FFPE-monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit: eiwitextractie en afschuiving van nucleïnezuren
Met de ultrasone processor UIP400MTP met hoge verwerkingscapaciteit pakt Hielscher Ultrasonics de uitdagingen aan van de voorbereiding van in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed (FFPE) weefsel. Ontdek hoe ultrasone behandeling grote aantallen FFPE-monsters verwerkt voor FFPE-deparaffinering, weefsellyse, homogenisatie, eiwitextractie en DNA/RNA-afschuiving! Profiteer van ultrasone voorbereiding van FFPE-weefsel – verwerking van grote aantallen monsters in multiwellplaten! Verkrijg hoogwaardige monsters en verwerk grote aantallen monsters voor betrouwbare onderzoeksresultaten! En bespaar tot slot ook tijd en geld!
FFPE-monstervoorbereiding vereenvoudigd door sonicatie met hoge verwerkingscapaciteit
Fixatie in formaline en inbedding in paraffine (FFPE) is de meest gebruikte methode voor het conserveren en archiveren van vaste weefsels. De extractie van biomoleculen uit FFPE-weefselmonsters brengt vaak aanzienlijke uitdagingen met zich mee door de kwaliteit van de opgeslagen monsters. Deze monsters, die van onschatbare waarde zijn voor de moleculaire biologie en het klinisch onderzoek, vormen een rijke bron van biologische informatie voor retrospectieve studies en de validatie van diagnostische biomarkers. Hoewel het proces van fixatie in formaline en inbedding in paraffine de weefselarchitectuur en morfologie behoudt, bemoeilijkt het de extractie van hoogwaardige nucleïnezuren en eiwitten. Formaline veroorzaakt kruisverbindingen tussen nucleïnezuren en eiwitten, wat leidt tot moleculaire fragmentatie en chemische modificaties. Ontdek hoe de ultrasone processor UIP400MTP met hoge verwerkingscapaciteit de uitdagingen van FFPE-monstervoorbereiding overwint!
Ultrasone processor voor efficiënte FFPE-monstervoorbereiding
- Gebruiksvriendelijke workflow: vereenvoudigde processen die gebruiksvriendelijk zijn.
- Deparaffinering, eiwitextractie, DNA / RNA-afschuiving
- Snelle verwerking met hoge verwerkingscapaciteit: efficiënte verwerking van multiwellplaten.
- Effectieve deparaffinering: verbeterde solubilisatie van eiwitten.
- Niet-toxische oplosmiddelen: vermijdt het gebruik van schadelijke organische oplosmiddelen zoals xyleen.
Sonicator UIP400MTP met hoge verwerkingscapaciteit voor de verwerking van FFPE-monsters met hoge verwerkingscapaciteit in multiwellplaten
Vooruitgang in technieken voor eiwitextractie uit FFPE-weefsel
Hielscher Ultrasonics pakt de uitdagingen aan van FFPE-monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit. Sonicatie gebruikt ultrasone golven om mechanische trillingen en gerichte cavitatie te genereren, waardoor cellulaire structuren effectief worden ontwricht en de solubilisatie van biomoleculen wordt verbeterd. Deze techniek is populair geworden doordat zij de efficiëntie en opbrengst van nucleïnezuur- en eiwitextractie uit FFPE-weefsels kan verhogen en DNA- en RNA-afschuiving voor bibliotheekvoorbereiding mogelijk maakt. Het is zeer belangrijk te benadrukken dat ultrasone behandeling met de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten de integriteit van deze biomoleculen voor vervolgtoepassingen behoudt.
Afschuiving van nucleïnezuren met ultrasone behandeling met hoge verwerkingscapaciteit
De ultrasone processor UIP400MTP voor multiwellplaten, bedoeld voor toepassingen met hoge verwerkingscapaciteit, tilt de voorbereiding van FFPE-monsters naar een nieuw niveau. Deze sonicatiemethode voor multiwellplaten biedt een efficiënte en betrouwbare oplossing voor de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters. Zij maakt snelle en reproduceerbare extractie mogelijk van DNA, RNA en eiwitten, die essentieel zijn voor diverse analytische technieken, waaronder next-generation sequencing (NGS), kwantitatieve PCR en proteomische analyses. Optimalisatie van sonicatieparameters, zoals amplitude, duur en temperatuur, verbetert de kwaliteit en hoeveelheid van de geëxtraheerde biomoleculen verder.
De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten biedt aanzienlijke voordelen voor de fragmentatie en afschuiving van DNA en RNA uit FFPE-weefsel. Een van de opvallendste kenmerken van dit systeem is het vermogen om een nauw bereik van DNA- en RNA-fragmentgroottes te bereiken, waarbij de sonicatie-intensiteit nauwkeurig kan worden ingesteld om korte fragmenten van 150–200 basenparen (bp) of langere fragmenten van 15–20 kilobasenparen (kbp) te verkrijgen. Deze veelzijdigheid maakt de UIP400MTP onmisbaar voor sequencingtoepassingen met zowel korte als lange reads en waarborgt hoogwaardige resultaten voor next-generation sequencing (NGS) en whole-genome sequencing (WGS). De nauwkeurige controle over de fragmentgrootte is cruciaal voor onderzoekers in alle gebieden van de genomica, omdat monsters hierdoor volgens specificaties kunnen worden voorbereid.
Neem contact met ons op voor geavanceerde oplossingen voor FFPE-weefsel
Ontdek de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten voor efficiënte terugwinning van biomoleculen uit FFPE-monsters, met behoud van de integriteit van geëxtraheerde nucleïnezuren en eiwitten en met gewaarborgde reproduceerbaarheid van de resultaten. Deze technologie sluit naadloos aan op andere preparatieve en analytische workflows en stroomlijnt en verbetert moleculair onderzoek met FFPE-weefselarchieven.
Fixatieven en hun effecten
Fixatie is een cruciale stap in de monstervoorbereiding die cellulaire structuren behoudt, biochemische reacties stopt en afbraak voorkomt. Afhankelijk van de specifieke experimentele vereisten worden verschillende fixatieven gebruikt. De twee meest gebruikte fixatieven zijn formaldehyde en paraformaldehyde, die kruisverbindingen tussen eiwitten en nucleïnezuren vormen en zo de morfologie en antigeniciteit van cellen en weefsels behouden. Andere fixatieven, zoals ethanol, methanol en glutaaraldehyde, worden voor specifieke toepassingen gebruikt.
Fixatieven op basis van formaldehyde en paraformaldehyde vormen methyleenbruggen tussen aminogroepen, wat leidt tot kruisverbindingen tussen eiwitten. Dit proces immobiliseert cellulaire componenten effectief, waardoor hun integriteit tijdens daaropvolgende analysestappen behouden blijft. De effecten van deze fixatieven kunnen worden beïnvloed door factoren zoals concentratie, pH en temperatuur. Optimalisatie van deze parameters is cruciaal om een optimaal behoud van cellulaire structuren te waarborgen.
Voordelen van ultrasone FFPE-voorbereiding
Ultrasone behandeling is een krachtige techniek voor het ontsluiten van gefixeerde cellen en weefsels die conventionele technieken overtreft. Zij biedt verschillende opmerkelijke voordelen ten opzichte van traditionele lysemethoden:
- Snelheid en efficiëntie: Ultrasone lyse zorgt voor snelle ontsluiting van cellen en weefsels en verkort de verwerkingstijd aanzienlijk ten opzichte van mechanische of chemische lysemethoden. Hoogfrequente geluidsgolven die door de ultrasone sonde worden gegenereerd, creëren mechanische afschuifkrachten die de gefixeerde cellulaire structuren ontwrichten. Dankzij deze snelle en efficiënte ontsluiting kunnen onderzoekers in korte tijd grote monstervolumes verwerken.
- Mild en instelbaar: Ultrasone lyse biedt een mild ontsluitingsmechanisme dat schade aan gevoelige biomoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren en enzymen minimaliseert. In tegenstelling tot mechanische methoden die overmatige warmte of afschuifkrachten genereren, gebruikt ultrasone lyse gecontroleerde cavitatie om cellen te ontsluiten, terwijl de integriteit en functionaliteit van de intracellulaire componenten behouden blijven.
- Veelzijdigheid: Ultrasone lyse kan worden toegepast op monsters die met verschillende fixatieven zijn gefixeerd, waardoor onderzoekers met een breed scala aan gefixeerde monsters kunnen werken. Of formaldehyde, paraformaldehyde of alternatieve fixatieven worden gebruikt, ultrasone lyse zorgt consequent voor efficiënte ontsluiting en waarborgt een optimale terugwinning van cellulaire componenten.
- Hoge opbrengst en kwaliteit: Ultrasone lyse maakt hoge opbrengsten van intacte cellulaire componenten mogelijk doordat gefixeerde cellen en weefsels gelijkmatig worden ontsloten. Hierdoor kunnen vervolgtoepassingen, zoals eiwitanalyse, nucleïnezuurextractie en enzymatische assays, betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren.
- Geschikt voor automatisering: Ultrasone lyse kan eenvoudig in geautomatiseerde systemen worden geïntegreerd, waardoor monsterverwerking met hoge verwerkingscapaciteit mogelijk wordt. Dankzij deze compatibiliteit kunnen onderzoekers hun workflow stroomlijnen en hun productiviteit verhogen, met name bij grootschalige studies.
Sonicator UIP400MTP voor 96-wellplaten voor de sonicatie van microtiter- en multiwellplaten
Ultrasone lyse heeft de ontsluiting van gefixeerde cellen en weefsels ingrijpend veranderd en biedt talrijke voordelen ten opzichte van traditionele lysemethoden. De snelheid, efficiëntie, selectiviteit, veelzijdigheid, hoge opbrengst en geschiktheid voor automatisering maken deze techniek tot een onmisbaar hulpmiddel in moleculair-biologisch en biotechnologisch onderzoek. Met zowel contactloze sonicators als sonicators met een sonde biedt Hielscher Ultrasonics de meest geschikte ultrasone homogenisator voor uw toepassing in de levenswetenschappen. Of u nu afzonderlijke monsters, meerdere monsters of zeer grote aantallen monsters gelijktijdig wilt verwerken, wij bieden u de beste sonicator die aansluit op uw onderzoeks- en diagnostische vereisten.
Lees meer over de contactloze sonicators van Hielscher voor de voorbereiding van meerdere monsters en monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit!
- eenmalige investering
- gebruik uw eigen verbruiksartikelen
- geen terugkerende kosten voor fabrikantgebonden accessoires en verbruiksartikelen
- hoge verwerkingscapaciteit
- nauwkeurige regeling
- geavanceerde technologie
- betrouwbaarheid & robuustheid
- instelbare, nauwkeurige procesregeling
- industriële kwaliteit: kan continu 24/7 worden gebruikt
- eenvoudig en veilig te bedienen
- onderhoudsarm
Lees meer over de toepassingen van sonicators in de levenswetenschappen!
Platensonicator UIP400MTP voor alle 96-wellplaten, microtiterplaten en multiwellplaten.
Ontwerp, productie en advies – kwaliteit uit Duitsland
De ultrasone processors van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Dankzij hun robuustheid en eenvoudige bediening kunnen onze ultrasone processors soepel in industriële installaties worden geïntegreerd. De ultrasone processors van Hielscher kunnen zware omstandigheden en veeleisende omgevingen gemakkelijk aan.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op ultrasone processors met hoge prestaties met geavanceerde technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de ultrasone processors van Hielscher CE-conform en voldoen ze aan de vereisten van UL, CSA en RoHs.
Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!
UIP400MTP ultrasone processor: FFPE-monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit in multiwellplaten
Veelgestelde vragen
Hieronder beantwoorden we veelgestelde vragen die relevant zijn voor de voorbereiding van FFPE-weefsel en de ultrasone behandeling van FFPE-monsters.
Hoe wordt FFPE-weefsel voorbereid?
Stappen voor de voorbereiding van FFPE-weefsel: zorgvuldige behandeling en verwerking van vers weefsel zijn cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige FFPE-monsters. Het waarborgen van het behoud van de cellulaire architectuur, nucleïnezuren en eiwitten is essentieel voor nauwkeurige vervolganalyses. Elke stap – van afname tot inbedding – vereist precisie om de integriteit van het monster te behouden voor diverse analyses, waaronder histologisch onderzoek, immunohistochemie en moleculaire studies. Wanneer dit fixatie- en inbeddingsproces correct wordt uitgevoerd, waarborgt het dat het geconserveerde weefsel de in-vivotoestand nauwkeurig weerspiegelt, waardoor betrouwbare diagnostische en onderzoeksresultaten mogelijk worden.
Wij nemen u mee door de 6 belangrijkste stappen van het inbeddingsproces van FFPE-weefselmonsters.
- Weefselafname
Biopten van levende zoogdieren en weefselkweken zijn beide geschikte bronnen voor het verkrijgen van vers weefsel voor FFPE-monstervoorbereiding.
Het is belangrijk een aseptische techniek te gebruiken: gebruik steriele instrumenten en handschoenen om contaminatie te voorkomen. Neem weefsels bij voorkeur af in een steriele omgeving, zoals een operatiekamer of een laminaire-flowkast.
Omdat het preparaat zeer kwetsbaar is, is behoedzame behandeling essentieel: beperk vertragingen in de verwerking tot een minimum en begin onmiddellijk na de excisie met de daaropvolgende weefselverwerking. Dit is cruciaal om autolyse en afbraak te voorkomen. Houd het weefsel op kamertemperatuur; vermijd bevriezing, omdat die ijskristalvorming en weefselschade kan veroorzaken. - Weefselfixatie
Eerst wordt het weefsel behandeld met een fixatiefoplossing: gebruik 10% neutraal gebufferde formaline (NBF), wat overeenkomt met 4% formaldehyde in water, gebufferd tot een neutrale pH.
Dompel het weefsel volledig onder in formaline. Zorg voor een volumeverhouding tussen fixatief en weefsel van ten minste 10:1. De fixatieduur varieert doorgaans van 6 tot 24 uur, afhankelijk van het weefseltype en de grootte. Het is belangrijk dat het fixatief het weefsel grondig kan doordringen. Overfixatie kan echter leiden tot kruisverbindingen die het vrijmaken van antigenen bemoeilijken, terwijl onderfixatie kan resulteren in slechte weefselconservering. - Weefsel bijsnijden
Snijd het weefsel vervolgens bij tot een dikte van ongeveer 3–5 mm, zodat het fixatief voldoende kan doordringen. Zorg voor een juiste oriëntatie van het weefsel om relevante histologische structuren vast te leggen. Dit vergemakkelijkt het extractieproces wanneer het weefsel later voor analyse wordt gebruikt. - Verwerking van het gefixeerde monster
Nu moet het gefixeerde weefsel worden gedehydrateerd: na fixatie moet het weefsel worden gedehydrateerd om een grondige doordringing met paraffinewas te waarborgen. Voer het weefsel door een oplopende reeks ethanolconcentraties (70%, 80%, 90% en 100%) om water te verwijderen.
Ophelderen met xyleen: paraffinewas is onoplosbaar in water, maar oplosbaar in xyleen. Daarom moet het water in het weefsel door xyleen worden vervangen. Xyleen zelf is echter onoplosbaar in water, maar oplosbaar in alcohol, waardoor een tussenstap nodig is waarin water eerst door alcohol wordt vervangen. Dompel het weefsel onder in xyleen of een xyleenvervanger om ethanol te verwijderen en het weefsel voor te bereiden op paraffine-infiltratie.
Infiltratie met paraffine: bed het weefsel in gesmolten paraffinewas in en zorg voor volledige infiltratie. Deze stap omvat doorgaans meerdere verversingen van de paraffine om een grondige impregnatie te waarborgen. - Inbedding van het weefsel
In deze stap wordt het weefsel tot een weefselblok gevormd: plaats het weefsel in een mal met de gewenste oriëntatie en giet er gesmolten paraffine overheen. Laat de paraffine stollen door afkoeling bij kamertemperatuur of op een koude plaat. - Coupes snijden en op objectglaasjes aanbrengen
Microtomie: gebruik een microtoom om dunne coupes (doorgaans 4–5 micrometer) van het paraffineblok te snijden. Vervolgens wordt het monster op objectglaasjes aangebracht door de coupes erop te plaatsen voor daaropvolgende kleuring en microscopische analyse.
Controleer tot slot de kwaliteit van de histologie: beoordeel de eerste coupes onder een microscoop om te controleren of de fixatie en verwerking correct zijn uitgevoerd. Pas de protocollen zo nodig aan op basis van het weefseltype en de waargenomen kwaliteit.
FFPE-weefsels kunnen worden gebruikt om RNA, DNA en eiwitten terug te winnen en om aanwijzingen voor kanker of andere ziekten te ontdekken. Ze kunnen jarenlang worden bewaard en vormen een essentieel onderdeel van de manier waarop onderzoekers en artsen weefselmonsters inzetten voor diagnostiek en onderzoek.
Wat zijn veelvoorkomende problemen en uitdagingen bij FFPE-weefsel?
In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters worden veel gebruikt in onderzoek en diagnostiek, maar brengen verschillende uitdagingen en veelvoorkomende problemen met zich mee:
- Afbraak van biomoleculen: Langdurige fixatie kan leiden tot afbraak van DNA, RNA en eiwitten, waardoor het moeilijk wordt om hoogwaardige nucleïnezuren of eiwitten voor vervolgtoepassingen te extraheren. Correcte fixatie (waarbij onder- en overfixatie worden vermeden) is essentieel voor weefselconservering.
- Antigeenmaskering: Het fixatieproces kan antigene plaatsen maskeren, waardoor de effectiviteit van antilichaambinding bij immunohistochemie en andere immunologische assays afneemt. Dit vereist vaak het vrijmaken van antigenen, een procedure waarbij de maskering van een epitoop wordt opgeheven en de binding tussen epitoop en antilichaam wordt hersteld. De volledige antigeniciteit kan echter niet altijd worden hersteld.
- Variabele fixatiekwaliteit: Verschillen in fixatieduur en omstandigheden kunnen leiden tot inconsistente monsterkwaliteit, wat de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van resultaten beïnvloedt. Gebruik betrouwbare fixatieprotocollen en vermijd onder- en overfixatie.
- DNA-schade en fragmentatie: Fixatie van FFPE-monsters in formaline kan verschillende soorten DNA-schade veroorzaken, waaronder cytosinedeaminering (C-naar-T-mutaties), oxidatieve schade (bijv. 8-oxo-guanine dat tot G-naar-T-mutaties leidt) en fysieke beschadigingen zoals enkelstrengsbreuken, hiaten en abasische plaatsen die de activiteit van DNA-polymerase belemmeren. Het fixatieproces met formaline kan DNA-fragmentatie veroorzaken, waardoor genetische en genomische analyses zoals PCR en sequencing worden bemoeilijkt.
- RNA-kwaliteit: RNA dat uit FFPE-weefsels wordt geëxtraheerd, is vaak gefragmenteerd en chemisch gemodificeerd, waardoor hoogwaardige transcriptomische analyses moeilijk uit te voeren zijn.
- Eiwitmodificaties: Formaline kan chemische modificaties in eiwitten veroorzaken die hun structuur en functie beïnvloeden en proteomische analyses kunnen verstoren.
- Artefacten door monsterverwerking: Tijdens het inbedden en het snijden van coupes kunnen mechanische belasting en warmte artefacten veroorzaken en het weefsel verder beschadigen.
- Variabiliteit tussen batches: Variaties in fixatie- en inbeddingsprotocollen tussen verschillende batches kunnen tot aanzienlijke variabiliteit in de resultaten leiden, waardoor vergelijkingen tussen studies worden bemoeilijkt.
- Opslagproblemen: Langdurige opslag van FFPE-blokken kan na verloop van tijd tot verdere afbraak en verlies van nucleïnezuurintegriteit leiden, wat de bruikbaarheid van archiefmonsters voor retrospectieve studies beïnvloedt.
Kruisverbindingen: Fixatie in formaline veroorzaakt kruisverbindingen tussen eiwitten en nucleïnezuren, wat moleculaire analyse kan belemmeren en de nauwkeurigheid van immunohistochemie en andere assays kan beïnvloeden.
Het gebruik van geoptimaliseerde protocollen, zorgvuldige monsterbehandeling en de toepassing van geavanceerde technieken helpen de kwaliteit en betrouwbaarheid van gegevens uit FFPE-weefsels te verbeteren.
Wat is het verschil tussen FFPE-weefsel en bevroren weefsel?
FFPE-weefsel (in formaline gefixeerd, in paraffine ingebed) wordt geconserveerd door het weefsel met formaline te fixeren en vervolgens in paraffinewas in te bedden. Hierdoor is langdurige opslag bij kamertemperatuur mogelijk met behoud van de weefselmorfologie. Bevroren weefsel wordt daarentegen snel geconserveerd door bevriezing, waardoor de integriteit van nucleïnezuren en eiwitten beter behouden blijft, maar opslag bij zeer lage temperaturen vereist is.
Welke chemicaliën worden gebruikt voor FFPE-inbedding?
De chemicaliën die voor FFPE-inbedding worden gebruikt, omvatten normaal gesproken formaline voor fixatie en paraffinewas voor inbedding. Voor FFPE-inbedding worden weefsels doorgaans gefixeerd met 10% (v/v) neutraal gebufferde formaline (FA) of een vers bereide 4% (w/v) formaldehydeoplossing (PFA) die uit paraformaldehydepoeder wordt gemaakt. Formaline, een oplossing van formaldehyde in water, wordt gebufferd tot een neutrale pH om de weefselmorfologie te behouden en overmatige vorming van kruisverbindingen te voorkomen. De oplossing op basis van paraformaldehyde zorgt eveneens voor effectieve fixatie door kruisverbindingen tussen eiwitten te vormen, waardoor de weefselstructuur wordt gestabiliseerd voor daaropvolgende inbedding in paraffinewas. Deze chemicaliën zijn essentieel voor het behoud van de integriteit en morfologie van het weefsel tijdens het fixatie- en inbeddingsproces.
Hoe wordt paraffine uit FFPE-monsters verwijderd?
Om paraffine uit FFPE-monsters te verwijderen, worden de weefselcoupes doorgaans onderworpen aan een reeks wasstappen met xyleen, gevolgd door rehydratie via een aflopende reeks alcoholconcentraties en ten slotte water. Omdat xyleen zeer toxisch is en gezondheidsrisico’s met zich meebrengt, zoals ademhalingsproblemen, huidirritatie en mogelijke langetermijneffecten bij herhaalde blootstelling, ontwikkelt ultrasone paraffineverwijdering zich in veel laboratoria tot een veelbelovend alternatief. Deze methode gebruikt intense ultrasone golven om paraffine efficiënt en veilig te verwijderen zonder toxische oplosmiddelen zoals xyleen, waardoor het risico voor laboratoriumpersoneel afneemt en een veiligere werkomgeving ontstaat.
Hoe lang moet ik mijn weefsels fixeren voor een goede kwaliteit van FFPE-monsters?
Algemene aanbevelingen voor de fixatieduur adviseren doorgaans om weefselmonsters gedurende 24 tot 48 uur in formaline te fixeren. Deze duur is over het algemeen voldoende om de weefselmorfologie en cellulaire structuren te behouden en tegelijkertijd overfixatie te minimaliseren, die tot overmatige vorming van kruisverbindingen en afbraak van nucleïnezuren en eiwitten kan leiden. De optimale fixatieduur kan echter variëren afhankelijk van de grootte en het type weefsel, waarbij kleinere of kwetsbaardere monsters een kortere fixatieduur vereisen. Het is cruciaal om voldoende fixatie te waarborgen om weefselautolyse en afbraak te voorkomen, en tegelijk langdurige fixatie te vermijden die daaropvolgende moleculaire analyses zou kunnen bemoeilijken.