Sonication fir Lysis: Zell Stéierungen an Extraktioun
Zell Desintegratioun oder Lysis ass e gemeinsame Bestanddeel vun der deeglecher Probepräparatioun an Biotech Laboratoiren. D'Zil vun der Lysis ass Deeler vun der Zellmauer oder der kompletter Zell ze stéieren fir biologesch Moleküle ze befreien. Ultrasonic Homogenisatoren gi wäit benotzt fir erfollegräich Zelllysis. De grousse Virdeel vu sophistikéierten Ultraschaller ass déi präzis Kontroll iwwer Prozessparameter wéi Intensitéit an Temperatur, wat eng sanft, awer héich effizient Zellstéierung an Extraktioun erlaabt.
Zell Lysis mat Ultraschall
Ultraschallzellelysis an Extraktioun ass eng Method déi benotzt gëtt fir Zellen opzebriechen an den Inhalt mat héijer Frequenz Tounwellen ze extrahieren, dh Ultraschall. Sonication ass eng Lysis Technik, déi wäit benotzt gëtt als etabléiert an zouverlässeg Methode fir Zell Stéierungen an Extraktioun vun intracellular Material. Ultrasonic Lysis ass eng zouverlässeg Technik fir Lysat ze preparéieren mat zB Plasmid, Rezeptor Assays, Proteinen, DNA, RNA asw. all Substanz a Medium fir spezifesch Uwendungsufuerderungen z'erreechen. Folgend Schrëtt vun der Lysis sinn Fraktioun, Organelle Isolatioun oder / a Proteinextraktioun a Reinigung. Dat extrahéiert Material (= Lysat) muss getrennt ginn an ënnerleien weider Ermëttlungen oder Uwendungen, zB fir proteomesch Fuerschung.
Ultraschall Homogenisatoren UP100H (100 Watt) an UP400St (400 Watt) fir Probepräparatioun wéi Lysis an Extraktioun.
Am Verglach mat aner Zell Lysis an Extraktioun Methoden, Ultraschall Zell Lysis huet verschidde Virdeeler:
- Geschwindegkeet: Ultrasonic Zell Lysis an Extraktioun ass eng séier Method déi Zellen an e puer Sekonnen opbriechen kann. Dëst ass vill méi séier wéi aner Methoden wéi Homogeniséierung, Afréiere-Dauen oder Perlen-Fräsen.
- Effizienz: Ultrasonic Zell Lysis an Extraktioun kënne benotzt ginn fir kleng, grouss oder multiple Proben op eemol ze behandelen, wat et méi effizient mécht wéi aner Methoden déi individuell Veraarbechtung vu klenge Proben erfuerderen.
- Chemesch-gratis: Ultraschallzellelyse an Extraktioun ass eng net-invasiv Method déi net d'Benotzung vu schaarfe Chemikalien oder Enzymen erfuerdert. Dëst mécht et ideal fir Uwendungen wou d'Integritéit vum Zellinhalt erhale muss. Ongewollte Kontaminatioun vu Proben kann vermeit ginn.
- Héich Rendement: Ultraschall Zell Lysis an Extraktioun kann eng héich Ausbezuelen vun Zell Inhalt Extrait, dorënner DNA, RNA, a Proteinen. Dëst ass well déi héichfrequenz Tounwellen d'Zellmaueren opbriechen an den Inhalt an d'Ëmgéigend Léisung fräiginn.
- Temperaturregelung: Raffinéiert Ultraschaller erlaben eng präzis Temperaturkontroll vun der Probe. Hielscher digital Sonicators si mat engem pluggable Temperatursensor an Temperatur Iwwerwaachungssoftware ausgestatt.
- Reproduzéierbar: Protokoller fir Ultraschallzelllysis kënnen einfach reproduzéiert ginn a souguer mat verschiddene méi grouss oder méi kleng Probevolumen duerch eng einfach linear Skala-up passen.
- Villsäiteg: Ultraschallzellelysis an Extraktioun kënne benotzt ginn fir eng breet Palette vun Zelltypen ze extrahieren, dorënner Bakterien, Hef, Pilze, Planzen a Mamendéierenzellen. Et kann och benotzt ginn fir verschidden Aarte vu Molekülen ze extrahieren, dorënner Proteinen, DNA, RNA a Lipiden.
- Gläichzäiteg Virbereedung vu ville Proben: Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir bequem vill Proben ënner de genaue selwechte Prozessbedéngungen ze veraarbechten. Dëst mécht de Probevirbereedungsschrëtt vu Lysis an Extraktioun héich effizient an Zäitspuerend.
- Einfach ze benotzen: Ultrasonic Zell Lysis an Extraktioun Ausrüstung ass einfach ze benotzen an erfuerdert minimal Ausbildung. D'Ausrüstung ass och wiertschaftlech well et eng eenzeg Investitioun ass ouni Noutwendegkeete fir d'Entsuergung nei ze kafen. Dëst mécht et attraktiv fir eng breet Palette vu Fuerscher a Laboratoiren.
Insgesamt ass d'Ultraschallzellelyse an d'Extraktioun eng séier, effizient, präzis kontrolléierbar a versatile Method fir Zellinhalt ze extrahieren. Seng Virdeeler iwwer alternativ Methoden maachen et eng attraktiv Wiel fir eng breet Palette vu Fuerschung an industriell Uwendungen.
Aarbechtsprinzip vun Ultrasonic Zell Lysis
Ultraschallzellelyse an Extraktioun benotzt héichfrequenz Tounwellen fir Zellen ze stéieren an hiren Inhalt ze extrahieren. D'Schallwellen kreéieren Drockverännerungen an der Ëmgéigend Flëssegkeet, sou datt kleng Blasen bilden an zesummebriechen an engem Prozess bekannt als Kavitatioun. Dës Bubbles generéieren lokaliséiert héich intensiv mechanesch Kräften, déi Zellen opbriechen an hiren Inhalt an d'Ëmgéigend Léisung fräiginn.
Zell Lysis mat Hëllef vun engem Ultrasonicator ëmfaasst allgemeng déi folgend Schrëtt:
- D'Probe gëtt an engem Rouer oder Container mat engem flëssege Puffer plazéiert.
- Eng Ultraschallsonde gëtt an d'Probe agebaut, an héichfrequenz Tounwellen mat ca. 20-30 kHz ginn applizéiert.
- D'Ultraschallwellen verursaachen Schwéngung a Kavitatioun an der Ëmgéigend Flëssegkeet, generéieren lokaliséiert Kräfte, déi oppen Zellen briechen an hiren Inhalt fräiginn.
- D'Probe gëtt centrifugéiert oder gefiltert fir all cellulär Schutt ze läschen, an den extrahéierten Inhalt gëtt fir Downstream Analyse gesammelt.
Mächteg Ultraschallwellen stéieren d'Zellmatrix vu biologesche Strukturen a befreien déi bioaktiv Verbindungen. Massentransfer tëscht dem Planzmaterial an dem Léisungsmëttel (zB Puffer) gëtt verstäerkt. (Grafik: ©Vilkhu et al., 2006)
Nodeeler vun gemeinsam Lysis Methoden
Wärend Ärer Aarbecht an de Laboratoiren, hutt Dir vläicht schonn de Stress vun der Zelllyse mat traditionelle mechanesche oder chemesche Lysisprotokoller erlieft.
- Mechanesch Lysis: Mechanesch Lysismethoden, wéi zum Beispill Schleifen mat Mörser a Pistel oder Homogeniséierung mat enger franséischer Press, Perlemillen oder Rotor-Stator System feelen dacks Präzise Kontroll- an Upassungsoptiounen. Dëst bedeit datt d'Benotzung vu Fräsen a Schleifen séier Hëtzt a Schéierkraaft generéiere kann, déi d'Probe beschiedegen an d'Proteine denaturéieren. Si kënnen och Zäit-opwänneg sinn a grouss Quantitéiten vun Startmaterial verlaangen.
- Chemesch Lysis: Chemesch Lysismethoden, sou wéi Detergent-baséiert Lysis, kënnen d'Probe beschiedegen andeems d'Lipid-Dualschicht stéiert an d'Proteine denaturéiert. Si kënnen och verschidde Schrëtt erfuerderen a kënne Reschtverschmotzungen hannerloossen, déi mat Downstream Uwendungen stéieren. Déi optimal Doséierung vum Detergent ze fannen ass eng zousätzlech Erausfuerderung.
- Afréiere-Thaw Zyklen: Gefruer-Thaw-Zyklen kënnen d'Zellmembranen zerbriechen, awer widderholl Zyklen kënnen och Proteindenaturatioun an Degradatioun verursaachen. Dës Method kann och méi Zyklen erfuerderen, wat Zäitopwendeg ka sinn an dacks zu méi nidderegen Ausbezuelen resultéiert.
- Enzymatesch Lysis: Enzymatesch Lysismethoden kënne spezifesch fir verschidden Zellarten sinn a verschidde Schrëtt erfuerderen, wat se Zäitopwendeg mécht. Si generéieren och Offall a erfuerderen virsiichteg Optimiséierung fir Degradatioun vun der Probe ze vermeiden. Enzymatesch Lysis Kits sinn dacks deier. Wann Är aktuell enzymatesch Lysis Prozedur net genuch Resultater gëtt, kann d'Sonicatioun als synergistesch Method applizéiert ginn fir d'Zellstéierung ze verstäerken.
Am Géigesaz zu konventionelle mechanesche a Chemikalien Zell Lysis Methoden, ass d'Sonication e ganz effizient an zouverléisseg Tool fir Zell Desintegratioun, déi eng komplett Kontroll iwwer d'Sonicatiounsparameter erlaabt. Dëst garantéiert eng héich Selektivitéit op Materialverëffentlechung a Produktreinheet. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Et ass gëeegent fir all Zell Zorte an einfach applicabel a kleng a grouss Skala – ëmmer ënner kontrolléierte Konditiounen. Ultrasonicators sinn einfach ze botzen. En Ultraschallhomogenisator huet ëmmer Clean-in-Place (CIP) a Sterilize-in-Place (SIP) Funktioun. D'Sonotrode besteet aus engem massiven Titanhorn, deen a Waasser oder Léisungsmëttel gewäsch oder gespullt ka ginn (ofhängeg vum Aarbechtsmedium). Den Ënnerhalt vun Ultraschaller ass wéinst hirer Robustheet bal vernoléisseg.
Ultraschall Lysis an Zell Stéierung
Allgemeng ass d'Lyphis vu Proben am Labo tëschent 15 Sekonnen an 2 Minutten daueren. Well d'Intensitéit vun der Opléisung ganz einfach gëtt duerch Amplitude z'änneren fir eng sonication ze maachen an och duerch d'Choix vun der richteger Ausrüstung ass et méiglech, Zellmembranen ganz onfähech oder ganz abrupt ze stéieren, hänkt dovun of der Zellstruktur an am Lysezweck ( zB DNA Extraktioun erfordert méi dënnere Oploen, déi komplett Protein Extraktioun vun Bakterien erfordert eng méi intensiv Ultraschallbehandlung). D'Temperatur während de Prozess kann duerch en integréierte Temperatursensor kontrolléiert ginn an duerch d'Kukkelen (Eisbaden oder Stroumzellen mat Kéijacken) kontrolléiert ginn oder duerch Schwangeren am gepulste Modus sinn. Während der Pulsmodus sinn d'Kuerz sonikplaatz Zykleten vun 1-15 Sekunden Dauer fir Wärmevergëftung a Ofkillen während de länger intermittierend Perioden.
All Ultraschall-Prozeduren sinn komplett reproduzéiert a linear skalierbar.
De VialTweeter ass en Ultraschallhomogenisator fir gläichzäiteg, eenheetlech a séier steril Virbereedung vu ville Proben.
Ultraschall Homogeniséierer fir Zell Lysis an Extraktioun
Verschidde Typen vun Ultraschall-Geräter erlaben de Probepreparatiounsziel ze passen an d'Benotzerfrëndlechkeet an d'Operatiounskomfort ze garantéieren. Sonde-Typ Ultraschaller sinn déi heefegst Apparater am Labo. Si si am meeschte gëeegent fir d'Virbereedung vu klengen a mëttelgrousse Proben mat Volumen vun 0,1mL bis 1000mL. Verschidde Kraaftgréissten a Sonotroden erlaben den Ultraschall un d'Probevolumen an d'Behälter unzepassen fir déi effektiv an effizient Sonikatiounsresultater. Den Ultraschallsondeapparat ass déi bescht Wiel wann eenzel Proben musse virbereet ginn.
Wann méi Proben musse virbereet ginn, zB 8-10 Fläschen vun Zellléisung, eng intensiv indirekt Sonikatioun mat Ultraschallsystemer wéi de VialTweeter oder en Ultraschall-Kuphorn sinn déi gëeegent Homogeniséierungsmethod fir eng effizient Lysis. Verschidde Fläschen ginn zur selwechter Zäit sonicéiert, mat der selwechter Intensitéit. Dëst spuert net nëmmen Zäit, awer garantéiert och déiselwecht Behandlung vun all Proben, wat d'Resultater tëscht de Proben zouverlässeg a vergläichbar mécht. Ausserdeem gëtt während indirekter Sonikatioun Kräizkontaminatioun duerch Tauche vun der Ultraschall Sonotrode (och bekannt als Ultraschallsonde, Horn, Tipp oder Fanger) vermeit. Zënter individuell op Probegréisst passend Fläschen benotzt ginn, ginn Zäitopwänneg Botzen a Probeverloscht wéinst Dekantéiere vu Schëffer ausgelooss. Fir déi eenheetlech Sonikatioun vu Multiwell oder Mikrotiterplacke bitt Hielscher den UIP400MTP.
Fir méi héicht Volumen, zB fir d'kommerzielle Produktioun vun Zellextrakten, sinn kontinuéierlech Ultraschallsysteme mat engem Stroumzellenreaktor am meeschte passend. D'kontinuéierlech a souguer d'Stréimung vum veraarbechten Material garantéiert eng Evenementatioun. All Parameteren vum Ultraschalldepensiounsprozess kënne optiméiert a gerechtfäerdegt sinn op d'Ufuerderungen vun der Applikatioun an dem spezifesche Zellmaterial.
Virsiichteg Prozedur fir Ultraschall-Lyséieren vun bakteriellen Zellen:
- Virbereedung vun der Zellsuspension: D'Zellpellets mussen ganz an enger Puffer-Léisung vu Homogeniséierung suspendéiert ginn (wielt Är Puffer-Léisung kompatibel mat der folgender Analyse, zB speziell Chromatographie-Methode). Lysozyme a / oder aner Additive addéieren, wann néideg (se mussen och mat Trennung / Purifikatiounsmëttelen kompatibel sinn). Mixen / Homogenize d'Léisung sanft ënnert mild sonication bis d'komplett Ofhängegkeet erreecht gëtt.
- Ultraschall Lyse: Plaz d'Probe an engem Ice Bath. Bei der Zort vun der Zelle sinn d'Suspension op 60-90 Sekonne Burst (ouni de Pulsmodus vun Ärem Ultraschall) ze soniciséieren.
- Trennung: Santrifuge de Lysat (zB 10 min. Op 10.000 xg, bei 4degC). Separat den Iwwerstand vu der Zellpellet séch aus. De Supernatant ass d'total Zelllysat. No der Filtratioun vum Iwwerstand kritt Dir eng geklärte Fliissem vum löslechen Zellprotein.
Déi meescht gemeinsam Applikatiounen fir Ultrasieger an der Biologie a Biotechnologie sinn:
- Zuelemarktpräparatioun
- Ënnerbriechung vun Hef, Bakterien, Planzzellen, mëll oder hart Zellgewebe, Nukleinmaterial
- Protein Extraktioun
- Virbereedung an Isoléierung vun Enzymen
- Produktioun vun Antigen
- DNA Extraktioun a / oder gezielte Fragmentéierung
- Liposomen preparéieren
Zell Stéierungen mat Sonde-Typ Ultrasonicator ass eng efficace Probe Virbereedung Method.
D'Tabell hei drënner gëtt Iech en Iwwerbléck iwwer eis Ultraschaller fir Zellstéierung an Extraktioun. Klickt op den Apparattyp fir méi Informatioun iwwer all Ultraschallhomogenisator ze kréien. Eis gutt trainéiert a laangjäreg Erfarungen technesch Personal wäerte frou Iech ze hëllefen de passenden Ultraschall fir Är Proben ze wielen!
| Konte gefouert QShortcut | Duerchflossrate | recommandéiert Comments |
|---|---|---|
| bis zu 10 Fläschen oder Réier | na | VialTweeter |
| multiwell / microtiter Placke | na | UIP400MTP |
| multiple Réier / Schëffer | na | Cuphorn |
| 1 bis 500mL | 10 bis 200mL / min | UP100H |
| 10 bis 1000 ml | 20 bis 200 ml/min | UP200Ht, An UP200St |
| 10 bis 2000mL | 20 bis 400mL / min | UP400St |
Déi mannfollef Applikatioune vu Ultraschallzweige sinn an de Sektoren Biotechnologie, Bioengineering, Mikrobiologie, Molekularbiologie, Biochemie, Immunologie, Bakteriologie, Virologie, Proteomik, Genetik, Physiologie, Zellbiologie, Hämatologie a Botanik.
Lysis: Zell Strukturen briechen
Zellen si geschützt mat enger halle permeablen Plasma-Membran déi aus engem phospho-lipid-bilayer (och Protein-Lipid-bilayer, aus hydrophobe Lipiden a hydrophilen Phosphor-Molekülen mat embedded Proteinmolekülen) geschafe gëtt an eng Barriär tëscht dem Zellinterior (Cytoplasmus) der extrazellularer Ëmwelt. Planzenzellen a prokaryotesch Zellen si mat enger Zellmauer ëmginn. Wéinst multiple Schichten décke Zellmauer vun Cellulose, Planzenzellen méi schwéier wéi Lysezellen. D'Zille Interieur, wéi zB Organelen, Käre, Mitochondioun, gëtt stabiliséiert duerch den Zytoskeleton.
Duerch d'Lyséierung vun den Zellen ass et fir d'Ofleegung an d'Trennung vun den Orgelen, Proteinen, DNA, mRNA oder aner Biomolekülen.
Konventionell Methoden vun Zell Lysis an hir Nodeeler
Et gi verschidde Methoden fir Lysat-Zellen, déi ënnerdeeleg a mechanesch a chemesch Methoden gedeelt kënne ginn, wat d'Verwende vu Wäschmëttelen oder Léisungsmëttelen, d'Applikatioun vum Héichawen oder d'Verwenden vun enger Wëldzäite oder enger franséich Press. De Problemstudent mat dësem Method ass d'schwiereg Kontroll a Justifizéierung vun Prozessparameter a beaflosst.
D'Tabell hei ënnen weist d'Haaptnodeeler vun allgemenge Lysismethoden:
Table: Konventionell Methoden vun Zelle Lyse hun grouss Nodeeler
Prozedur vun Lysis
Lysis ass e sensibel Prozess. Während der Lycis ass de Schutz vun der Zellmembran zerstéiert ginn, awer d'Inaktivéierung, Denaturatioun an d'Degradatioun vun den extrahierten Proteinen duerch eng onphysiologësch Ëmwelt (Ofwielung vum pH-Wert) muss verhënnert ginn. Dofir gëtt am allgemenge Lyse an enger Pufferungsléisung ausgeführt. Déi meescht Schwieregkeeten entstoen duerch onkontrolléiert Zelle Stéierung, déi zu engem onbeschiedene Release vun all intrazellulärem Material oder / an d'Denaturatioun vum Zilprodukt resultéieren.
Literatur / nëmmen
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.