Sonicatie in microplaten voor shotgunproteomica – Toepassingsnotitie

Shotgunproteomica is afhankelijk van efficiënte, reproduceerbare monstervoorbereiding om complex biologisch materiaal om te zetten in peptiden die klaar zijn voor LC-MS/MS. De sonicator voor microplaten UIP400MTP ondersteunt dit proces door gestandaardiseerde, parallelle sonicatie van monsters met een klein volume mogelijk te maken, waardoor laboratoria de ontsluiting, extractie en het opnieuw in oplossing brengen in workflows met microplaten kunnen verbeteren. Deze toepassingsnotitie beschrijft hoe de UIP400MTP kan worden geïntegreerd in de monstervoorbereiding voor proteomica, met een gepubliceerde workflow voor extracellulaire vesikels uit studies naar PLA2G12A/Th17 als een in het laboratorium getest voorbeeld.

Sonicatie in microplaten voor beter reproduceerbare shotgunproteomica

Voor onderzoekers in de proteomica is reproduceerbare monstervoorbereiding cruciaal voor hoogwaardige gegevens van LC-MS/MS. De sonicator voor microplaten UIP400MTP ondersteunt gestandaardiseerde, parallelle sonicatie in workflows met platen en in workflows voor kleine volumes en een hoge verwerkingscapaciteit.

Dit is vooral nuttig voor laboratoria die werken met:

• Grote monsterreeksen die een consistente verwerking in veel wells vereisen
• Materiaal dat slechts in beperkte hoeveelheden beschikbaar is, waarbij monsterverlies en variabiliteit tot een minimum moeten worden beperkt
• Lipidenrijke monsters, zoals extracellulaire vesikels
• Complexe biologische preparaten die efficiënte ontsluiting, extractie of het opnieuw in oplossing brengen vereisen
• Vergelijkende shotgunproteomica, waarbij reproduceerbaarheid tussen omstandigheden en replicaten essentieel is

Door sonicatie in microplaten vóór de digestie te integreren, kunnen onderzoekers monsters beter voorbereiden op:

• Eiwitextractie en het opnieuw in oplossing brengen
• Digestie met trypsine/Lys-C
• Gegevensacquisitie met Nano-LC/MS/MS
• Kwantitatieve proteomica-analyse in vervolgstappen

Sonicatie in microplaten kan voordelen bieden voor:

• Centrale faciliteiten voor proteomica
• Onderzoekslaboratoria voor EV’s
• Laboratoria voor immunologie en celbiologie
• Translationele onderzoeksgroepen
• Teams in de levenswetenschappen die opschalen van de voorbereiding van afzonderlijke monsters naar workflows met een hogere verwerkingscapaciteit

Monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit voor proteoomanalyse van extracellulaire vesikels

Wat is shotgunproteomica?

Shotgunproteomica is een centrale analytische strategie geworden voor het karakteriseren van complexe biologische monsters, van lysaten van volledige cellen en weefselextracten tot gezuiverde organellen, extracellulaire vesikels en klinische monsters met weinig uitgangsmateriaal. De belangrijkste kracht ervan ligt in de koppeling van eiwitdigestie, vloeistofchromatografie met tandem-massaspectrometrie met hoge resolutie en computationele afleiding van eiwitten uit peptiden. De kwaliteit van de uiteindelijke proteoomdataset wordt echter al bepaald lang voordat het monster de massaspectrometer bereikt. Efficiënte ontsluiting van monsters, het in oplossing brengen van eiwitten, verwijdering van storende stoffen, reproduceerbare enzymatische digestie en robuuste terugwinning van peptiden zijn allemaal bepalend voor de dekkingsdiepte en kwantitatieve betrouwbaarheid.
Voor onderzoekers in de proteomica en laboratoria in de levenswetenschappen die werken met beperkte hoeveelheden of kostbare monsters, is monstervoorbereiding vaak het knelpunt.

De uitdaging van extracellulaire vesikels in de proteomica

Extracellulaire vesikels (EV’s) vormen bijvoorbeeld een bijzonder veeleisende klasse van monsters. Het zijn membraanomsloten, lipidenrijke deeltjes op nanoschaal met een relatief lage eiwitopbrengst en een grote kans op het meevoeren van lipiden, zouten, detergentia, serumeiwitten en andere matrixcomponenten. Deze eigenschappen kunnen de digestie-efficiëntie, chromatografische prestaties, elektrospraystabiliteit en peptide-identificatie verstoren. Een voorbereidingsworkflow voor proteomica van EV’s moet daarom krachtig genoeg zijn om vesikelstructuren te ontsluiten en de eiwitten die ze bevatten in oplossing te brengen, en tegelijkertijd compatibel blijven met de daaropvolgende enzymatische digestie en analyse met LC-MS/MS.
In deze context biedt ultrasone behandeling die geschikt is voor microplaten een praktische aanpak voor reproduceerbare, parallelle monsterverwerking. De modellen UIP400MTP (400 W) en UIP550MTP (550 W) van de sonicatoren voor microplaten van Hielscher zijn ontworpen voor sonicatie van monsters in multiwellplaten en houders met een klein volume en ondersteunen workflows met een hogere verwerkingscapaciteit dan conventionele sonicatoren met één sonde. Voor proteomicalaboratoria is dit formaat aantrekkelijk omdat het de variabiliteit door handmatige verwerking kan verminderen, de parallelle behandeling van meerdere monsters kan verbeteren en gemakkelijker kan worden geïntegreerd in trajecten voor monstervoorbereiding met platen.

Voorbeeldworkflow

Een recente workflow voor proteomica van extracellulaire vesikels in de door PLA2G12A aangestuurde Th17-celbiologie biedt een nuttig, in het laboratorium getest voorbeeld van hoe de sonicator voor microplaten UIP400MTP kan worden opgenomen in de monstervoorbereiding voor shotgunproteomica. In die reeks studies werden EV-monsters verwerkt voor proteoomanalyse met behulp van methanolbehandeling, sonicatie met de UIP400MTP, centrifugatie, droging, digestie met trypsine/Lys-C en LC met nanodebiet gekoppeld aan tandem-MS met hoge resolutie. Het biologische onderzoek werd in 2026 gerapporteerd door Mochizuki-Ono en collega’s, waarbij de proteomica-analyse hielp te karakteriseren hoe PLA2G12A de eiwitten in EV’s verandert in de context van pathogene T-celresponsen.

Sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten

Waarom sonicatie in microplaten?
De UIP400MTP maakt gestandaardiseerde, parallelle sonicatie van monsters met een klein volume mogelijk. Dit is nuttig wanneer reproduceerbaarheid, weinig uitgangsmateriaal en een hoge verwerkingscapaciteit voor meerdere monsters belangrijk zijn.


Checklist voor kwaliteitscontrole

• Controleer of voor alle monsters een gelijke hoeveelheid EV-uitgangsmateriaal op basis van eiwitequivalenten wordt gebruikt.
• Gebruik gerandomiseerde of gebalanceerde indelingen voor de monsterverwerking.
• Houd het methanolvolume, de sonicatietijd, de droogtijd en het digestievolume consistent.
• Bewaak de peptideopbrengst en het totale aantal eiwitidentificaties.
• Controleer het percentage gemiste knipplaatsen en de verdeling van peptidelengtes.
• Inspecteer de chromatografische piekvorm en de reproduceerbaarheid van retentietijden.
• Neem blanco’s op om versleping te bewaken.
• Gebruik gepoolde QC-monsters voor grotere studies.
• Evalueer de variatiecoëfficiënt van replicaten.
• Gebruik PCA of verwante methoden om batcheffecten of afwijkende monsters te identificeren.

Aanbevelingen voor verslaglegging

Rapporteer bij het publiceren of documenteren van deze workflow de hoeveelheid uitgangsmateriaal van EV’s, het plaatformaat, het methanolvolume, de amplitude en sonicatietijd van de UIP400MTP, de centrifugatieomstandigheden, de droogmethode, de digestiebuffer, de enzymconcentratie, de digestietijd, de aanzuringsomstandigheden, het platform voor LC-MS/MS, de acquisitiemodus, de softwareversie, de database, de drempelwaarde voor FDR, de normalisatiemethode en de statistische workflow.
Alle sonicatoren voor microplaten van Hielscher registreren automatisch belangrijke procesparameters zoals amplitude, sonicatieduur en temperatuur met datum- en tijdstempel als een bestand in CVS op de geïntegreerde SD-kaart. Gegevensregistratie voor reproduceerbaarheid en kwaliteitscontrole was nog nooit zo eenvoudig!

De studie in detail: shotgunproteomica van EV’s in de PLA2G12A-studie

De studie naar PLA2G12A biedt een concreet voorbeeld van het gebruik van de UIP400MTP in een workflow voor shotgunproteomica. De biologische vraag was hoe de uitgescheiden fosfolipase PLA2G12A extracellulaire vesikels afkomstig van cellen van het type Th17 verandert en daarmee de differentiatie van pathogene T-cellen beïnvloedt. De auteurs toonden aan dat PLA2G12A inwerkt op de membranen van EV’s om lysofosfolipiden te produceren, waaronder 1-oleoyl-lysofosfatidylethanolamine, en dat de daaropvolgende signalering door lysofosfatidinezuur via LPA2 bijdraagt aan de differentiatie van Th17. Naast lipidesignalering onderzochten de studies ook de inhoud van EV’s, waaronder het gehalte aan RNA en eiwitten, waardoor shotgunproteomica een belangrijk onderdeel van de karakteriseringsstrategie werd.
In de workflow voor de voorbereiding van EV’s werden cellen van het type Th17 gekweekt in medium met foetaal runderserum waaruit exosomen waren verwijderd. Kweeksupernatanten werden eerst gecentrifugeerd om cellen te verwijderen, gefilterd door een filter van 0,22 µm, geconcentreerd door ultrafiltratie/ultracentrifugatie, gewassen, opnieuw gesuspendeerd in PBS en gekwantificeerd met een eiwitassay op basis van BCA. Deze voorafgaande voorbereiding van EV’s zorgde ervoor dat een vastgelegde hoeveelheid materiaal van EV’s op basis van eiwitequivalenten kon worden ingebracht in de proteomicaworkflow.
Voor de shotgunproteomica-analyse gebruikten de auteurs monsters van EV’s die overeenkwamen met 5 µg eiwitequivalenten. Deze monsters werden gedroogd in buisjes voor PCR en er werd 25 µL methanol toegevoegd. De monsters werden vervolgens gedurende 3 minuten gesoniceerd met de sonicator voor microplaten UIP400MTP. Na sonicatie werden de monsters bij 4°C gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 19.000 × g. Na verwijdering van 20 µL supernatant werden de monsters tot droogte gecentrifugeerd. Vervolgens werden de eiwitten door sonicatie opgelost in 4 µL oplossing van trypsine/Lys-C van 100 ng/µL in 50 mM ammoniumbicarbonaat. De digestie werd gedurende 2 uur uitgevoerd bij 37°C onder schudden bij 300 rpm. Het digest werd aangezuurd met 1 µL van 1,25% trifluorazijnzuur en geanalyseerd met vloeistofchromatografie met nanodebiet gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie met hoge resolutie.
Deze workflow benadrukt verschillende nuttige principes voor proteomica van EV’s met weinig uitgangsmateriaal. Ten eerste werd de hoeveelheid uitgangsmateriaal genormaliseerd op basis van eiwitequivalenten, wat belangrijk is bij het vergelijken van EV’s uit verschillende genotypen of behandelingen. Ten tweede werd methanol gebruikt vóór sonicatie, wat ontsluiting en extractie ondersteunde en tegelijkertijd het gebruik van detergentsystemen vermeed die LC-MS/MS kunnen bemoeilijken. Ten derde was de sonicatiestap kort en gestandaardiseerd, wat compatibel is met parallelle monsterverwerking. Ten vierde werd de digestie met trypsine/Lys-C uitgevoerd in een zeer klein volume, waardoor verdunning werd verminderd en de terugwinning van peptiden uit weinig uitgangsmateriaal werd ondersteund. Tot slot beperkte de directe overgang van digestie naar aanzuring en LC-MS/MS onnodige handelingen tot een minimum.
De daaropvolgende methode voor LC-MS/MS gebruikte reversed-phase-scheiding met nanodebiet, gekoppeld aan een massaspectrometer van het type Q-Exactive HF Orbitrap. Monsters werden opgevangen op een voorkolom met C18 en vervolgens gescheiden op een analytische kolom met een binnendiameter van 50 µm bij 200 nL/min en 40°C. De gradiënt liep in 60 minuten van een laag gehalte aan organisch oplosmiddel naar 35% oplosmiddel B, gevolgd door wassen met een hoog gehalte aan organisch oplosmiddel en herequilibratie. Gegevensacquisitie met MS werd uitgevoerd in positieve-ionmodus met data-onafhankelijke acquisitie en botsingsgeïnduceerde dissociatie bij hogere energie. Ruwe bestanden van DIA werden geanalyseerd met DIA-NN 1.8 en een in silico voorspelde spectrale bibliotheek.