Proteomica-protocol: contactloze ultrasone behandeling verbetert de voorbereiding van peptidemonsters voor MS
Bottom-up proteomica is uitgegroeid tot een hoeksteen van de moderne ontdekking van biomarkers, de structuurbiologie en de klinische diagnostiek. Door eiwitten voorafgaand aan de massaspectrometrie (MS)-analyse tot peptiden te verteren, kunnen onderzoekers een grondigere sequentiedekking en een betrouwbaardere kwantificering bereiken. Het voorbereiden van biologische monsters met een hoge complexiteit voor MS blijft echter technisch veeleisend. Recente methodologische vooruitgang laat zien hoe gecontroleerde ultrasone verwerking – met name met de contactloze VialTweeter Multi-Tube-sonicator en de UIP400MTP-microplaat-sonicator – kan deze workflow aanzienlijk stroomlijnen, de reproduceerbaarheid verbeteren en veelvoorkomende knelpunten bij de apparatuur voorkomen.
Bekijk een gedetailleerd protocol voor monstervoorbereiding om peptiden te verkrijgen met een geschikte grootte voor analyse met MS.
Voor wie is contactloze ultrasone behandeling geschikt voor de voorbereiding van peptidemonsters?
- Bottom-up-proteomica & Discovery Labs: Onderzoekers die zeer complexe monsters voorbereiden voor LC-MS- of MALDI-workflows en die behoefte hebben aan een consistente, hoge opbrengst aan peptiden uit diverse biologische matrices.
- S-Trap™ & Gebruikers die vastzitten in de wachtrij: Teams die gebruikmaken van zuivering via microkolommen en waarbij gecontroleerde DNA-fragmentatie nodig is om verstopping van de kolommen te voorkomen en een soepele monstertoevoer en afbraak te garanderen.
- klinisch & Translationele onderzoeksgroepen: Laboratoria die weefsel, cellen, plasma, serum of cerebrospinale vloeistof verwerken, waarbij de reproduceerbaarheid tussen verschillende partijen en de integriteit van de monsters van cruciaal belang zijn.
- Kwantitatief & Gerichte MS Teams: Laboratoria die strenge vergelijkende onderzoeken uitvoeren, waarbij sonificatoren met herbruikbare sondes risico’s op kruisbesmetting met zich meebrengen die de kwantificering van zeldzame peptiden in gevaar kunnen brengen.
- Centrale faciliteiten & Werkzaamheden met hoge doorvoercapaciteit: Groepen die meerdere biologische replicaten tegelijkertijd verwerken en baat hebben bij sonicatie in gesloten buisjes of in blokken met meerdere buisjes met de VialTweeter, waardoor het reinigen van de sonde overbodig wordt, de handmatige verwerkingstijd wordt verkort en de aseptische omstandigheden worden gehandhaafd.
- Ouderavond & Onderzoekers op het gebied van structurele eiwitten: Onderzoekers die behoefte hebben aan een zachte, temperatuurgecontroleerde verwerking om labiele modificaties te behouden en de sequentiedekking tijdens cellysis en homogenisatie te maximaliseren.
Multi-Sample Sonicator “VialTweeter” voor de contactloze monstervoorbereiding van meerdere verzegelde flesjes voor proteomica
Overzicht van het protocol: van weefsel en cellen tot peptiden die geschikt zijn voor MS-analyse
De door Wojtkiewicz et al. beschreven, op grote schaal toegepaste bottom-up proteomics-workflow biedt een robuuste, schaalbare methode voor het voorbereiden van peptidemonsters uit diverse biologische matrices. Het protocol, dat begint met 50–100 mg snel ingevroren weefsel of 1–20 miljoen cellen, maakt gebruik van de ‘suspension trapping’ (S-Trap™)-technologie om detergenten, zouten en verontreinigingen efficiënt te verwijderen vóór de enzymatische afbraak.
Na lysis, eiwitkwantificering, reductie en alkylering wordt het monster aangezuurd en op een S-Trap™-spinkolom aangebracht, waar de trypsine/lysC-digestie plaatsvindt. De resulterende peptiden worden geëlueerd, gedroogd en onderworpen aan LC-MS-analyse. Bij toepassing op 50 mg menselijk hartweefsel levert deze workflow consistent voldoende peptiden op voor 30–40 injecties, waarmee per run meer dan 4.000 unieke eiwitten worden geïdentificeerd. Hoewel de chemische processen en de zuivering via de kolom goed gedefinieerd zijn, hangt het succes van de pijplijn sterk af van de initiële fysieke afbraak en de stappen voor DNA-beheer.
Het protocol beveelt het gebruik aan van de VialTweeter Multi-Tube Sonicator voor het lyseren van de cellen en het afbreken van DNA door middel van ultrasone behandeling – Beide stappen zijn van cruciaal belang voor de analyse van peptiden.
De VialTweeter behandelt verzegelde Eppendorf-buisjes van 1,0, 1,5 en 2,0 ml, evenals diverse NUNC-flesjes met ultrasone trillingen
Ultrasone cel- en weefsellysis voor eiwitextractie
In de bottom-up proteomics-workflow is ultrasone behandeling een cruciale stap in de lysis van celmonsters om eiwitten te extraheren voor daaropvolgende massaspectrometrieanalyse. Nadat SDS-cellysisbuffer aan het celpellet is toegevoegd, worden de monsters onderworpen aan ultrasone behandeling met behulp van de VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Het protocol maakt gebruik van microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en schrijft voor dat de sonicator gedurende 10 seconden aan en 10 seconden uit staat op 30% vermogen, herhaald gedurende 3 cycli. Na 1 minuut wachten wordt de cyclus nog twee keer herhaald. De monsters worden continu gekoeld met ijs.
Dit proces draagt niet alleen bij aan de afbraak van de cellen, maar is ook specifiek noodzakelijk om het tijdens de lysis vrijgekomen genomisch DNA te versnipperen. Een effectieve versnippering van het DNA is cruciaal om de viscositeit van het monster te verlagen en verstopping van de S-Trap™-kolommen te voorkomen, waardoor een optimale eiwitafname en een betrouwbare verdere peptidedigestie worden gewaarborgd.
De cruciale rol van ultrasone DNA-fragmentatie
Een van de meest voorkomende storingen in op S-Trap™ gebaseerde werkprocessen is het verstoppen van de kolom, wat vrijwel uitsluitend wordt veroorzaakt door genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht dat vrijkomt tijdens de homogenisatie van cellen of weefsel. Intact DNA verhoogt de viscositeit van het monster aanzienlijk, houdt peptiden vast en blokkeert het microporeuze S-Trap™-adsorptiemateriaal.
Ultrasone verwerking lost dit probleem op door het DNA mechanisch te fragmenteren tot kleine, oplosbare fragmenten. Door gecontroleerde akoestische energie toe te passen, knipt de VialTweeter nucleïnezuren efficiënt in stukjes zonder overmatige warmte te genereren of vreemde verontreinigingen toe te voegen. Deze vermindering van de viscositeit zorgt voor een soepele monstertoevoer, consistente doorstromingssnelheden en een ononderbroken afbraakkinetiek.
Geoptimaliseerde sonicatieparameters voor de VialTweeter
Het protocol beschrijft een uiterst reproduceerbaar ultrasone behandelingsprotocol dat is geoptimaliseerd voor het behoud van de integriteit van biologische monsters en de compatibiliteit met daaropvolgende MS-analyses. Voor monsters in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml, waarbij gebruik wordt gemaakt van de contactloze bloksonicator Hielscher VialTweeter, zorgen de volgende parameters voor cellysis en optimale DNA-fragmentatie, waarbij de eiwitstructuur behouden blijft:
- Amplitude: 30% vermogen
- Cycluspatroon: 10 seconden AAN / 10 seconden UIT
- Duur: 3 cycli (10 sec. AAN/10 sec. UIT) → 1 minuut rust op ijs → nog 2 keer herhalen
- Temperatuurbeheersing: De monsters worden tijdens de verwerking op ijs gelegd om thermische denaturatie en voortijdige enzymatische activiteit te voorkomen
Deze methode met gepulseerde ultrasone behandeling voorkomt plaatselijke oververhitting, beperkt de oxidatie van peptiden tot een minimum en zorgt voor een gelijkmatige blootstelling aan ultrasone trillingen in alle flesjes. Dankzij de opstelling met gesloten buizen is het bovendien niet meer nodig om de sonde tussen de monsters door te reinigen, waardoor de handmatige verwerkingstijd en de variabiliteit door de operator drastisch worden verminderd.
Belangrijkste voordelen voor moderne proteomica-workflows
De integratie van de VialTweeter in uw bottom-up proteomica-pijplijn biedt diverse operationele en wetenschappelijke voordelen:
- Constante DNA-fragmentatie: Een gelijkmatige toevoer van akoestische energie naar alle flacons zorgt voor een reproduceerbare viscositeitsvermindering en voorkomt variaties tussen verschillende batches bij het vullen van de S-Trap™.
- Behoud van labiele modificaties: Verwerking bij lage temperatuur in een ijsbad beschermt posttranslationele modificaties (PTM’s) en voorkomt door hitte veroorzaakte eiwitaggregatie tijdens de cellysis.
- Gestroomlijnde verwerking na de productie: Met VialTweeter verwerkte lysaten kunnen direct door middel van centrifugeren worden geklaard en gekwantificeerd zonder dat er aanvullende zuiveringsstappen nodig zijn, waardoor het proces tot aan de S-Trap™-digestie wordt versneld.
- Schaalbaarheid & Flexibiliteit: Dezelfde ultrasone behandelingsinstellingen gelden zowel voor weefselmonsters met een hoge complexiteit als voor celsuspensies, waardoor ze geschikt zijn voor proteomica gericht op ontdekkingen, gerichte kwantificering en glycoproteomica-workflows. De Hielscher-sonicatoren voor microplaten maken een eenvoudige opschaling naar grote aantallen monsters in multi-wells mogelijk.
De contactloze Multi-Tube Sonicator VialTweeter kan in koelkasten worden gebruikt
Ultrasone apparaten voor de voorbereiding van proteomische monsters
Voor het voorbereiden van hoogwaardige peptidemonsters voor massaspectrometrie is meer nodig dan alleen een efficiënte lysis – Dit vereist een nauwkeurige regeling van de DNA-versnippering, de temperatuur en de preventie van verontreiniging. Door de Hielscher VialTweeter in uw bottom-up proteomics-workflow te integreren, kunt u verstopping van de S-Trap™ voorkomen, een reproduceerbare eiwitafgifte garanderen en de reinheid handhaven die vereist is voor gevoelige MS-analyses. Of u nu menselijk weefsel, gekweekte cellen of complexe lysaten verwerkt: ultrasone blokverwerking biedt de betrouwbaarheid, schaalbaarheid en procescontrole die moderne proteomicalaboratoria vereisen.
Om op te schalen naar grotere monstervolumes, kunt u gebruikmaken van de door Hielscher ontwikkelde, contactloze microplaat-sonicatoren UIP400MTP en UIP550MTP! Verwerk elke standaard multi-well-plaat voor proteomica met hoge doorvoercapaciteit!
Verwerking met gesloten buizen versus traditionele ultrasone apparaten met sonde
In het verleden maakten onderzoekers voor het versnipperen van DNA gebruik van ultrasone apparaten met directe contactsonde. Hoewel deze sondesystemen effectief zijn, brengen ze een aantal belangrijke beperkingen met zich mee voor proteomica-workflows:
- Risico op kruisbesmetting: Het hergebruiken van een sonde bij meerdere monsters leidt tot de overdracht van aerosolen en zorgt voor kruisbesmetting, waardoor de kwantitatieve MS-resultaten worden vertekend.
- Verlies van monsters: Directe inbrenging kan leiden tot spatten, verdamping en het vasthechten van waardevolle peptiden aan het oppervlak van de sonde.
- Reiniging: Een grondige ontsmetting van de sondes tussen de metingen door is tijdrovend en vaak onvolledig, wat onderzoek naar eiwitten met een lage concentratie in gevaar brengt.
De VialTweeter-bloksonicator verwerkt monsters volledig in afgesloten microcentrifugebuisjes. Dit gesloten systeem voorkomt contact tussen de sonde en het monster, voorkomt de vorming van aerosolen en zorgt ervoor dat er tijdens het homogeniseren en lyseren strikte aseptische omstandigheden worden gehandhaafd. Voor laboratoria die zeer complexe weefsellysaten of meerdere cellijnen verwerken, vertaalt zich dit in zuiverdere MS-gegevens, een hogere peptide-opbrengst en betrouwbaardere biologische replicaten.
Opschaling naar monstervoorbereiding met hoge doorvoercapaciteit in multiwell-platen
Met de microplaat-sonicators van het type UIP400MTP en UIP550MTP, kan de buisverwerking eenvoudig worden opgeschaald naar monsterverwerking met hoge doorvoercapaciteit in elke standaard multiwell-plaat.
Multi-well platen sonicator UIP400MTP voor high-throughput eiwitextractie uit monsters
Veelgestelde vragen over ultrasone behandeling bij de voorbereiding van peptidemonsters
Waarom is ultrasone behandeling nodig vóór de verwerking van S-Trap™-peptiden?
Ultrasone behandeling is noodzakelijk om genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht, dat vrijkomt tijdens cel- of weefsellysis, te breken. Intact DNA verhoogt de viscositeit van het monster aanzienlijk, waardoor de S-Trap™-microkolom kan verstoppen en peptiden kunnen worden vastgehouden, wat de opbrengst en de geschiktheid voor MS ernstig vermindert.
Op welke manier zorgt de VialTweeter-bloksonicator voor een betere monstervoorbereiding in vergelijking met traditionele sondesonicatoren?
In tegenstelling tot ultrasone apparaten met directe-contactsondes, die tussen de bewerkingen door zorgvuldig moeten worden gereinigd en waarbij het risico op aerosoloverdracht bestaat, verwerkt de VialTweeter monsters volledig in afgesloten flesjes en microcentrifugebuisjes. Dit ontwerp met gesloten buisjes voorkomt kruisbesmetting, voorkomt monsterverlies en handhaaft strikte aseptische omstandigheden tijdens de homogenisatie en cellysis.
Wat zijn de optimale ultrasone behandelingsparameters voor de voorbereiding van proteomica-monsters?
Voor biologische monsters zoals cellen en weefsels wordt in het aanbevolen protocol een VialTweeter-sonicator gebruikt op 30% vermogen, met een cyclus van 10 seconden aan / 10 seconden uit, die driemaal wordt herhaald. Monsters moeten tijdens de verwerking op ijs worden bewaard en de cyclus moet nog twee keer worden herhaald bij verwerking van ≥5 miljoen cellen. (zie Wojtkiewicz et al., 2021)
Wat moet ik doen als mijn S-Trap™-kolom verstopt raakt tijdens het laden van het monster?
Verstopping van de kolom wordt doorgaans veroorzaakt door een hoge viscositeit van het DNA of onvoldoende zuivering. Om dit te verhelpen, moet u uw lysaat grondig centrifugeren voordat u gaat pipetteren en ervoor zorgen dat het DNA voldoende wordt afgebroken door middel van ultrasone behandeling.
Welke voordelen biedt contactloze ultrasone behandeling voor werkprocessen op het gebied van kwantitatieve proteomica?
In kwantitatieve onderzoeken kan zelfs de geringste kruisbesmetting tussen monsters de metingen van peptiden met een lage concentratie vertekenen. Dankzij de verwerking in gesloten buisjes en de mogelijkheid om meerdere buisjes tegelijk te verwerken, is bij de VialTweeter het inbrengen van een sonde niet nodig, wordt de reproduceerbaarheid tussen verschillende batches gewaarborgd en blijft de integriteit van de monsters behouden, wat nauwkeurige vergelijkende analyses mogelijk maakt.
Welke eiwitopbrengst en MS-diepte kan ik van dit protocol verwachten?
Uitgaande van 50 mg menselijk hartweefsel of 5 miljoen cellen levert de S-Trap™-workflow doorgaans voldoende peptiden op voor 30–50 LC-MS-injecties, waarbij per run consequent meer dan 4.000 unieke eiwitten worden geïdentificeerd. (zie Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatuur / Referenties
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics levert krachtige, contactloze ultrasone apparaten voor monstervoorbereiding en klinische analyse. De UIP400MTP-sonicator voor multi-well-platen, de VialTweeter, de CupHorn en de GDmini2-doorstroomsonicator verwerken de monsters zonder ze aan te raken.