Ultraskaņas lietojumi MonkeyPox vīrusā
Ultrasonication ir svarīga apstrādes metode pērtiķu baku vīrusa (MPXV) izolēšanai no analītiskajiem paraugiem, vīrusa DNS fragmentācijai, kā arī pērtiķu baku vakcīnas ražošanā. Paraugu sagatavošanai pirms diagnostikas un analīzes (PCR, ELISA uc) ultrasonication tiek izmantots, lai lizētu šūnas, lai atbrīvotu pērtiķu baku vīrusu no šūnu iekšpuses un / vai fragmentētu DNS. Vakcīnu ražošanā pielietojumi svārstās no vīrusa daļiņu / DNS sagatavošanas, iekapsulēšanas zāļu nesējos un sējmateriāla formulēšanas.
Zemāk jūs varat atrast detalizētu informāciju par ultraskaņas pērtiķu baku vīrusa paraugu sagatavošanu, kā arī ultraskaņas MPXV vakcīnas ražošanu.
Ko jūs atradīsiet šajā lapā:
- Ultraskaņas līze pērtiķu baku vīrusa ekstrakcijai
- Monkeypox vīrusa DNS ultraskaņas fragmentācija
- Ultraskaņas lietojumi MPXV vakcīnas ražošanā
Šī 2x 1kW ultrasonikatoru sistēma nepārtrauktas plūsmas darbībai ir uzstādīta vakcīnas ražotnē.
Ultraskaņas līze un DNS fragmentācija pirms polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR)
Pērtiķu baku vīrusa infekciju nosaka ar nukleīnskābes amplifikācijas testēšanu (NAAT), izmantojot reāllaika vai parasto polimerāzes ķēdes reakciju (PCR), lai noteiktu unikālas vīrusu DNS sekvences. Paraugs (piemēram, no nazofaringālās mijmaiņas vai ādas biopsijām) satur vīrusu šūnās.
Analīzei vīruss ir jāatbrīvo no šūnām, un vīrusa DNS ir jābūt sadrumstalotai PCR.
Ultraskaņas līze:
Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi / līze ir uzticama un efektīva metode, lai izolētu vīrusus no šūnu paraugiem, un tādējādi vēlama metode salīdzinājumā ar ķīmiskiem līdzekļiem, piemēram, lizocīmu, proteināzi K un dažādiem mazgāšanas līdzekļiem, kurus alternatīvi izmanto, lai panāktu šūnu līzi un DNS atbrīvošanu.
Tomēr šādu ķīmisko reaģentu izmantošanai ir nepieciešama laikietilpīga parauga sagatavošana vairākos posmos pirms PCR analīzes, lai novērstu PCR reakcijas inhibīciju. Tā kā PCR inhibitori ietekmē amplifikācijas efektivitāti, nelielas inhibitoru daudzuma variācijas, kas netiek noņemtas, var izraisīt lielas PCR produkta amplifikācijas variācijas (Diaco, 1995).
Ultrasonication priekšrocība līzei ir tāda, ka ir vēlams pilnīgs šūnu struktūru traucējums un DNS izdalīšanās bez nepieciešamības pēc lizēšanas reaģentiem un laikietilpīga parauga sagatavošanas. (sal. ar Fykse et al., 2003)
Ultraskaņas DNS fragmentācija:
Ultraskaņas DNS fragmentācija ir vienkārša un uzticama, jo tā rada DNS fragmentus, kas ir regulējami garumā (basepairs, bp). Izmantojot ultraskaņu, DNS var efektīvi sadrumstalot līdz mērķa DNS garumam. Precīza ultraskaņas parametru kontrole un sarežģītas dzesēšanas iespējas novērš DNS degradāciju.
Lasiet vairāk par ultraskaņas DNS sadrumstalotību!
Ultraskaņas lietojumi pērtiķu baku vīrusa vakcīnā
Vakcīnas, ko izmanto pret pērtiķu baku vīrusu, pašlaik ir dzīvu vīrusu vakcīnas. Jaunizveidotās vakcīnas varētu izmantot citas platformas, piemēram, uz DNS balstītas Pašlaik satur modificētu Vaccinia Ankara viurs, novājinātu, nereplicējošu ortodoksvīrusu. Tas satur arī Tris (tris-aminometānu) un nātrija hlorīdu. Vakcīna var saturēt arī nelielu daudzumu DNS un olbaltumvielu no vistas embrija fibroblastu šūnām, ko izmanto, lai audzētu vakcīnas vīrusu, benzonus un antibiotiku savienojumus, piemēram, gentamicīnu un ciprofloksacīnu.
Ultraskaņas homogenizācija tiek izmantota dzīvu novājinātu vīrusu vakcīnu, DNS vakcīnu, multivalentu DNS kokteiļu, mRNS vakcīnu, rekombinantu proteīnu vakcīnu, vīrusveidīgu daļiņu vakcīnu uc ražošanā.
- vīrusa daļiņu un ierosinātāju dispersija
- Emulgācija
- vīrusu inaktivācija
- zāļu nesējpreparāts (NLC, SLN)
- Iekapsulēšana
- aģentu šķīdināšana
- palīgvielu sagatavošana
- Degazēšana / deaerācija
Jūs varat atrast padziļinātu informāciju par ultraskaņas lietojumiem, lai uzlabotu vakcīnu ražošanu!
Protokols pērtiķu baku vīrusa ultraskaņas izolācijai
Stittelaar (2005) pētnieku komanda izmantoja ultraskaņas līzi, lai atbrīvotu pērtiķu baku vīrusu no augšanas saimniekšūnu kultūras, kā arī no šūnām, kas iegūtas, izmantojot rīkles apmaiņu no inficētiem primātiem.
Monkeypox vakcīnas sagatavošana:
Monkeypox vīrusi tika audzēti uz specifiskām patogēniem nesaturošām vistas embriju fibroblastu šūnām. Pēc 1 līdz 2 dienu inkubācijas vīrusa šūnu suspensija tika novākta ar vienu sasaldēšanas un atkausēšanas kārtu un pēc tam koncentrēta centrifugējot. Granulas tika atkārtoti suspendētas un pakļautas vairākām ultraskaņas homogenizācijas kārtām.
Pērtiķu baku vīrusa izolēšana no vakcinētiem makakiem:
Paraugi tika atkausēti trīs reizes un apstrādāti ar ultraskaņu CupHorn. Lai inokulētu Vero šūnu monoslāņus sešu iedobju platēs, tika izmantoti divi atšķaidījumi (1:10 un 1:100) transporta vidē, kas papildināti ar 1% augļa liellopu serumu. Pēc 1 stundas inkubācijas 37°C temperatūrā sējmateriālu noņēma un aizstāja ar barotni, kas papildināta ar 1% augļa liellopu serumu. Monoslāņus kultivēja 5 dienas 37 °C temperatūrā un iekrāsoja ar kristālvioletu šķīdumu.
(sal. ar Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonikatori vīrusu analīzei un vakcīnu ražošanai
Hielscher Ultrasonics plašais produktu portfelis piedāvā ideālu ultrasonicator pētniecības un analītiskajām laboratorijām, kā arī rūpnieciskai vakcīnu ražošanai.
Hielscher Ultrasonics ir specializējies augstas veiktspējas ultrasonikatoru un sono-bioreaktoru projektēšanā, ražošanā un izplatīšanā izmantošanai pētniecības un analītiskajās laboratorijās, kā arī ieviešanai rūpnieciskajā vakcīnu ražošanā (piemēram, Vakcīnas, Api).
Ultraskaņas apstrādi var piemērot atvērtiem kuģiem, slēgtiem nepārtraukti maisāmiem reaktoriem un nepārtrauktas caurplūdes reaktoriem. Visas ultraskaņas sistēmu daļas, kas nonāk saskarē ar šķidro vidi, ir izgatavotas no nerūsējošā tērauda, titāna vai stikla. Autoklavējamās daļas un sanitārie piederumi nodrošina ražošanu saskaņā ar farmācijas klases apstākļi.
Automātiska datu ierakstīšana: Inteliģentā programmatūra automātiski ieraksta ultraskaņas procesa parametrus integrētajā SD atmiņas kartē. Precīza visu procesa parametru kontrole nodrošina Reproducējamība, Ražošanas standartizācija, un veicina farmaceitisko produktu drošuma standartu izpildi.
Hielscher Ultrasonics’ Ultraskaņas procesori ir ļoti uzticami un tos var precīzi kontrolēt. Visi rūpnieciskie ultrasonikatori var pielāgot, lai nodrošinātu pilnu diapazonu no zemākas līdz ļoti augstām amplitūdām. Hielscher ultraskaņas sistēmu izturība ļauj 24/7 darboties lieljaudas režīmā un prasīgā vidē.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu:
| Partijas apjoms | Plūsmas ātrums | Ieteicamās ierīces |
|---|---|---|
| vairāku iedobju / mikrotitru plāksnes | Nav | UIP400MTP |
| 1 līdz 500 ml | 10 līdz 200 ml/min | UP100H |
| 10 līdz 2000 ml | 20 līdz 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 līdz 20L | 02 līdz 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 līdz 100L | 2 līdz 10L/min | UIP4000hdT |
| Nav | 10 līdz 100L/min | UIP16000 |
| Nav | Lielāku | kopa UIP16000 |
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Ultraskaņas DNS nobīde
Adaptēts no Jkwchui saskaņā ar CC-BY-SA.03
Literatūra / Atsauces
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakti, kurus ir vērts zināt
pērtiķu baku vīruss,
Pērtiķu bakas (MPV, MPXV vai hMPXV) ir divslāņu DNS vīrusa suga, kas izraisa vīrusu zoonotisku slimību. Šī slimība ir pazīstama kā pērtiķu baku infekcija, un tā var rasties cilvēkiem un dzīvniekiem. Tas pieder pie Orthopoxvirus ģints Poxviridae ģimenē. Pērtiķu baku vīruss ir viens no cilvēka ortodoksvīrusa vīrusiem kopā ar variola (VARV), govju baku (CPX) un vaccinia (VACV) vīrusiem. Ortopoksvīrusiem ir raksturīgas lielas ķieģeļu formas vīrusa daļiņas, kas satur divvirzienu DNS genomu aptuveni 200 000 bp.
ELISA tests
ELISA apzīmē ar fermentiem saistītu imūnsorbcijas testu un ir marķēta imūnanalīze, kas tiek uzskatīta par imūnanalīžu zelta standartu. ELISA ir imunoloģisks tests, kas novērtēts tā augstās diagnostiskās jutības dēļ, tiek izmantots, lai noteiktu un kvantificētu molekulas, tostarp antivielas, antigēnus, olbaltumvielas, glikoproteīnus un hormonus. ELISA testa princips balstās uz antigēna un antivielas mijiedarbību. Ar šo antigēna un antivielu mijiedarbību specifiskās antivielas saistās ar mērķa antigēnu. Tikai tad, kad notiek mijiedarbība, substrāts var saistīties ar fermentu un var novērot turpmāku substrāta konversiju, kas nozīmē, ka tiek iegūts pozitīvs rezultāts.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.