Genetesch Transformatioun a Planzenzelle mat Ultraschall

Duerch Ultraschall ënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) ass eng effizient Method, fir Planzenzelle mat frieme Genen ze infizéieren, woubäi Agrobacterium als Transportmëttel déngt. Ultraschallkavitatioun verursaacht Sonoporatioun, déi als geziilt Mikroverletzung vu Planzegeweebe beschriwwe ka ginn. Duerch dës mat Ultraschall verursaacht Mikroverletzunge kënnen DNA an DNA-Vektoren effizient an d’Zellmatrix transportéiert ginn.

Sonoporatioun – Duerch Ultraschall verbessert Zelltransformatioun

Wann nidderfrequenten Ultraschall (ongeféier 20kHz) op Zellsuspensiounen applizéiert gëtt, verursaachen d’Effekter vun der akustescher Kavitatioun eng temporär Erhéijung vun der Membranpermeabilitéit am Zellgeweebe. Dësen Ultraschalleffekt ass als Sonoporatioun bekannt a gëtt fir de Gentransfer an Zellen oder Geweebe benotzt.
D’Virdeeler vun der Ultraschallbehandlung baséieren op hirem netthermesche mechanesche Wierkprinzip, wouduerch si dacks méi villsäiteg a manner ofhängeg vun den Zelltyppen ass. Déi villsäiteg Uwendung vun der Sonoporatioun erméiglecht d’Notzung vun transgene Planzen, déi e bedeitend Potenzial fir d’Bioproduktioun vu komplexe mënschlechen therapeutesche Proteinnen hunn. Esou planzebaséiert Bioreaktore kënne liicht genetesch manipuléiert ginn, verhënneren déi potenziell Kontaminatioun mat mënschleche Pathogenen, beschiedegen d’Bakterien, déi d’Transformatioun vermëttelen (z. B. Agrobacterium), net a stellen eng käschtegënschteg, wierksam Method vun der Biosynthees duer.

Duerch Ultraschall ënnerstëtzt Zelltransformatioun

D’Ultraschallbehandlung ass eng Technik, déi nidderfrequent Ultraschallwelle benotzt, fir Partikelen an enger Léisung a Beweegung ze versetzen a Léisungen ze vermëschen, an doduerch d’Geschwindegkeet vum Stofftransport a vum Opléisen ze erhéijen. Gläichzäiteg kann d’Ultraschallbehandlung opgeléiste Gasen aus Flëssegkeeten ewechhuelen. Bei der Planzentransformatioun verursaacht d’Ultraschallbehandlung d’Bildung vu Mikroverletzungen um Planzegeweebe a verbessert d’Abrénge vu plakeger DNA an de Planzeprotoplast.

Fir d’genetesch Transformatioun ass déi duerch Ultraschall ënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) déi bevorzugt Method an huet eng däitlech méi héich Effizienz wéi d’Ultraschallbehandlung, déi benotzt gëtt, fir plakeg DNA an DNA-Vektoren direkt an de Protoplast ze transferéieren. Vill Studien hu gewisen, datt déi duerch Ultraschall ënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) benotzt ka ginn, fir duerch Ultraschallwellen an déi doraus entstoend akustesch Kavitatioun eng mechanesch Beschiedegung an d’Bildung vu Wonnen u Planzenzellen auszeléisen. Eng kuerz Ultraschallbehandlung verursaacht Mikroverletzungen op der Uewerfläch vun Explantater. Well déi verletzten Zellen et Agrobacterium erlaben, an déi méi déif Deeler vum Planzegeweebe anzedréngen, klëmmt d’Warscheinlechkeet, datt Planzenzellen infizéiert ginn. Zousätzlech verbesseren déi ofgesënnert phenolesch Verbindungen d’Transformatioun. Déi duerch Ultraschall verursaacht Mikroverletzungen erliichteren och d’Andrénge vu Bakterien an d’Explantater. SAAT gouf erfollegräich fir d’genetesch Transformatioun vu Planzenaarten agesat, déi als besonnesch resistent géint Agrobacterium ugesi ginn.
Déi gréisst Virdeeler vu SAAT sinn, datt et eng ganz einfach a käschtegënschteg Method ass an datt se de Gentransfer duerch Agrobacterium däitlech verbessert. Nieft der erfollegräicher Uwendung vu SAAT bei der Transformatioun vu Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. gouf dës Approche och fir d’Produktioun vu rekombinantem hëtztlabillem Holotoxin vum Escherichia coli-Wëldtyp a vun LT-Impfstoffadjuvante vun Escherichia coli-Mutanten an Nicotiana tabacum agesat, woubäi déi héchst systemesch LT-B-spezifesch IgG-Titere bei Vulle festgestallt goufen.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Allgemengt Verfare fir de Gentransfer duerch Sonoporatioun a Planzenzellen

1. Virbereedung vum genetesche Material: Fänkt domat un, dat genetescht Material virzebereeden, dat Dir an d’Planzenzellen abréngen wëllt. Dëst kéint Plasmid-DNA, RNA oder aner Nukleinsaieren sinn.
2. Isolatioun vu Planzenzellen: Isoléiert d’Planzzellen, déi Dir cibléiere wëllt. Jee no Ärem Experiment kënnen dës Zellen aus Planzegeweeben oder Kulturen isoléiert ginn.
3. Zellsuspensioun: Suspendéiert d’Planzzellen an engem gëeegente Medium oder Puffer. Dëst ass wesentlech, fir sécherzestellen, datt d’Zelle gesond sinn an an engem Zoustand sinn, deen d’Opnam vu Genen begënschtegt.
4. Riicht Äert Ultraschallgerät an: Bereet Äert Ultraschallgerät mat Sond vir, andeems Dir d’Beschallungsparameter wéi Amplitüd, Zäit, Energie an Temperatur am Viraus astellt. Daucht d’Ultraschallsond an d’Zellsuspensioun an.
5. Beschallung: Start d’Beschallung. Déi séier Schwéngung vun der Sondespëtzt generéiert Kavitatiounsblosen an der Flëssegkeet. Dës Blose deene sech duerch d’Ultraschallwellen aus a kollabéieren, wouduerch mechanesch Kräften a Mikrostréimungen an der Suspensioun entstinn.
6. Sonoporatioun: Déi mechanesch Kräften a Mikrostréimungen, déi duerch d’Kavitatioun entstinn, schafen temporär Poren a Lächer an de Membrane vun de Planzzellen. Dat genetescht Material, dat an der Suspensioun virkënnt, kann duerch dës Poren an d’Planzzellen erakommen.
7. Inkubatioun: Inkubéiert d’Planzzellen no der Sonoporatiounsbehandlung, fir datt si sech erhuelen an hir Membrane stabiliséiere kënnen. Dëst ass en entscheedende Schrëtt, fir d’Iwwerliewe vun den Zellen an en erfollegräiche Gentransfer ze garantéieren.

Gentransfer iwwer Agrobacterium oder Liposomen

Et ginn zwou geleefeg Methode fir d’Transfektioun vu Planzzellen. Si benotzen entweder Agrobacterium, eng Gattung vu gramnegative Bakterien, oder Liposomen als Dréier vum genetesche Material.

• Duerch Agrobacterium vermëttelt Sonoporatioun: Agrobacterium tumefaciens ass eng Bakterie, déi heefeg an der Gentechnik bei Planze benotzt gëtt. Bei dëser Method gëtt Plasmid-DNA, déi dat gewënschte Gen enthält, an Agrobacterium agebruecht, deen duerno mat Planzzelle gemëscht gëtt. D’Zellsuspensioun gëtt mat engem Ultraschallgerät mat Sond enger Sonoporatioun ënnerzunn. D’Ultraschallenergie verbessert den Transfert vum genetesche Material vun Agrobacterium an d’Planzzellen. Dës Method gëtt breet fir d’genetesch Verännerung vu Planzen agesat.
• Duerch Liposome vermëttelt Sonoporatioun: Liposome si Vesikelen op Lipidbasis, déi genetescht Material transportéiere kënnen. Bei dëser Method gi Liposomen, déi mat Plasmid-DNA oder aneren Nukleinsaieren beluede sinn, mat Planzzelle gemëscht. Sonoporatioun mat engem Ultraschallgerät mat Sond gëtt agesat, fir d’Opnam vu Liposomen duerch Planzzellen ze erliichteren. Den Ultraschall brécht d’Lipidduebelschichte vun de Liposomen op, wouduerch dat genetescht Material an d’Planzzelle fräigesat gëtt. Dës Approche ass nëtzlech fir Studie vun der transienter Genexpressioun a Planzzellen.

Wëssenschaftlech nogewise Virdeeler vun der duerch Beschallung ënnerstëtzter, duerch Agrobacterium vermëttelter Transformatioun (SAAT)

Déi duerch Beschallung ënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) gouf bei ville Planzenaarten agesat. Eng kuerz a relativ mëll Ultraschallbehandlung vu Planzzellkulture verursaacht Sonoporatioun, déi duerno en déift Andréngen vun Agrobacterium als Gentransporter erméiglecht. Hei drënner kënnt Dir exemplaresch Studie liesen, déi déi positiv Effekter vu SAAT weisen.

Duerch Ultraschall ënnerstëtzt Transformatioun vun Ashwagandha

Fir d’Transformatiounseffizienz bei W. somnifera (bekannt als Ashwagandha oder Wanterkiischt) ze verbesseren, hunn Dehdashti a seng Kolleegen (2016) den Asaz vun Acetosyringon (AS) an Ultraschallbehandlung ënnersicht.
Acetosyringon (AS) gouf an dräi Etappen derbäigesat: an der Agrobacterium-Flëssegkultur, bei der Infektioun mat Agrobacterium a bei der Kokultur vun Explantater mat Agrobacterium. D’Zousaz vu 75 μM AS zur Agrobacterium-Flëssegkultur huet sech als optimal fir d’Induktioun vu vir-Genen erwisen.
Déi zousätzlech Ultraschallbehandlung (SAAT) huet zu der héchster Genexpressioun gefouert. D’Expressioun vum gusA-Gen an Hoerwuerzelen huet sech als am beschten erwisen, wann d’Blieder 10s an d’Sprossspëtzten 20s laang mat Ultraschall behandelt goufen. D’Transformatiounseffizienz vum verbesserte Protokoll gouf mat 66,5 fir Blatexplantater a mat 59,5% fir Sprossspëtzenexplantater erfaasst. Am Verglach mat anere Protokoller gouf festgestallt, datt d’Transformatiounseffizienz vun dësem verbesserte Protokoll fir Blieder 2,5-mol a fir Sprossspëtzten 3,7-mol méi héich war. Southern-Blot-Analysen hunn 1–2 Kopië vum gusA-Transgen an de Linne W1-W4 bestätegt, wärend an der Linn W5, déi mam verbesserte Protokoll produzéiert gouf, 1–4 Transgenkopien nogewise goufen.

Afloss vun der Dauer vun der ultraschallënnerstëtzter, duerch Agrobacterium vermëttelter Transformatioun (SAAT) op d’Transformatiounsfrequenz vu Blat- (a) a Sprossspëtzenexplantater (b) vu W. somnifera
(Etüd a Grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraschallënnerstëtzt Transformatioun vu Kotteng

Hussain et al. (2007) weisen déi positiv Effekter vun der ultraschallënnerstëtzter Transformatioun vu Kotteng. Akustesch Kavitatioun, déi duerch nidderegfrequenten Ultraschall verursaacht gëtt, schaaft Mikroverletzungen op an ënner der Uewerfläch vum Planzegeweebe (Sonoporatioun) an erméiglecht et Agrobacterium, méi déif a komplett duerch dat ganzt Planzegeweebe ze wanderen. Dës Aart vu Verletzung erhéicht d’Warscheinlechkeet, Planzenzellen ze infizéieren, déi méi déif am Geweebe leien. Fir d’Transformatiounseffizienz vun der SAAT ze bewäerten, gouf d’Expressioun vum GUS-Gen gemooss. De GUS-Reportersystem ass e Reportergensystem, dee besonnesch an der molekularer Planzebiologie an an der Mikrobiologie nëtzlech ass. Duerch d’Upassung vu verschiddene SAAT-Parameteren gouf déi transient GUS-Expressioun am Kotteng bei der Notzung vu räifen Embryonen als Explantat däitlech verstäerkt. GUS gouf fir d’éischt 24h no der Inkubatioun vun den Explantater nogewisen, an no 48h war d’GUS-Expressioun ganz intensiv, wat als nëtzlechen Indikator fir déi erfollegräich Transformatioun vum Kottengexplantat no der ultraschallënnerstëtzter, duerch Agrobacterium vermëttelter Transformatioun (SAAT) gedéngt huet. Beim Verglach vu verschiddenen Transformatiounstechniken (nämlech biolistesch Transformatioun, Agro, BAAT, SAAT) huet déi ultraschallënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) mat Ofstand déi bescht Transformatiounsresultater gewisen.

Auswiel vun der Transformatiounsprozedur op Basis vun der transienter GUS-Expressioun. Déi ultraschallënnerstëtzt, duerch Agrobacterium vermëttelt Transformatioun (SAAT) weist eng däitlech méi héich transient Expressioun.
(Etüd a Grafik: © Hussain et al., 2007)

Héichleeschtungsultraschallléisunge fir Sonoporatioun a SAAT

Hielscher Ultrasonics huet laangjäreg Erfarung an der Entwécklung an der Fabrikatioun vun héichleeschtungsfäegen Ultraschallapparater fir Laboratoiren, Fuerschungsariichtungen an och fir d’industriell Produktioun mat ganz héijen Duerchsätz. Fir d’Mikrobiologie an d’Liewenswëssenschafte bitt Hielscher verschidde Léisungen, fir de verschiddenen Ufuerderunge vu spezifesche Gewëss an hire Behandlungen gerecht ze ginn. Fir déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu ville Prouwe bitt Hielscher den UIP400MTP fir Multiwell-Placken, de VialTweeter fir d’Ultraschallbehandlung vu bis zu 10 Prouweréiercher (z. B. Eppendorf-Réiercher) oder den Ultraschall-CupHorn. Ultraschallapparater mat Sond si mat 50 bis 400 Watt als Labo-Homogenisateure verfügbar, wärend industriell Systemer de Leeschtungsberäich vu 500 Watt bis 16kW ofdecken.
Kontaktéiert eis an deelt eis Är Uwendung an Är Prozessufuerderunge mat. Eist erfuert Personal recommandéiert Iech gär dee gëeegentsten Ultraschallapparat fir Äre biologesche Prozess.
Déi folgend Tabell gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallapparater: