Genetesch Transformatioun a Planzenzellen mat Ultraschall

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) ass eng effizient Method fir Planzenzellen mat auslännesche Genen ze infizéieren mat Agrobacterium als Transporter. Ultraschall Kavitatioun verursaacht Sonoporatioun, déi als geziilte Mikroverwonnung vu Planzengewebe beschriwwe ka ginn. Duerch dës Ultraschall erstellt Mikrowonnen, kënnen DNA an DNA Vektoren effizient an d'Zellmatrix transportéiert ginn.

sonoporation – Ultraschall verbessert Zell Transformatioun

Wann Low-Frequenz Ultraschall (ongeféier 20kHz) op Zellsuspensionen applizéiert gëtt, verursaachen d'Effekter vun der akustescher Kavitatioun eng transient Membranpermeabiliséierung op Zellgewebe. Dësen Ultraschalleffekt ass bekannt als Sonoporatioun a gëtt fir Gentransfer an Zellen oder Stoffer benotzt.
D'Virdeeler vun der Ultraschall baséieren op sengem net-thermesche mechanesche Aarbechtsprinzip, wat d'Sonicatioun oft méi versatile a manner ofhängeg vun Zelltypen mécht. Déi versatile Uwendung vu Sonoporatioun mécht d'Méiglechkeet op fir d'Notzung vun transgene Planzen, déi bedeitend Potenzial an der Bioproduktioun vu komplexe mënschlechen therapeutesche Proteinen hunn. Esou Planz-baséiert Bioreaktoren kënnen einfach genetesch manipuléiert ginn, déi potenziell Kontaminatioun mat mënschleche Pathogenen verhënneren, beschiedegen keng Transformatiounsmediéierend Bakterien (zB Agrobacterium), a sinn eng preiswert, efficace Method fir Bio-Synthese.

Ultraschall-Assistéiert Zell Transformatioun

Sonication ass eng Technik déi Low-Frequenz Ultraschallwellen applizéiert fir Partikelen an der Léisung ze agitéieren, Léisungen ze vermëschen, an doduerch den Taux vum Massentransfer an der Opléisung erhéijen. Zur selwechter Zäit kann d'Sonicatioun opgeléist Gase vu Flëssegkeeten ewechhuelen. Bei der Planzetransformatioun wäert d'Sonicatioun d'Bildung vu Mikrowounds op Planzgewebe verursaachen an d'Liwwerung vun plakeg DNA an de Planzeprotoplast verbesseren.

Fir genetesch Transformatioun ass d'Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) déi bevorzugt Method an huet eng wesentlech méi héich Effizienz wéi d'Sonication benotzt fir plakeg DNA an DNA Vektoren direkt an de Protoplast ze transferéieren. Vill Studien hunn bewisen datt d'Sonicatioun assistéiert Agrobacterium-mediéiert Transformatioun (SAAT) ka benotzt ginn fir mechanesch Stéierungen a Bildung vu Wounds op Planzenzellen duerch Ultraschallwellen an déi resultéierend akustesch Kavitatioun ze induzéieren. Eng kuerz Ultraschallbehandlung erstellt Mikro-Wonnen op der Uewerfläch vun Explantater. Wéi déi blesséiert Zellen erlaben d'Penetratioun vun Agrobacterium an de méi déif Deel vu Planzgewebe, sou datt d'Wahrscheinlechkeet datt Planzzellen infizéiert ginn. Zousätzlech verbesseren déi sekretéiert phenolesch Verbindungen d'Transformatioun. Déi ultraschall generéiert Mikrowounds maachen d'Explantatiounspenetratioun vu Bakterien och méi machbar. SAAT gouf erfollegräich fir genetesch Transformatioun a Planzenaarten benotzt, besonnesch als resistent géint Agrobacterium ugesinn.
Eng ganz einfach a preiswert Method ze sinn, souwéi déi bedeitend Verbesserung vum Agrobacterium-mediéierte Gentransfer sinn déi grouss Virdeeler vum SAAT. Nieft der erfollegräicher Uwendung vu SAAT bei der Transformatioun vu Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L., gouf dës Approche och an der Produktioun vu rekombinanten Escherichia coli Wild-Typ Hëtztlabile Holotoxin an Escherichia coli mutant LT Impfungen Adjuvanten an Nicotiana tabacum applizéiert. , an deenen déi héchst systemesch LT-B-spezifesch IgG Titer bei Villercher festgestallt goufen.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Allgemeng Prozedur fir Gentransfer iwwer Sonoporatioun a Planzenzellen

1. Virbereedung vum genetesche Material: Fänkt un mat der Virbereedung vum genetesche Material, deen Dir an d'Planzzellen agefouert wëllt. Dëst kéint Plasmid DNA, RNA oder aner Nukleinsäuren sinn.
2. Planzenzell Isolatioun: Isoléiert d'Planzzellen déi Dir ziele wëllt. Ofhängeg vun Ärem Experiment kënnen dës Zellen aus Planzgewebe oder Kulturen isoléiert ginn.
3. Zell Suspension: Suspendéiert d'Planzzellen an engem passenden Medium oder Puffer. Dëst ass essentiell fir sécherzestellen datt d'Zellen gesond sinn an an engem Zoustand dee fir d'Genopnahm bevorzugt.
4. Setzt Äre Sonicator: Bereet Äre Sonde-Typ Sonicator duerch Sonication Pre-Setting Parameteren wéi Amplituden, Zäit, Energie an Temperatur. Taucht d'Ultraschallsonde an d'Zellsuspension.
5. Sonication: Start der sonication Prozedur. Déi séier Schwéngung vum Sondespëtz generéiert Kavitatiounsblasen an der Flëssegkeet. Dës Blasen erweideren a kollapsen wéinst den Ultraschallwellen, déi mechanesch Kräften a Mikrostreaming an der Suspensioun kreéieren.
6. Sonoporatioun: Déi mechanesch Kräften a Mikrostreaming generéiert duerch Kavitatioun kreéieren temporär Poren a Lächer an de Membranen vun de Planzenzellen. D'genetesch Material, dat an der Suspension präsent ass, kann duerch dës Poren an d'Planzzellen erakommen.
7. Inkubatioun: No der Sonoporatiounsbehandlung, inkubéiert d'Planzzellen fir datt se hir Membranen erholen an stabiliséieren. Dëst ass e wesentleche Schrëtt fir d'Zell Iwwerliewe an den erfollegräichen Gentransfer ze garantéieren.

Gentransfer iwwer Agrobacterium oder Liposomen

Et ginn zwou allgemeng Forme fir Planzenzelle ze transfektéieren. Si benotzen entweder Agrobacterium, eng Gattung vu Gram-negativen Bakterien, oder Liposomen als Träger vum genetesche Material.

• Agrobacterium-mediéiert Sonoporatioun: Agrobacterium tumefaciens ass eng Bakterie déi allgemeng an der Planzgenetik benotzt gëtt. An dëser Method gëtt Plasmid DNA mat dem gewënschten Gen an Agrobacterium agefouert, déi dann mat Planzenzellen gemëscht gëtt. D'Zellsuspension gëtt mat Sonoporatioun mat engem Sonde-Typ Sonicator ënnerworf. D'Ultraschallenergie verbessert den Transfer vum genetesche Material vun Agrobacterium op d'Planzzellen. Dës Method gëtt wäit benotzt fir d'genetesch Modifikatioun vu Planzen.
• Liposom-mediéiert Sonoporatioun: Liposomen si Lipid-baséiert Vesikel déi genetesch Material droen kënnen. An dëser Method gi Liposomen gelueden mat Plasmid DNA oder aner Nukleinsäuren mat Planzenzellen gemëscht. Sonoporatioun mat engem Sonde-Typ Sonicator gëtt benotzt fir d'Aufnahme vu Liposomen duerch Planzenzellen ze erliichteren. Den Ultraschall stéiert d'Lipid-Duebelschichte vun de Liposomen, léisst d'genetesch Material an d'Planzzellen eraus. Dës Approche ass nëtzlech fir transient Genausdrockstudien a Planzenzellen.

Wëssenschaftlech bewisen Virdeeler vun Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) gouf op vill Planzenaarten applizéiert. Eng kuerz a relativ mëll Ultraschallbehandlung vu Planzenzellkulturen verursaacht Sonoporatioun, déi duerno eng déif Penetratioun vun Agrobacterium als Gentransporter erlaabt. Hei drënner kënnt Dir exemplaresch Studien liesen, déi déi positiv Auswierkunge vum SAAT weisen.

Ultraschall-Assistéiert Transformatioun vun Ashwagandha

Fir d'Transformatiounseffizienz an der W. somnifera (bekannt als Ashwagandha oder Wanterkirsch) ze verbesseren, hunn Dehdashti a Kollegen (2016) d'Benotzung vun Acetosyringon (AS) a Sonikatioun ënnersicht.
Acetosyringone (AS) gouf an dräi Etappen bäigefüügt: Agrobacterium Flëssegkultur, Agrobacterium Infektioun a Co-Kultur vun Explantater mat Agrobacterium. D'Zousatz vun 75 μM AS zu Agrobacterium Flëssegket Kultur war optimal fir Aféierungs- vun Vir Genen fonnt.
Déi zousätzlech Uwendung vun der Sonikatioun (SAAT) huet zu héchste Genausdrock gefouert. D'gusA Genausdrock an haare Wuerzelen gouf am beschten fonnt wann d'Blieder an d'Schéissspëtze fir 10 respektiv 20s sonicated goufen. D'Transformatiounseffizienz vum verbesserte Protokoll gouf 66,5 an 59,5% am Fall vun Blat- a Schéissspëtzexplantaten opgeholl, respektiv. Am Verglach mat anere Protokoller gouf d'Transformatiounseffizienz vun dësem verbesserte Protokoll 2,5 Mol méi héich fir Blieder an 3,7 Mol méi fir Schéissspëtze fonnt. Southern blot Analysë bestätegt 1-2 Kopie vun der gusA transgene an de Linnen W1-W4, iwwerdeems 1-4 transgene Exemplare an der Linn W5 vun der verbessert Protokoll generéiert fonnt goufen.

Effet vun der Dauer vun sonication-assistéiert Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) op Transformatioun Frequenz vun W. somnifera Blat (a) a schéissen Tipp (b) explants(Studie a Grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraschall-Assistéiert Transformatioun vu Koteng

Hussain et al. (2007) weisen déi beneficiell Effekter vun der sonication-assistéierter Kottengtransformatioun. Akustesch Kavitatioun verursaacht duerch Low-Frequenz Ultraschall erstellt Mikro-Wonnen op an ënner der Uewerfläch vum Planzegewebe (Sonoporatioun) an erlaabt Agrobacterium méi déif a komplett am ganze Planzgewebe ze reesen. Dës verwonnend Moud erhéicht d'Wahrscheinlechkeet fir Planzenzellen ze infizéieren déi méi déif am Tissu leien. Fir d'Transformatiounseffizienz vun SAAT ze evaluéieren, gouf GUS Gentherapie Ausdrock gemooss. De GUS Reporter System ass e Reporter Gen System, besonnesch nëtzlech an der Planzmolekulare Biologie a Mikrobiologie. Verschidde SAAT Parameteren upassen, GUS transient Ausdrock a Koteng mat reife Embryonen als Explantatioun war wesentlech verbessert. GUS gouf fir d'éischt 24h no der Inkubatioun vun den Explantater festgestallt an duerch 48h, GUS Ausdrock war ganz intensiv, wat als nëtzlechen Indikator vun der erfollegräicher Transformatioun vun der Kottengexplantatioun no sonication assistéiert Agrobacterium mediated Transformation (SAAT) gedéngt huet. De Verglach vu verschiddenen Transformatiounstechniken (nämlech biolistesch, Agro, BAAT, SAAT), sonication-assistéiert Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) huet bei wäitem déi bescht Resultater vun der Transformatioun gewisen.

Wiel vun der Transformatiounsprozedur op der Basis vum transienten Ausdrock vu GUS. Sonication-assistéiert Agrobacterium-mediéiert Transformatioun (SAAT) weist e wesentlech méi héije transienten Ausdrock.(Studie a Grafik: © Hussain et al., 2007)

High-Performance Ultrasonic Léisunge fir Sonoporatioun a SAAT

Hielscher Ultrasonics ass laang Zäit erlieft an der Entwécklung an der Fabrikatioun vun High-Performance Ultrasonicatoren fir Laboratoiren, Fuerschungsanlagen wéi och industriell Produktioun mat ganz héijen Duerchgäng. Fir Mikrobiologie a Liewenswëssenschaft, Hielscher bitt verschidde Léisunge fir verschidden Ufuerderungen unzepassen, déi néideg sinn fir spezifesch Gewëss an hir Behandlungen. Fir d'simultan Ultraschall vu ville Proben Hielscher bitt den UIP400MTP fir Multiwell Placken, de VialTweeter fir d'Sonication vu bis zu 10 Fläschen (zB Eppendorf Tube) oder den Ultraschall CupHorn. Probe-Typ Ultraschaller si vu 50 bis 400 Watt als Labo Homogenisatoren verfügbar, während industriell Systemer d'Kraaftberäich vu 500 Watt bis 16kW decken.
Kontaktéiert eis w.e.g. a loosst eis iwwer Är Uwendung a Prozessfuerderunge wëssen. Eis gutt erfuerene Mataarbechter wäerte frou sinn de gëeegentste Ultraschall fir Äre biologesche Prozess ze recommandéieren.
D'Tabell hei drënner gëtt Iech eng Indikatioun vun der geschätzter Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschaller: