krachtige techniek om gefixeerde cellen en weefsels te ontleden die conventionele technieken overtreft. Het biedt verschillende opmerkelijke voordelen ten opzichte van traditionele lysismethoden:
- Snelheid en efficiëntie: Ultrasone lysis zorgt voor een snelle verstoring van cellen en weefsels, waardoor de verwerkingstijd aanzienlijk korter is dan bij mechanische of chemische lysemethoden. Hoogfrequente geluidsgolven die door de ultrasone sonde worden gegenereerd, creëren mechanische schuifkrachten, waardoor de gefixeerde celstructuren worden verstoord. Deze snelle en efficiënte verstoring stelt onderzoekers in staat om grote monstervolumes binnen een kort tijdsbestek te verwerken.
- Zacht en verstelbaar: Ultrasone lysis biedt een zacht verstoringsmechanisme dat schade aan gevoelige biomoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren en enzymen tot een minimum beperkt. In tegenstelling tot mechanische methoden die overmatige hitte of schuifkrachten genereren, maakt ultrasone lysis gebruik van gecontroleerde cavitatie om cellen te verstoren met behoud van de integriteit en functionaliteit van de intracellulaire componenten.
- Veelzijdigheid: Ultrasone lysis kan worden toegepast op verschillende fixatieven, waardoor onderzoekers kunnen werken met een breed scala aan gefixeerde monsters. Of er nu formaldehyde, paraformaldehyde of alternatieve fixatieven worden gebruikt, ultrasone lysis levert consistent een efficiënte verstoring, waardoor een optimaal herstel van cellulaire componenten wordt gegarandeerd.
- Hoge opbrengst en kwaliteit: Ultrasone lysis vergemakkelijkt hoge opbrengsten van intacte cellulaire componenten dankzij het vermogen om gefixeerde cellen en weefsels uniform te onderbreken. Hierdoor kunnen downstreamtoepassingen zoals eiwitanalyse, nucleïnezuurextractie en enzymatische analyses betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren.
- Automatiseringscompatibiliteit: Ultrasone lysis kan eenvoudig worden geïntegreerd in geautomatiseerde systemen, waardoor monsterverwerking met hoge doorvoer mogelijk is. Deze compatibiliteit stelt onderzoekers in staat om hun workflow te stroomlijnen en de productiviteit te verhogen, met name bij grootschalige onderzoeken.
96-well platen sonicator UIP400MTP voor sonicatie van microtiter- en multiwellplaten
Ultrasone lysis heeft een revolutie teweeggebracht in de verstoring van gefixeerde cellen en weefsels en biedt talloze voordelen ten opzichte van traditionele lysemethoden. De snelheid, efficiëntie, selectiviteit, veelzijdigheid, hoge opbrengst en compatibiliteit met automatisering maken het een onmisbaar hulpmiddel in moleculair biologisch en biotechnologisch onderzoek. Hielscher Ultrasonics biedt zowel contactloze sonicators als sonicators van het probe-type, en is de meest geschikte ultrasone homogenisator voor uw life science toepassing. Of u nu enkelvoudige monsters, meerdere monsters of zeer grote aantallen monsters tegelijkertijd wilt verwerken, wij bieden u de beste sonicator die past bij uw onderzoeks- en diagnose-eisen.
Lees meer over Hielscher contactloze sonicators voor multi-sample en high-throughput monstervoorbereiding!
- eenmalige investering
- gebruik je eigen verbruiksartikelen
- geen terugkerende kosten voor eigen accessoires en verbruiksartikelen
- high-throughput
- nauwkeurige controle
- ultramoderne technologie
- betrouwbaarheid & robuustheid
- instelbare, nauwkeurige procesregeling
- industriële kwaliteit: kan 24/7 continu worden gebruikt
- eenvoudig en veilig te bedienen
- gering onderhoud
Lees meer over de toepassingen van sonicators in de biowetenschappen!
Plaat sonicator UIP400MTP voor alle 96-wells platen, microtiterplaten en multi-well platen.
Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit Made in Germany
Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasoonapparatuur in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasoontoestellen aangepakt.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
Ultrasone UIP400MTP: High-Throughput FFPE sample prep in Multi-Well-Plate
FAQ
Hieronder beantwoorden we veelgestelde vragen die relevant zijn voor het prepareren van FFPE-weefsel en ultrasoonbehandeling van FFPE-monsters.
Hoe wordt FFPE-weefsel geprepareerd?
Stappen voor FFPE weefselpreparaat: De zorgvuldige behandeling en verwerking van vers weefsel zijn essentieel voor het genereren van FFPE monsters van hoge kwaliteit. Het behoud van de celarchitectuur, nucleïnezuren en eiwitten is essentieel voor nauwkeurige downstream analyse. Elke stap - van verzamelen tot inbedden - vereist precisie om de integriteit van het monster te behouden voor verschillende analyses, waaronder histologisch onderzoek, immunohistochemie en moleculaire studies. Als dit fixatie- en inbeddingsproces goed wordt uitgevoerd, zorgt het ervoor dat het geconserveerde weefsel de in vivo toestand nauwkeurig weerspiegelt, waardoor betrouwbare diagnostische en onderzoeksresultaten mogelijk zijn.
We doorlopen de 6 belangrijkste stappen van het inbeddingsproces van FFPE-weefselmonsters.
- Weefsel collectie
Biopsies van levende zoogdieren en weefselkweken zijn beide levensvatbare bronnen voor het verkrijgen van vers weefsel voor FFPE monstervoorbereiding.
Het is belangrijk om een aseptische techniek te gebruiken: Gebruik steriele instrumenten en handschoenen om contaminatie te voorkomen. Verzamel weefsels bij voorkeur in een steriele omgeving, zoals een chirurgische suite of een laminaire stromingskap.
Aangezien het monster erg kwetsbaar is, is het essentieel dat het voorzichtig wordt behandeld: Beperk vertragingen in de verwerking tot een minimum en begin onmiddellijk met de daaropvolgende weefselverwerking na de excisie. Dit is cruciaal om autolyse en degradatie te voorkomen. Bewaar het weefsel op kamertemperatuur; vermijd bevriezing omdat dit kan leiden tot ijskristalvorming en weefselbeschadiging. - Fixatie van weefsel
Eerst wordt het weefsel behandeld met een fixeeroplossing: Gebruik 10% neutraal gebufferde formaline (NBF), wat gelijk staat aan 4% formaldehyde in water, gebufferd tot een neutrale pH.
Dompel het weefsel volledig onder in formaline. Zorg voor een fixeermiddel-weefsel volumeverhouding van ten minste 10:1. De fixatietijd varieert gewoonlijk van 6 tot 24 uur, afhankelijk van het weefseltype en de grootte. Het is belangrijk dat het fixeermiddel grondig in het weefsel kan doordringen. Overfixatie kan echter leiden tot verknoping die het ophalen van antigenen bemoeilijkt, terwijl onderfixatie kan resulteren in slechte weefselconservering. - Weefsel trimmen
Ten tweede, trim het weefsel tot een dikte van ongeveer 3-5 mm om voldoende penetratie van fixatief mogelijk te maken. Zorg voor een goede oriëntatie van het weefsel om relevante histologische structuren vast te leggen. Dit vergemakkelijkt het extractieproces wanneer het weefsel later voor analyse wordt gebruikt. - Het gefixeerde monster verwerken
Nu moet het gefixeerde weefsel gedehydrateerd worden: Na fixatie moet het weefsel gedehydrateerd worden om een grondige penetratie door de paraffine wax te garanderen. Haal het weefsel door een reeks ethanol (70%, 80%, 90% en 100%) om water te verwijderen.
Reinigen met xyleen: Paraffinewas is onoplosbaar in water, maar oplosbaar in xyleen. Daarom moet het water in het weefsel vervangen worden door xyleen. xyleen zelf is echter onoplosbaar in water maar oplosbaar in alcohol, waardoor een tussenstap nodig is waarbij eerst water wordt vervangen door alcohol. dompel het weefsel onder in xyleen of een xyleenvervanger om ethanol te verwijderen en het weefsel voor te bereiden op paraffine infiltratie.
Infiltratie met paraffine: Embed het weefsel in gesmolten paraffinewas en zorg voor volledige infiltratie. Deze stap omvat meestal meerdere paraffineverversingen om een grondige impregnatie te garanderen. - Het weefsel inbedden
In deze stap wordt het weefsel in een weefselblok gegoten: Plaats het weefsel in een mal met de gewenste oriëntatie en giet er gesmolten paraffine overheen. Laat de paraffine stollen door af te koelen bij kamertemperatuur of op een koude plaat. - Doorsnijden en monteren
Microtomie: Om het ingebedde weefsel in plakjes te snijden, wordt een microtoom gebruikt om dunne plakjes (meestal 4-5 micrometer) uit het paraffineblok te snijden. Vervolgens wordt het monster gemonteerd, waarbij de coupes op glazen glaasjes worden geplaatst voor daaropvolgende kleuring en microscopische analyse.
Controleer ten slotte de kwaliteit van de histologie: Evalueer de eerste coupes onder een microscoop om er zeker van te zijn dat ze goed gefixeerd en verwerkt zijn. Pas de protocollen waar nodig aan op basis van het weefseltype en de waargenomen kwaliteit.
FFPE-weefsels kunnen worden gebruikt om RNA, DNA en eiwitten te verkrijgen en om tekenen van kanker of andere ziekten te ontdekken. Ze kunnen jarenlang worden bewaard en vormen een essentieel onderdeel van de manier waarop onderzoekers en artsen weefselmonsters gebruiken voor diagnose en onderzoek.
Wat zijn veelvoorkomende problemen en uitdagingen met FFPE-weefsel?
Formalin Gefixeerde, Paraffine Ingebedde (FFPE) weefselmonsters worden veel gebruikt in onderzoek en diagnostiek, maar ze brengen verschillende uitdagingen en veelvoorkomende problemen met zich mee:
- Afbraak van biomoleculen: Langdurige fixatie kan leiden tot degradatie van DNA, RNA en eiwitten, waardoor het moeilijk wordt om nucleïnezuren of eiwitten van hoge kwaliteit te extraheren voor downstream-toepassingen. Correcte fixatie (het vermijden van onder- en overfixatie) is essentieel voor weefselconservering.
- Antigeen-afscherming: Het fixatieproces kan antigene sites maskeren, waardoor antilichaambinding in immunohistochemie en andere immunologische testen minder effectief is. Hiervoor is vaak antigeen retrieval nodig, een procedure waarbij het maskeren van een epitoop ongedaan wordt gemaakt en de binding tussen epitoop en antilichaam wordt hersteld. De antigeniciteit wordt echter niet altijd volledig hersteld.
- Variabele fixatiekwaliteit: Verschillen in fixatietijden en -condities kunnen leiden tot inconsistente monsterkwaliteit, wat de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van resultaten beïnvloedt. Gebruik betrouwbare fixatieprotocollen en vermijd onder- en overfixatie.
- DNA-schade en -fragmentatie: Formalinefixatie van FFPE monsters kan verschillende soorten DNA-schade veroorzaken, waaronder cytosine deaminatie (C naar T mutaties), oxidatieve schade (bijv. 8-oxo-guanine wat leidt tot G naar T mutaties), evenals fysieke verstoringen zoals inkepingen, gaten en abasische sites die de DNA polymerase activiteit belemmeren. Het formalinefixatieproces kan fragmentatie van DNA veroorzaken, wat genetische en genomische analyses zoals PCR en sequencing bemoeilijkt.
- RNA-kwaliteit: RNA geëxtraheerd uit FFPE-weefsels is vaak gefragmenteerd en chemisch gemodificeerd, waardoor het een uitdaging is om transcriptomische analyses van hoge kwaliteit uit te voeren.
- Eiwitmodificaties: Formaline kan chemische modificaties in eiwitten veroorzaken, waardoor hun structuur en functie aangetast worden, wat proteomische analyses kan verstoren.
- Monsterverwerkingsartefacten: Tijdens het inbedden en snijden kunnen mechanische stress en hitte artefacten introduceren en verdere schade aan het weefsel veroorzaken.
- Variabiliteit tussen batches: Variaties in fixatie- en inbedprotocollen tussen verschillende partijen kunnen leiden tot significante variabiliteit in de resultaten, wat vergelijkingen tussen studies bemoeilijkt.
- Opslagproblemen: Langdurige opslag van FFPE-blokken kan na verloop van tijd leiden tot extra degradatie en verlies van nucleïnezuurintegriteit, wat de levensvatbaarheid van archiefmonsters voor retrospectieve studies beïnvloedt.
Kruiskoppeling: Formalinefixatie veroorzaakt verknoping van eiwitten en nucleïnezuren, wat moleculaire analyse kan belemmeren en de nauwkeurigheid van immunohistochemie en andere analyses kan beïnvloeden.
Het gebruik van geoptimaliseerde protocollen, zorgvuldige monsterbehandeling en het toepassen van geavanceerde technieken helpen de kwaliteit en betrouwbaarheid van gegevens verkregen uit FFPE-weefsels te verbeteren.
Wat is het verschil tussen FFPE en bevroren weefsel?
FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) weefsel wordt geconserveerd met formaline om het weefsel te fixeren en vervolgens ingebed in paraffinewas, waardoor het langdurig bij kamertemperatuur kan worden bewaard met behoud van de weefselmorfologie. Ingevroren weefsel wordt daarentegen snel geconserveerd door invriezen, waardoor de integriteit van nucleïnezuren en eiwitten beter behouden blijft, maar het moet wel bij zeer lage temperaturen bewaard worden.
Welke chemicaliën worden gebruikt voor het inbedden van FFPE?
De chemicaliën die gebruikt worden voor het inbedden van FFPE omvatten normaliter formaline voor fixatie en paraffinewas voor het inbedden. Voor FFPE-inbedding worden weefsels meestal gefixeerd met ofwel 10% (v/v) neutraal gebufferde formaline (FA) of een vers bereide 4% (w/v) formaldehydeoplossing (PFA) gemaakt van paraformaldehydepoeder. Formaline, een oplossing van formaldehyde in water, wordt gebufferd tot een neutrale pH om de weefselmorfologie te behouden en overmatige verknoping te voorkomen. De oplossing op basis van paraformaldehyde zorgt ook voor effectieve fixatie door cross-linking van eiwitten, waardoor de weefselstructuur wordt gestabiliseerd voor latere inbedding in paraffine. Deze chemicaliën zijn essentieel voor het behoud van weefselintegriteit en morfologie tijdens het fixatie- en inbeddingsproces.
Hoe wordt de paraffine uit FFPE-monsters verwijderd?
Om paraffine van FFPE monsters te verwijderen, worden de weefseldoorsneden meestal onderworpen aan een reeks xyleenwassingen, gevolgd door rehydratie via een reeks alcoholen en ten slotte water. Omdat xyleen zeer giftig is en gezondheidsrisico's met zich meebrengt zoals ademhalingsproblemen, huidirritatie en mogelijke langetermijneffecten bij herhaalde blootstelling, is ultrasone paraffineverwijdering in opkomst als een veelbelovend alternatief in veel laboratoria. Deze methode maakt gebruik van intense ultrasone golven om paraffine efficiënt en veilig te verwijderen zonder dat giftige oplosmiddelen zoals xyleen nodig zijn, waardoor het risico voor laboratoriumpersoneel wordt verminderd en een veiligere werkomgeving wordt gecreëerd.
Hoe lang moet ik mijn weefsels fixeren voor een goede kwaliteit van FFPE-monsters?
Algemene aanbevelingen voor de fixatieduur suggereren doorgaans om weefselmonsters 24 tot 48 uur in formaline te fixeren. Deze duur is over het algemeen voldoende om weefselmorfologie en cellulaire structuren te behouden terwijl overfixatie wordt geminimaliseerd, wat kan leiden tot overmatige verknoping en degradatie van nucleïnezuren en eiwitten. De optimale fixatietijd kan echter variëren afhankelijk van de grootte en het type weefsel, waarbij kleinere of delicatere monsters kortere fixatietijden vereisen. Het is cruciaal om een balans te vinden tussen adequate fixatie om weefselautolyse en -degradatie te voorkomen en tegelijkertijd langdurige fixatie te vermijden die downstream moleculaire analyses kan bemoeilijken.