Sonicatie van microplaten bij shotgun-proteomica – Toepassingsnota

Shotgun-proteomica is afhankelijk van een efficiënte, reproduceerbare monstervoorbereiding om complex biologisch materiaal om te zetten in peptiden die geschikt zijn voor LC-MS/MS. De UIP400MTP-microplaat-sonicator ondersteunt dit proces door gestandaardiseerde, parallelle sonicatie van monsters met een klein volume mogelijk te maken, waardoor laboratoria de afbraak, extractie en heroplosbaarheid in op microplaten gebaseerde workflows kunnen verbeteren. Deze toepassingsnota beschrijft hoe de UIP400MTP kan worden geïntegreerd in de proteomische monstervoorbereiding, waarbij een gepubliceerde workflow voor extracellulaire vesikels uit PLA2G12A/Th17-onderzoeken als in het laboratorium getest voorbeeld wordt gebruikt.

Sonicatie van microplaten voor beter reproduceerbare shotgun-proteomica

Voor proteomica-onderzoekers is een reproduceerbare monstervoorbereiding van cruciaal belang voor LC-MS/MS-gegevens van hoge kwaliteit. De UIP400MTP-microplaat-sonicator ondersteunt gestandaardiseerde, parallelle sonicatie in werkprocessen op basis van microplaatjes en in workflows met kleine volumes en hoge doorvoercapaciteit.

Het is met name nuttig voor laboratoria die zich bezighouden met:

• Grote steekproefsets die een consistente verwerking in veel wells vereisen
• Materiaal met beperkte invoer, waarbij monsterverlies en variabiliteit tot een minimum moeten worden beperkt
• Lipidenrijke monsters, zoals extracellulaire vesikels
• Complexe biologische preparaten die een efficiënte afbraak, extractie of heroplosbaarheid vereisen
• Vergelijkende shotgun-proteomica, waarbij reproduceerbaarheid onder verschillende omstandigheden en bij verschillende replicaties van essentieel belang is

Door sonificatie van microplaten vóór de digestie te integreren, kunnen onderzoekers de monsters beter voorbereiden voor:

• Eiwitwinning en heroplosbaarheid
• Trypsine/Lys-C-vertering
• Nano-LC/MS/MS-gegevensverzameling
• Kwantitatieve proteomische analyse in de downstream-fase

 

Breid uw proteomica-monstervoorbereiding met vertrouwen uit!
Ontdek hoe ultrasone behandeling van microplaten helpt om variabiliteit door handmatige bewerkingen te verminderen, de afbraak van monsters te verbeteren en complexe biologische monsters voor te bereiden voor betrouwbare LC-MS/MS-analyse.

Informatieaanvraag


E-mailadres (verplicht)


Product of interessegebied



Ik ga akkoord met het privacybeleid









Informatie aanvragen

Ultrasone behandeling van microplaten kan voordelen bieden:

• Proteomica-kernfaciliteiten
• Onderzoekslaboratoria op het gebied van elektrische voertuigen
• Laboratoria voor immunologie en celbiologie
• Translationele onderzoeksgroepen
• Teams in de levenswetenschappen die hun werkwijzen uitbreiden van de voorbereiding van één enkel monster naar workflows met een hogere doorvoercapaciteit

Monstervoorbereiding met hoge doorvoercapaciteit voor proteoomanalyse van extracellulaire vesikels

Wat is shotgun-proteomica?

Shotgun-proteomica is uitgegroeid tot een centrale analysestrategie voor het karakteriseren van complexe biologische monsters, variërend van lysaten van hele cellen en weefselextracten tot gezuiverde organellen, extracellulaire vesikels en klinische monsters met een lage invoerhoeveelheid. De belangrijkste kracht ervan ligt in de koppeling van eiwitvertering, vloeistofchromatografie met hoge resolutie in combinatie met tandem-massaspectrometrie en computationele afleiding van peptiden naar eiwitten. De kwaliteit van de uiteindelijke proteoomdataset wordt echter al lang voordat het monster de massaspectrometer bereikt, bepaald. Efficiënte monsterdisruptie, oplosbaarheid van eiwitten, verwijdering van storende stoffen, reproduceerbare enzymatische afbraak en robuuste peptiderecuperatie zijn allemaal doorslaggevend voor de dekkingsdiepte en de kwantitatieve betrouwbaarheid.
Voor proteomica-onderzoekers en laboratoria in de levenswetenschappen die met beperkte of kostbare monsters werken, vormt de monstervoorbereiding vaak het knelpunt.

De uitdaging van extracellulaire vesikels in de proteomica

Extracellulaire vesikels (EV’s) vormen bijvoorbeeld een bijzonder veeleisende monsterklasse. Het zijn door een membraan omgeven, lipidenrijke deeltjes op nanoschaal met een relatief lage eiwitopbrengst en een groot risico op overdracht van lipiden, zouten, detergenten, serumproteïnen en andere matrixcomponenten. Deze eigenschappen kunnen de efficiëntie van de vertering, de chromatografische prestaties, de stabiliteit bij elektrospray en de identificatie van peptiden verstoren. Een bereidingsworkflow voor EV-proteomica moet daarom krachtig genoeg zijn om de structuren van de vesikels te verstoren en de eiwitlading oplosbaar te maken, terwijl deze tegelijkertijd compatibel blijft met de daaropvolgende enzymatische vertering en LC-MS/MS-analyse.
In dit verband biedt ultrasone behandeling die geschikt is voor microplaten een praktische aanpak voor reproduceerbare, parallel uitgevoerde monsterverwerking. De Hielscher-microplaat-sonicatoren UIP400MTP (400 W) en UIP550MTP (550 W) zijn ontworpen voor de ultrasone behandeling van monsters in multiwell-platen en vaten met een klein volume, en ondersteunen workflows met een hogere doorvoer dan conventionele sonicatoren met één sonde. Voor proteomica-laboratoria is dit formaat aantrekkelijk omdat het de variabiliteit door menselijke tussenkomst kan verminderen, de parallelle verwerking van meerdere monsters kan verbeteren en zich op een meer natuurlijke manier laat integreren in op platen gebaseerde pijplijnen voor monstervoorbereiding.

Voorbeeld van een workflow

Een recente proteomica-workflow met extracellulaire vesikels in de biologie van PLA2G12A-gestuurde Th17-cellen biedt een nuttig, in het laboratorium getest voorbeeld van hoe de microplaat-sonicator UIP400MTP kan worden geïntegreerd in de monstervoorbereiding voor shotgun-proteomica. In die reeks onderzoeken werden EV-monsters verwerkt voor proteoomanalyse door middel van behandeling met methanol, sonicatie met de UIP400MTP, centrifugeren, drogen, trypsine/Lys-C-digestie en nano-flow LC-tandem-MS met hoge resolutie. Hetzelfde biologische onderzoek werd eerst gerapporteerd als een bioRxiv-preprint en vervolgens gepubliceerd in *Cell Reports*, waar de proteoomanalyse hielp bij het karakteriseren van de manier waarop PLA2G12A de ladingseiwitten van EV’s verandert in de context van pathogene T-celreacties.

Multi-well platen sonicator UIP400MTP

Waarom ultrasone behandeling van microplaten?
De UIP400MTP maakt gestandaardiseerde, parallelle ultrasone behandeling van monsters met een klein volume mogelijk. Dit is nuttig wanneer reproduceerbaarheid, een kleine monsterhoeveelheid en een hoge doorvoercapaciteit voor meerdere monsters van belang zijn.

Checklist voor kwaliteitscontrole

• Controleer of de hoeveelheid EV-eiwitequivalenten in alle monsters gelijk is.
• Gebruik willekeurige of evenwichtige indelingen voor de verwerking van steekproeven.
• Zorg ervoor dat het methanolvolume, de ultrasone bewerkingstijd, de droogtijd en het afbraakvolume constant blijven.
• Houd de peptideopbrengst en het aantal geïdentificeerde eiwitten bij.
• Controleer het percentage gemiste splitsingen en de verdeling van de peptidelengtes.
• Controleer de vorm van de chromatografische pieken en de reproduceerbaarheid van de retentietijden.
• Voeg lege velden toe om de overdracht te controleren.
• Gebruik samengevoegde kwaliteitscontrolemonsters voor grotere onderzoeken.
• Beoordeel de variatiecoëfficiënt van de replicaten.
• Gebruik PCA of verwante methoden om batch-effecten of uitschieters te identificeren.

Aanbevelingen voor het opstellen van notulen

Vermeld bij het publiceren of documenteren van deze workflow de hoeveelheid EV-input, het plaatformaat, het methanolvolume, de amplitude en de ultrasone bewerkingstijd van de UIP400MTP, de centrifugeeromstandigheden, de droogmethode, de digestiebuffer, de enzymconcentratie, de digestietijd, de aanzuringsomstandigheden, het LC-MS/MS-platform, de acquisitiemodus, de softwareversie, de database, de FDR-drempel, de normalisatiemethode en de statistische workflow.
Alle microplaat-sonicators van Hielscher registreren automatisch belangrijke procesparameters, zoals amplitude, sonicatieduur en temperatuur, met datum- en tijdstempel, als CSV-bestand op de ingebouwde SD-kaart. Het vastleggen van gegevens voor reproduceerbaarheid en kwaliteitscontrole was nog nooit zo eenvoudig!

De studie in detail: EV-shotgun-proteomica in het PLA2G12A-onderzoek

Het PLA2G12A-onderzoek biedt een concreet voorbeeld van het gebruik van UIP400MTP in een shotgun-proteomics-workflow. De biologische vraag was hoe het uitgescheiden fosfolipase PLA2G12A extracellulaire vesikels afkomstig van Th17-cellen modificeert en daarmee de differentiatie van pathogene T-cellen beïnvloedt. De auteurs toonden aan dat PLA2G12A inwerkt op de membranen van extracellulaire vesikels (EV's) en zo lysofosfolipiden produceert, waaronder 1-oleoyl-lysofosfatidylethanolamine, en dat de daaropvolgende signalering via lysofosfatidinezuur (LPA) via LPA2 bijdraagt aan de differentiatie van Th17-cellen. Naast lipidesignalering werd in de studies ook de lading van de EV’s onderzocht, waaronder het RNA- en eiwitgehalte, waardoor shotgun-proteomica een belangrijk onderdeel van de karakteriseringsstrategie vormde.
In de werkstroom voor de EV-voorbereiding werden Th17-cellen gekweekt in medium dat foetaal runderserum zonder exosomen bevatte. Kweeksupernatanten werden eerst gecentrifugeerd om cellen te verwijderen, gefilterd door een 0,22 µm-filter, geconcentreerd door middel van ultrafiltratie/ultracentrifugatie, gewassen, opnieuw gesuspendeerd in PBS en gekwantificeerd met behulp van een BCA-eiwitbepaling. Deze voorafgaande EV-voorbereiding zorgde ervoor dat een gedefinieerde, eiwitequivalente hoeveelheid EV-materiaal in de proteomica-workflow kon worden opgenomen.
Voor de shotgun-proteoomanalyse gebruikten de auteurs EV-monsters die overeenkwamen met 5 µg eiwitequivalenten. Deze monsters werden in PCR-buisjes gedroogd, waarna 25 µL methanol werd toegevoegd. Vervolgens werden de monsters gedurende 3 minuten met behulp van de UIP400MTP-microplaat-sonicator met ultrasone trillingen behandeld. Na de ultrasone behandeling werden de monsters gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 19.000 × g gecentrifugeerd. Na verwijdering van 20 µL supernatant werden de monsters tot droogte gecentrifugeerd. Vervolgens werden de eiwitten door middel van ultrasone behandeling opgelost in 4 µL trypsine/Lys-C-oplossing met een concentratie van 100 ng/µL in 50 mM ammoniumbicarbonaat. De digestie vond plaats gedurende 2 uur bij 37 °C onder schudden bij 300 rpm. Het digest werd aangezuurd met 1 µL 1,25% trifluorazijnzuur en onderworpen aan nano-flow LC-tandem-massaspectrometrie met hoge resolutie.
Deze workflow belicht verschillende nuttige principes voor EV-proteomica met een lage input. Ten eerste werd de input genormaliseerd op basis van eiwitequivalent, wat belangrijk is bij het vergelijken van EV’s van verschillende genotypen of behandelingen. Ten tweede werd methanol gebruikt vóór de ultrasone behandeling, wat de afbraak en extractie bevordert en tegelijkertijd het gebruik van detergentsystemen vermijdt die de LC-MS/MS-analyse kunnen bemoeilijken. Ten derde was de ultrasone bewerking kort en gestandaardiseerd, wat geschikt is voor parallelle monsterverwerking. Ten vierde werd de trypsine/Lys-C-digestie uitgevoerd in een zeer klein volume, waardoor verdunning werd beperkt en de terugwinning van peptiden bij lage input werd bevorderd. Ten slotte zorgde de directe overgang van digestie naar verzuring en LC-MS/MS ervoor dat onnodige handelingen tot een minimum werden beperkt.
De downstream LC-MS/MS-methode maakte gebruik van nano-flow omgekeerde-fase-scheiding, gekoppeld aan een Q-Exactive HF Orbitrap-massaspectrometer. De monsters werden opgevangen op een C18-prekolom en vervolgens gescheiden op een analytische kolom met een binnendiameter van 50 µm bij 200 nL/min en 40 °C. De gradiënt liep in 60 minuten van een laag gehalte aan organisch oplosmiddel naar 35% oplosmiddel B, gevolgd door spoelen met een hoog gehalte aan organisch oplosmiddel en re-equilibratie. De MS-acquisitie werd uitgevoerd in de positieve-ionenmodus met behulp van data-onafhankelijke acquisitie met hogere-energie botsingsdissociatie. De DIA-ruwe bestanden werden geanalyseerd met DIA-NN 1.8 met behulp van een in silico voorspelde spectrale bibliotheek.