Ultraskaņas pielietojumi pēkšņo bakas vīrusa gadījumā
Ultraskaņas apstrāde ir svarīga apstrādes metode pēkšņo bakas vīrusa (MPXV) izolēšanai no analītiskiem paraugiem, vīrusa DNS fragmentācijai, kā arī pēkšņo bakas vakcīnu ražošanā. Paraugu sagatavošanai pirms diagnostikas un analīzes (PCR, ELISA utt.) ultraskaņas apstrāde tiek izmantota šūnu līzei, lai atbrīvotu pēkšņo bakas vīrusu no šūnas iekšienes un/vai fragmentētu DNS. Vakcīnu ražošanā pielietojumi ir no vīrusa daļiņu / DNS sagatavošanas, iekapsulēšanas zāļu nesējos līdz inokulu formulēšanai.
Zemāk atradīsiet detalizētu informāciju par ultraskaņas pēkšņo bakas vīrusa paraugu sagatavošanu, kā arī ultraskaņai palīdzošu MPXV vakcīnu ražošanu.
Ko atradīsiet šajā lapā:
- Ultraskaņas līze pēkšņo bakas vīrusa ekstrakcijai
- Ultraskaņas pēkšņo bakas vīrusa DNS fragmentācija
- Ultraskaņas pielietojumi MPXV vakcīnu ražošanā
Šī 2x 1kW ultraskaņas iekārtu sistēma nepārtrauktas plūsmas darbībai ir uzstādīta vakcīnu ražošanas iekārtā.
Ultraskaņas līze un DNS fragmentācija pirms polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR)
Pēkšņo bakas vīrusa infekcija tiek konstatēta, izmantojot nukleīnskābju pastiprināšanas testu (NAAT), lietojot reāllaika vai konvencionālo polimerāzes ķēdes reakciju (PCR), lai noteiktu unikālas vīrusa DNS sekvences. Paraugs (piemēram, no nazofaringeālā uztriepes vai ādas biopsijas) satur vīrusu šūnās.
Analīzei vīruss ir jāatbrīvo no šūnām, un vīrusa DNS ir jāfragmentē PCR.
Ultraskaņas līze:
Ultraskaņas šūnu sagraušana / līze ir uzticama un efektīva metode vīrusu izolēšanai no šūnu paraugiem, un tādējādi tā ir vēlama metode salīdzinājumā ar ķīmiskiem aģentiem, piemēram, lizocīmu, proteināzi K un dažādiem deterģentiem, ko alternatīvi izmanto, lai panāktu šūnu līzi un DNS atbrīvošanu.
Tomēr šādu ķīmisko reaģentu lietošana prasa laikietilpīgu paraugu sagatavošanu vairākos posmos pirms PCR analīzes, lai novērstu PCR reakcijas inhibīciju. Tā kā PCR inhibitori ietekmē pastiprināšanas efektivitāti, nelielas inhibitoru daudzuma variācijas, kas netiek noņemti, var izraisīt lielas variācijas PCR produkta pastiprināšanā (Diaco, 1995).
Ultraskaņas apstrādes priekšrocība līzei ir tā, ka pilnīga šūnu struktūru sagraušana un DNS atbrīvošana bez līzes reaģentiem un laikietilpīgas paraugu sagatavošanas ir vēlama. (skat. Fykse et al., 2003)
Ultraskaņas DNS fragmentācija:
Ultraskaņas DNS fragmentācija ir vienkārša un uzticama, jo tā rada DNS fragmentus ar regulējamu garumu (bāzu pārus, bp). Izmantojot ultraskaņu, DNS var efektīvi fragmentēt līdz mērķa DNS garumam. Precīza kontrole pār ultraskaņas parametriem un izsmalcinātas dzesēšanas iespējas novērš DNS degradāciju.
Uzziniet vairāk par ultraskaņas DNS fragmentāciju!
Ultraskaņas pielietojumi pēkšņo bakas vīrusa vakcīnā
Vakcīnas, ko izmanto pret pēkšņo bakas vīrusu, pašlaik ir dzīva vīrusa vakcīnas. Jaunizstrādātās vakcīnas var izmantot citas platformas, piemēram, DNS balstītas. Pašlaik satur modificētu Vaccinia Ankara vīrusu, novājinātu, nerekrepējošu ortopoksvīrusu. Tas satur arī Tris (tris-aminometānu) un nātrija hlorīdu. Vakcīna var saturēt arī nelielus DNS un proteīna daudzumus no cāļa embrija fibroblastu šūnām, ko izmanto vakcīnas vīrusa audzēšanai, benzonāzi un antibiotiku savienojumus, piemēram, gentamicīnu un ciprofloksacīnu.
Ultraskaņas homogenizācija tiek izmantota dzīvu novājinātu vīrusu vakcīnu, DNS vakcīnu, daudzvērtīgu DNS kokteilu, mRNS vakcīnu, rekombinantu proteīnu vakcīnu, vīrusiem līdzīgu daļiņu vakcīnu utt. ražošanā.
- vīrusa daļiņu un aģentu dispersijas
- emulsifikācijas
- vīrusu inaktivācijas
- zāļu nesēju formulēšanas (NLC, SLN)
- iekapsulēšanas
- aģentu izšķīdināšanas
- adjuvantu sagatavošanas
- degazēšanas / deaerācijas
Protokols pēkšņo bakas vīrusa ultraskaņas izolēšanai
Stittelaar (2005) pētniecības komanda izmantoja ultraskaņas līzi, lai atbrīvotu pēkšņo bakas vīrusu no augšanas saimniekšūnu kultūras, kā arī no šūnām, kas iegūtas, veicot rīkles uztriepes no inficētiem primātiem.
Pēkšņo bakas vakcīnas sagatavošana:
Pēkšņo bakas vīrusi tika audzēti uz specifiski patogēnu brīvām cāļa embrija fibroblastu šūnām. Pēc 1 līdz 2 dienu inkubācijas vīrusa-šūnu suspensija tika iegūta ar vienu sasalšanas-atkausēšanas ciklu un pēc tam koncentrēta ar centrifugēšanu. Nogulsne tika atkārtoti suspendēta un pakļauta vairākiem ultraskaņas homogenizācijas cikliem.
Pēkšņo bakas vīrusa izolēšana no vakcinētām makakām:
Paraugi tika sasaldēti-atkausēti trīs reizes un apstrādāti ar ultraskaņu ultraskaņas CupHorn. Divi atšķaidījumi (1:10 un 1:100) transporta barotnē, kas papildināta ar 1% fetālā govs seruma, tika izmantoti, lai inokulētu Vero šūnu monoslāņus sešu labiņu plāksnēs. Pēc 1 h inkubācijas pie 37°C inokuli tika noņemti un aizstāti ar barotni, kas papildināta ar 1% fetālā govs seruma. Monoslāņi tika audzēti 5 dienas pie 37°C un krāsoti ar kristālvioleta šķīdumu.
(sk. Stittelaar et al., 2005)
Ultraskaņas iekārtas vīrusu analīzei un vakcīnu ražošanai
Hielscher Ultrasonics plašais produktu portfelis piedāvā ideālu ultraskaņas iekārtu pētniecības un analītiskajām laboratorijām, kā arī rūpnieciskai vakcīnu ražošanai.
Hielscher Ultrasonics ir specializējusies augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtu un sono-bioreaktoru projektēšanā, ražošanā un izplatīšanā izmantošanai pētniecības un analītiskajās laboratorijās, kā arī ieviešanai rūpnieciskā vakcīnu ražošanā (piemēram, vakcīnas, API).
Ultraskaņas apstrādi var pielietot atvērtos traukos, slēgtos nepārtraukti maisītos reaktoros un nepārtrauktas plūsmas reaktoros. Visas ultraskaņas sistēmu daļas, kas saskaras ar šķidro vidi, ir izgatavotas no nerūsējošā tērauda, titāna vai stikla. Autoklavējamas daļas un sanitāras armatūras nodrošina ražošanu farmācijas klases apstākļos.
Automātiska datu reģistrēšana: Inteliģenta programmatūra automātiski reģistrē ultraskaņas apstrādes procesa parametrus integrētā SD atmiņas kartē. Precīza kontrole pār visiem procesa parametriem nodrošina atkārtojamību, ražošanas standartizāciju, un veicina farmācijas produktu drošības standartu ievērošanu.
Hielscher Ultrasonics’ ultraskaņas procesori ir ļoti uzticami un tos var precīzi kontrolēt. Visas rūpnieciskās ultraskaņas iekārtas var pielāgot, lai nodrošinātu pilnu diapazonu no zemākām līdz ļoti augstām amplitūdām. Hielscher ultraskaņas sistēmu izturība ļauj darboties 24/7 smagos apstākļos un prasīgās vidēs.
Zemāk esošajā tabulā ir sniegta informācija par aptuveno mūsu ultraskaņas iekārtu apstrādes jaudu:
| Partijas tilpums | Plūsmas ātrums | Ieteicamās iekārtas |
|---|---|---|
| daudzlabiņu / mikrotitrēšanas plāksnes | n/a | UIP400MTP |
| 1 līdz 500mL | 10 līdz 200mL/min | UP100H |
| 10 līdz 2000mL | 20 līdz 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 līdz 20L | 0,2 līdz 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 līdz 100L | 2 līdz 10L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 līdz 100L/min | UIP16000 |
| n/a | lielāks | klasteris no UIP16000 |
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Ultraskaņas DNS bīde
Adaptēts no Jkwchui saskaņā ar CC-BY-SA.03
Literatūra / Atsauces
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakti, kas vērts zināt
Pēkšņo bakas vīruss
Pēkšņo bakas (MPV, MPXV vai hMPXV) ir divpavedienu DNS vīrusa suga, kas izraisa vīrusu zoonotisku slimību. Šī slimība ir pazīstama kā pēkšņo bakas infekcija un var rasties cilvēkiem un dzīvniekiem. Tā pieder Orthopoxvirus ģintij Poxviridae dzimtā. Pēkšņo bakas vīruss ir viens no cilvēka ortopoksvīrusiem kopā ar variola (VARV), cowpox (CPX) un vaccinia (VACV) vīrusiem. Ortopoksvīrusiem raksturīgas lielas ķieģeļveida vīrusa daļiņas, kas satur divpavedienu DNS genomu ar aptuveni 200 000 bp.
ELISA tests
ELISA nozīmē Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay un ir marķēts imūntests, kas tiek uzskatīts par imūntestu zelta standartu. ELISA ir imunoloģisks tests, kas tiek novērtēts pēc tā augstās diagnostiskās jutības, un to izmanto, lai noteiktu un kvantificētu molekulas, tostarp antivielas, antigēnus, proteīnus, glikoproteīnus un hormonus. ELISA princips balstās uz antigēna-antivielas mijiedarbību. Ar šo antigēna-antivielas mijiedarbību specifiskās antivielas piesaistās savam mērķa antigēnam. Tikai tad, kad notiek mijiedarbība, substrāts var piesaistīties fermentam, un var novērot turpmāku substrāta konversiju, kas nozīmē, ka tiek iegūts pozitīvs rezultāts.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no laboratorijas mēroga līdz rūpnieciskam izmēram.