Proteomicsprotocol: contactloze sonicatie verbetert de voorbereiding van peptidemonsters voor MS
Bottom-up proteomics is een hoeksteen geworden van moderne biomarkerontdekking, structurele biologie en klinische diagnostiek. Door eiwitten vóór de analyse met massaspectrometrie (MS) tot peptiden te verteren, kunnen onderzoekers een uitgebreidere sequentiedekking en betrouwbaardere kwantificering bereiken. De voorbereiding van zeer complexe biologische monsters voor MS blijft echter technisch veeleisend. Recente methodologische ontwikkelingen laten zien hoe gecontroleerde ultrasone verwerking – specifiek met de contactloze VialTweeter Multi-Tube sonicator en de microplaatsonicator UIP400MTP – deze workflow aanzienlijk kan stroomlijnen, de reproduceerbaarheid kan verbeteren en veelvoorkomende knelpunten bij instrumenten kan voorkomen.
Hier vindt u een gedetailleerd protocol voor monstervoorbereiding om peptiden van geschikte grootte voor analyse met MS te verkrijgen.
Wie zou contactloze sonicatie moeten gebruiken voor de voorbereiding van peptidemonsters?
- Laboratoria voor bottom-up-proteomics en ontdekkingsonderzoek: Onderzoekers die zeer complexe monsters voorbereiden voor workflows met LC-MS of MALDI en een consistente peptideterugwinning met hoge opbrengst uit uiteenlopende biologische matrices nodig hebben.
- Gebruikers van S-Trap™ en suspension trapping: Teams die gebruikmaken van zuivering met microkolommen en gecontroleerde DNA-afschuiving nodig hebben om verstopping van de kolommen te voorkomen en soepel laden en verteren van monsters te waarborgen.
- Klinische en translationele onderzoeksgroepen: Laboratoria die weefsel, cellen, plasma, serum of cerebrospinaal vocht verwerken en waarvoor reproduceerbaarheid tussen batches en monsterintegriteit cruciaal zijn.
- Teams voor kwantitatieve en gerichte MS: Laboratoria die strikt vergelijkende onderzoeken uitvoeren, waarbij sondesonicators risico’s op kruisbesmetting introduceren die de kwantificering van peptiden in lage concentraties zouden kunnen verstoren.
- Centrale onderzoeksfaciliteiten en activiteiten met hoge verwerkingscapaciteit: Groepen die meerdere biologische replicaten gelijktijdig verwerken en profiteren van bloksonicatie van meerdere gesloten buisjes met de VialTweeter, waardoor sondes niet meer hoeven te worden gereinigd, de tijd voor handmatige werkzaamheden afneemt en aseptische omstandigheden behouden blijven.
- Onderzoekers van PTM’s en eiwitstructuren: Onderzoekers die een milde, temperatuurgecontroleerde verwerking nodig hebben om labiele modificaties te behouden en de sequentiedekking tijdens cellyse en homogenisatie te maximaliseren.
Sonicator voor meerdere monsters “VialTweeter” voor de contactloze voorbereiding van meerdere afgesloten monsterflesjes voor proteomics
Protocoloverzicht: van weefsel en cellen tot peptiden die klaar zijn voor MS
De veelgebruikte workflow voor bottom-up proteomics die Wojtkiewicz et al. beschrijven, biedt een robuuste, schaalbare methode voor de voorbereiding van peptidemonsters uit uiteenlopende biologische matrices. Uitgaande van 50–100 mg snel ingevroren weefsel of 1–20 miljoen cellen integreert het protocol technologie voor suspension trapping (S-Trap™) om detergentia, zouten en verontreinigingen efficiënt te verwijderen vóór de enzymatische vertering.
Na lyse, eiwitkwantificering, reductie en alkylering wordt het monster aangezuurd en op een spinkolom van S-Trap™ geladen, waar vertering met trypsine/lysC plaatsvindt. De resulterende peptiden worden geëlueerd, gedroogd en onderworpen aan analyse met LC-MS. Bij toepassing op 50 mg menselijk hartweefsel levert deze workflow consistent voldoende peptiden op voor 30–40 injecties, waarbij per run meer dan 4.000 unieke eiwitten worden geïdentificeerd. Hoewel de chemie en de zuivering met kolommen goed zijn beschreven, hangt het succes van de procesketen sterk af van de eerste stappen voor fysieke ontsluiting en het beheersen van DNA.
Het protocol beveelt het gebruik van de VialTweeter Multi-Tube Sonicator aan om de cellen door sonicatie te lyseren en DNA door afschuiving te fragmenteren – beide stappen zijn cruciaal voor peptideanalyse.
De VialTweeter soniceert afgesloten Eppendorf-buisjes van 1,0, 1,5 en 2,0mL en diverse NUNC-monsterflesjes
Ultrasone cel- en weefsellyse voor eiwitextractie
In de workflow voor bottom-up-proteomics is sonicatie een belangrijke stap bij de lyse van celmonsters om eiwitten te extraheren voor de daaropvolgende massaspectrometrische analyse. Nadat SDS-cellysebuffer aan de celpellet is toegevoegd, worden de monsters met de VialTweeter Multi-Tube Sonicator ultrasoon verwerkt. Het protocol gebruikt microcentrifugebuisjes van 1,5 mL en schrijft voor dat de sonicator op 30% vermogen wordt ingesteld, met 10 seconden aan en 10 seconden uit, gedurende 3 cycli. Na een wachttijd van 1 minuut wordt de cyclus nog twee keer herhaald. De monsters worden continu met ijs gekoeld.
Dit proces helpt niet alleen bij de celontsluiting, maar is specifiek noodzakelijk om het genomische DNA dat tijdens de lyse vrijkomt door afschuiving te fragmenteren. Effectieve DNA-afschuiving is cruciaal om de viscositeit van het monster te verlagen en verstopping van de S-Trap™-kolommen te voorkomen, en zo optimale eiwitterugwinning en betrouwbare daaropvolgende peptidevertering te waarborgen.
De cruciale rol van ultrasone DNA-afschuiving
Een van de meest voorkomende problemen in workflows met S-Trap™ is verstopping van de kolom, die vrijwel uitsluitend wordt veroorzaakt door genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht dat tijdens de homogenisatie van cellen of weefsel vrijkomt. Intact DNA verhoogt de viscositeit van het monster sterk, houdt peptiden vast en blokkeert het microporeuze sorbensbed van S-Trap™.
Ultrasone verwerking lost dit probleem op door DNA mechanisch te fragmenteren tot kleine, oplosbare fragmenten. Door gecontroleerde akoestische energie toe te passen, fragmenteert de VialTweeter nucleïnezuren efficiënt door afschuiving zonder overmatige warmte te genereren of vreemde verontreinigingen te introduceren. Deze viscositeitsverlaging zorgt voor soepel laden van monsters, consistente doorstroomdebieten en een ononderbroken verteringskinetiek.
Geoptimaliseerde sonicatieparameters voor de VialTweeter
Het protocol schrijft een zeer reproduceerbaar sonicatieschema voor dat is geoptimaliseerd voor de integriteit van biologische monsters en compatibiliteit met de daaropvolgende analyse met MS. Voor monsters in microcentrifugebuisjes van 1,5mL die met de contactloze bloksonicator Hielscher VialTweeter worden verwerkt, zorgen de volgende parameters voor lyse en optimale DNA-afschuiving met behoud van de eiwitstructuur:
- Amplitude: 30% vermogen
- Cycluspatroon: 10 seconden AAN / 10 seconden UIT
- Duur: 3 cycli (10sec AAN/10sec UIT) → 1 minuut rust op ijs → nog 2 keer herhalen
- Temperatuurbeheersing: monsters worden tijdens de verwerking op ijs geplaatst om thermische denaturatie en voortijdige enzymatische activiteit te voorkomen
Deze aanpak met gepulseerde sonicatie voorkomt plaatselijke oververhitting, minimaliseert peptideoxidatie en zorgt voor een gelijkmatige akoestische blootstelling van alle monsterflesjes. De opstelling met gesloten buisjes maakt bovendien reiniging van de sonde tussen monsters overbodig, waardoor de tijd voor handmatige werkzaamheden en de variabiliteit tussen gebruikers drastisch afnemen.
Belangrijkste voordelen voor moderne proteomicsworkflows
Integratie van de VialTweeter in uw procesketen voor bottom-up-proteomics biedt verschillende operationele en wetenschappelijke voordelen:
- Consistente DNA-fragmentatie: Een gelijkmatige toevoer van akoestische energie aan alle monsterflesjes zorgt voor reproduceerbare viscositeitsverlaging en voorkomt variabiliteit tussen batches bij het laden van S-Trap™.
- Behoud van labiele modificaties: Verwerking bij lage temperatuur in een ijsbad beschermt posttranslationele modificaties (PTM’s) en voorkomt door warmte veroorzaakte eiwitaggregatie tijdens de cellyse.
- Gestroomlijnde daaropvolgende verwerking: Met de VialTweeter verwerkte lysaten kunnen zonder aanvullende zuiveringsstappen direct door centrifugatie worden geklaard en gekwantificeerd, waardoor de voorbereiding op vertering met S-Trap™ wordt versneld.
- Schaalbaarheid en flexibiliteit: Dezelfde sonicatie-instellingen gelden voor zowel zeer complexe weefselmonsters als celsuspensies en ondersteunen workflows voor ontdekkingsgerichte proteomics, gerichte kwantificering en glycoproteomics. De microplaatsonicators van Hielscher maken eenvoudige opschaling naar grote aantallen monsters in multiwellplaten mogelijk.
De contactloze VialTweeter Multi-Tube Sonicator kan in gekoelde kasten worden gebruikt
Sonicators voor monstervoorbereiding voor proteomics
De voorbereiding van hoogwaardige peptidemonsters voor massaspectrometrie vereist meer dan efficiënte lyse – er is nauwkeurige controle over DNA-afschuiving, temperatuur en het voorkomen van verontreiniging nodig. Door de Hielscher VialTweeter in uw workflow voor bottom-up proteomics op te nemen, kunt u verstopping van S-Trap™ elimineren, reproduceerbare eiwitterugwinning waarborgen en de reinheid behouden die voor gevoelige analyses met MS vereist is. Of u nu menselijk weefsel, gekweekte cellen of complexe lysaten verwerkt, ultrasone blokverwerking biedt de betrouwbaarheid, schaalbaarheid en procesbeheersing die moderne proteomicslaboratoria vereisen.
Profiteer voor opschaling naar grotere aantallen monsters van de gefocusseerde, contactloze microplaatsonicators van Hielscher, de modellen UIP400MTP en UIP550MTP! Verwerk elke standaard multiwellplaat voor proteomics met hoge verwerkingscapaciteit!
Verwerking in gesloten buisjes versus traditionele sondesonicators
Van oudsher hebben onderzoekers voor DNA-afschuiving vertrouwd op sondesonicators met direct contact. Hoewel sondesystemen effectief zijn, brengen ze verschillende cruciale beperkingen met zich mee in proteomicsworkflows:
- Risico op kruisbesmetting: Hergebruik van een sonde voor meerdere monsters veroorzaakt overdracht van aerosolen en introduceert kruisverontreinigingen die de resultaten van kwantitatieve MS vertekenen.
- Monsterverlies: Direct inbrengen kan leiden tot spatten, verdamping en het hechten van kostbare peptiden aan het sondeoppervlak.
- Reiniging: Grondige decontaminatie van de sonde tussen runs is tijdrovend en vaak onvolledig, wat onderzoek naar eiwitten in lage concentraties in gevaar brengt.
De bloksonicator VialTweeter verwerkt monsters volledig binnen afgesloten microcentrifugebuisjes. Dit ontwerp met een gesloten systeem elimineert contact tussen sonde en monster, voorkomt aerosolvorming en handhaaft strikt aseptische omstandigheden tijdens de volledige homogenisatie en lyse. Voor laboratoria die zeer complexe weefsellysaten of meerdere cellijnen verwerken, resulteert dit in schonere gegevens uit MS, een hogere peptideterugwinning en betrouwbaardere biologische replicaten.
Opschaling naar monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit in multiwellplaten
Met de microplaatsonicators UIP400MTP en UIP550MTP kan de verwerking in buisjes eenvoudig worden opgeschaald naar monsterverwerking met hoge verwerkingscapaciteit in elke standaard multiwellplaat.
Sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten voor eiwitextractie uit monsters met hoge verwerkingscapaciteit
Veelgestelde vragen over sonicatie voor de voorbereiding van peptidemonsters
Waarom is sonicatie nodig vóór peptideverwerking met S-Trap™?
Sonicatie is noodzakelijk om genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht dat tijdens cel- of weefsellyse vrijkomt door afschuiving te fragmenteren. Intact DNA verhoogt de viscositeit van het monster drastisch, waardoor de microkolom van S-Trap™ kan verstoppen en peptiden kunnen worden vastgehouden, wat de terugwinning en compatibiliteit met MS ernstig vermindert.
Hoe verbetert de bloksonicator VialTweeter de monstervoorbereiding ten opzichte van traditionele sondesonicators?
In tegenstelling tot sondesonicators met direct contact, die tussen runs zorgvuldig moeten worden gereinigd en een risico op overdracht van aerosolen met zich meebrengen, verwerkt de VialTweeter monsters volledig binnen afgesloten monsterflesjes en microcentrifugebuisjes. Dit ontwerp met gesloten buisjes elimineert kruisbesmetting, voorkomt monsterverlies en handhaaft strikt aseptische omstandigheden tijdens de volledige homogenisatie en cellyse.
Wat zijn de optimale sonicatieparameters voor monstervoorbereiding voor proteomics?
Voor biologische monsters zoals cellen en weefsels gebruikt het aanbevolen protocol een sonicator VialTweeter op 30% vermogen met een cyclus van 10 seconden aan / 10 seconden uit, die 3 keer wordt herhaald. Monsters moeten tijdens de verwerking op ijs worden gehouden en de cyclus moet nog twee keer worden herhaald als er ≥5 miljoen cellen worden verwerkt. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Wat moet ik doen als mijn S-Trap™-kolom tijdens het laden van het monster verstopt raakt?
Verstopping van de kolom wordt doorgaans veroorzaakt door een hoge viscositeit door DNA of onvoldoende klaring. Om dit op te lossen, centrifugeert u uw lysaat grondig vóór het pipetteren en zorgt u ervoor dat het DNA door sonicatie voldoende door afschuiving wordt gefragmenteerd.
Welke voordelen biedt contactloze sonicatie voor kwantitatieve proteomicsworkflows?
Bij kwantitatief onderzoek kan zelfs een geringe kruisbesmetting tussen monsters de metingen van peptiden in lage concentraties vertekenen. De verwerking van meerdere afgesloten monsterflesjes met de VialTweeter maakt het inbrengen van een sonde overbodig, waarborgt de reproduceerbaarheid tussen batches en behoudt de monsterintegriteit voor nauwkeurige vergelijkende analyses.
Welke eiwitopbrengst en analysediepte met MS kan ik van dit protocol verwachten?
Uitgaande van 50 mg menselijk hartweefsel of 5 miljoen cellen levert de workflow met S-Trap™ doorgaans voldoende peptiden op voor 30–50 injecties voor LC-MS, waarbij consistent meer dan 4.000 unieke eiwitten per run worden geïdentificeerd. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatuur / Referenties
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics levert krachtige contactloze sonicators voor monstervoorbereiding en klinische analyse. De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten, de VialTweeter, de CupHorn en de doorstroomsonicator GDmini2 verwerken de monsters zonder ze aan te raken.