პროტოკოლი Hielscher Multi-Sample Sonicators-ის გამოყენებით ბიოფილმსა და პროტეომიურ ანალიზში
მრავალნიმუშიანი სონიკატორების გამოყენება, როგორიცაა VialTweeter Multi-Tube Sonicator და UIP400MTP Microplate Sonicator, აუმჯობესებს ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესებს მაღალი გამტარუნარიანობის აპლიკაციებისთვის. ორივე მოწყობილობა საშუალებას იძლევა ზუსტი და ერთგვაროვანი ულტრაბგერითი დამუშავება მრავალ ნიმუშზე, მინიმუმამდე დაიყვანოს ცვალებადობა და გაზარდოს რეპროდუქციულობა. ეს განსაკუთრებით ხელსაყრელია ექსპერიმენტებში, რომლებიც საჭიროებენ სინჯის თანმიმდევრულ ლიზას, ბიოფილმის გამოყოფას, ცილის ექსტრაქციას ან პროტეოლიზურ მონელებას, სადაც ხელით ან ერთჯერადი ნიმუშის მეთოდები ნაკლებად ეფექტურია და მიდრეკილია შეუსაბამობისკენ.
გაამარტივეთ სამუშაო ნაკადები მრავალ ნიმუშის სონიკატორებით
UIP400MTP, მაგალითად, საშუალებას აძლევს მიკროპლატის ჭაბურღილების ერთდროულ ულტრაბგერით დამუშავებას, რაც უზრუნველყოფს ბიოფილმების ან ფიჭური მასალის ერთგვაროვან გამოყოფას. იმავდროულად, VialTweeter გთავაზობთ მილის მრავალი ნიმუშის ზუსტ ლიზას და ჰომოგენიზაციას ჯვარედინი დაბინძურების გარეშე. ეს sonicators მნიშვნელოვნად ამცირებს დამუშავების დროს, აუმჯობესებს ექსპერიმენტულ გამეორებას და ინარჩუნებს ნიმუშის მაღალ მთლიანობას, რაც მათ შეუცვლელ ინსტრუმენტად აქცევს მიკრობიოლოგიაში, პროტეომიკასა და მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევაში.
ქვემოთ მოცემულია დეტალური პროტოკოლი, რომელიც ასახავს Hielscher-ის მრავალნიმუშიანი სონიკატორის მოდელების, VialTweeter Multi-Tube Sonicator და Microplate Sonicator UIP400MTP გამოყენებას, კვლევაში, რომელიც მოიცავს E. coli-ს ბიოფილმის ფორმირებას და შემდგომ პროტეომიურ ანალიზს.
მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP – საიმედო ნიმუშის მომზადება მაღალი გამტარუნარიანობით
პროტოკოლი: ბიოფილმის ფორმირება, განცალკევება და პროტეომიული ანალიზი Hielscher Multi-Sample Sonicators გამოყენებით
1. ბაქტერიული კულტურის მომზადება
- E. coli ბაქტერიების (შტამი W3110) კულტურა 30°C-ზე, ტემპერატურა ხელსაყრელია E. coli ბიოფილმის ფორმირებისთვის, ტრიპტონის ბულიონში (TB), რომელიც შეიცავს:
– 10 გ/ლ ტრიპტონი
– 5 გ/ლ NaCl - პლაზმიდის შეკავების უზრუნველსაყოფად საჭიროებისამებრ დამატეთ ანტიბიოტიკები.
- მიკროსკოპისა და პრომოტორული აქტივობის კვლევებისთვის გამოიყენეთ W3110 E. coli შტამი გენომიური გაძლიერებული GFP (eGFP) მომხსენებელთან ერთად rplL პრომოტორის კონტროლის ქვეშ.
- გამოიყენეთ GFP მომხსენებელი პლაზმიდები სხვადასხვა პრომოტორებისთვის (მაგ. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) პრომოუტერული საქმიანობის გასაზომად.
2. ბიოფილმის კულტივაცია და გამოყოფა
- დათესეთ 1,5 მლ განზავებული ბაქტერიული კულტურა თითო ჭაბურღილში 12 ჭაბურღილიან თეფშზე (CellStar 12 ჭაბურღილის ფირფიტები, Greiner Bio-One).
- ინკუბაცია, რათა მოხდეს ბიოფილმის ფორმირება.
- ფრთხილად ამოიღეთ პლანქტონური (არაადჰეზიური) კულტურა.
– გარეცხეთ თითოეული კარგად 500 μL PBS.
– გამოყავით მიმაგრებული უჯრედები UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორში 12 ჭაბურღილის ფირფიტის გახმოვანებით. UIP400MTP უზრუნველყოფს ერთგვაროვან განცალკევებას ყველა ჭაბურღილზე თანმიმდევრული ულტრაბგერითი ენერგიის მიწოდებით.
– გახმოვანების პარამეტრები: 60% ამპლიტუდა, ციკლის რეჟიმი: 60 წმ ჩართვა / 30 წმ გამორთვა.
3. უჯრედების აღება და ლიზისი
- მოცილებული ბიოფილმის უჯრედების ცენტრიფუგა 4500 გ-ზე 5 წუთის განმავლობაში.
- გარეცხეთ დაფქული უჯრედები PBS-ით.
- ხელახლა შეაჩერეთ უჯრედები 100 μL 2% ნატრიუმის ლაუროილ სარკოსინატში (SLS) და ინკუბაცია 95°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში.
- Sonicate გამოყენებით VialTweeter Multi-Tube Sonicator, რათა უზრუნველყოს უჯრედების სრული ლიზისი.
– Sonication პარამეტრები: 100% ამპლიტუდა, 50 s ON / 10 s OFF 10 წთ მთლიანი მუშაობის დრო; შეინახეთ ნიმუშები ყინულზე.
4. რედუქცია და ალკილაცია
- დაამატეთ 5 მმ ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინი (TCEP) დისულფიდური ბმების შესამცირებლად და ინკუბაცია 95°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში.
- ცილების ალკილატი 10 მმ იოდოაცეტამიდით 30 წუთის განმავლობაში 25°C-ზე.
5. ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრა და მონელება
- ცენტრიფუგა ლიზატები ნარჩენების გასასუფთავებლად.
- რაოდენობრივად განსაზღვრეთ მთლიანი ცილის შემცველობა Pierce BCA პროტეინის ანალიზის ნაკრების გამოყენებით.
- 50 მკგ მთლიანი პროტეინის დაშლა 1 მკგ ტრიპსინთან ერთად ხსნარში, რომელიც შეიცავს 2% SLS და 100 მმ ამონიუმის ბიკარბონატს.
- მონელების რეაქციის ინკუბაცია ღამით 30°C-ზე.
6. პეპტიდური გამწმენდი
- SLS-ის დალექვა 1,5% ტრიფტორძმარმჟავას (TFA) დამატებით, შემდეგ ცენტრიფუგა.
- გაწმინდეთ პეპტიდები C18 მიკროსპინის სვეტების გამოყენებით.
- გააშრეთ გასუფთავებული პეპტიდები და ხელახლა შეაჩერეთ 0.1% TFA-ში.
7. თხევადი ქრომატოგრაფია-მასპექტრომეტრია (LC-MS/MS)
- გაანალიზეთ პეპტიდები Q-Exactive Plus მასის სპექტრომეტრზე Ultimate 3000 RSLC ნანო სისტემასთან ერთად.
- გამოყავით პეპტიდები საპირისპირო ფაზის HPLC სვეტის გამოყენებით (75 მკმ × 42 სმ), შეფუთული C18 ფისით (2,4 მკმ).
- წაისვით გრადიენტი 2%-დან 35%-მდე გამხსნელი B (აცეტონიტრილი 0.15% ჭიანჭველა მჟავით) 140 წუთის განმავლობაში.
- მიიღეთ მონაცემები მაღალი რეზოლუციის MS სკანირების გამოყენებით, რასაც მოჰყვება 10 ყველაზე ინტენსიური იონის ტანდემი MS/MS სკანირება.
8. მონაცემთა ანალიზი
- დაამუშავეთ ნედლეული LC-MS მონაცემები Progenesis პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
- .mgf ფაილების ექსპორტი და ანალიზი MASCOT-ით.
- შეასრულეთ პეპტიდების რაოდენობრივი განსაზღვრა SafeQuant-ის გამოყენებით ხარისხის კონტროლისა და ყალბი აღმოჩენის კორექტირებისთვის.
- ჩაატარეთ ყველა ექსპერიმენტი დუბლიკატად ან სამჯერ, რათა უზრუნველყოთ განმეორებადობა.
მრავალნიმუშიანი სონიკატორები მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებისთვის
მრავალნიმუშიანი სონიკატორის მოდელები VialTweeter და UIP400MTP მნიშვნელოვნად აძლიერებს ექსპერიმენტული სამუშაოების სიზუსტეს და ეფექტურობას, განსაკუთრებით ბიოფილმის კვლევასა და პროტეომიკაში. მრავალი ნიმუშის ერთგვაროვნად დამუშავების მათი უნარი უზრუნველყოფს მაღალი გამტარუნარიანობას მონაცემთა ხარისხის კომპრომისის გარეშე. ეს უპირატესობები, ზემოთ ჩამოთვლილ გამარტივებულ სამუშაო პროცესებთან ერთად, აქცევს Hielscher მრავალ ნიმუშის სონიკატორებს აუცილებელ ინსტრუმენტად თანამედროვე ბიოლოგიური კვლევისთვის.
- მაღალი ეფექტურობის
- უახლესი ტექნოლოგია
- საიმედოობა & სიმტკიცე
- რეგულირებადი, ზუსტი პროცესის კონტროლი
- პარტია & ხაზში
- ნებისმიერი მოცულობისთვის
- ინტელექტუალური პროგრამული უზრუნველყოფა
- ჭკვიანი ფუნქციები (მაგ., პროგრამირებადი, მონაცემთა პროტოკოლირება, დისტანციური მართვა)
- მარტივი და უსაფრთხო ფუნქციონირება
- დაბალი მოვლა
- CIP (სუფთა ადგილზე)
დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითებს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
ლიტერატურა / ლიტერატურა / ფაქტები
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
ხშირად დასმული შეკითხვები
რა არის ბიოფილმი?
ბიოფილმი არის მიკროორგანიზმების სტრუქტურირებული ერთობლიობა, რომელიც ჩაშენებულია თვითწარმოებულ უჯრედგარე მატრიქსში (ECM), რომელიც ეკვრის ზედაპირებს. ის უზრუნველყოფს დაცვას გარემოსდაცვითი სტრესებისგან, ანტიბიოტიკებისგან და იმუნური სისტემისგან, რაც ხელს უწყობს მდგრად ინფექციებს და ბიოგაფუჭებას.
რა არის Biofilm Detachment?
ბიოფილმის გამოყოფა არის პროცესი, რომლითაც მიკრობული უჯრედები ან კლასტერები გამოყოფენ ბიოფილმის სტრუქტურისგან, ან აქტიურად (ფერმენტული დეგრადაციის ან კვორუმის ზონდირების გზით) ან პასიურად (გამჭრელ ძალების, საკვები ნივთიერებების გამოფიტვის ან მექანიკური დარღვევის გამო). ეს ხელს უწყობს ბიოფილმის გაფანტვას და ახალი ზედაპირების კოლონიზაციას.
რა არის ბიოფილმთან ასოცირებული ცილები?
ბიოფილმთან ასოცირებული პროტეინები (BAPs) არის მიკრობული ზედაპირული ან გამოყოფილი ცილები, რომლებიც მთავარ როლს ასრულებენ ბიოფილმის ფორმირებაში, სტაბილურობასა და ადჰეზიაში. ეს მოიცავს ადჰეზინებს, უჯრედგარე ფერმენტებს და სტრუქტურულ ცილებს, როგორიცაა curli ბოჭკოები E. coli-ში ან BapA Staphylococcus aureus-ში.
რა არის ECM ბიოფილმებში?
უჯრედგარე მატრიცა (ECM) ბიოფილმებში არის პოლისაქარიდების, ცილების, უჯრედგარე დნმ (eDNA) და ლიპიდების კომპლექსური ქსელი, რომელიც მოიცავს მიკრობულ უჯრედებს. ის უზრუნველყოფს სტრუქტურულ მთლიანობას, ახდენს ადჰეზიას, ინარჩუნებს ტენიანობას და აძლიერებს ბიოფილმის წინააღმდეგობას ანტიმიკრობული ნივთიერებებისა და მასპინძლის დამცავი საშუალებების მიმართ.
რა ფუნქცია ასრულებს Curli Fibers-ს?
Curli ბოჭკოები არის უჯრედგარე ამილოიდური ფიბრილები, რომლებიც წარმოიქმნება Escherichia coli-ს და მასთან დაკავშირებული ბაქტერიების მიერ, რომლებიც გადამწყვეტ როლს თამაშობენ ბიოფილმის ფორმირებაში, ზედაპირის ადჰეზიასა და მასპინძლის კოლონიზაციაში. ისინი ხელს უწყობენ ბიოფილმის მთლიანობას, აძლიერებენ წინააღმდეგობას გარემოს სტრესის მიმართ და ხელს უწყობენ მასპინძელ ქსოვილებთან ურთიერთქმედებას ინფექციის დროს. გარდა ამისა, curli ბოჭკოები მონაწილეობენ იმუნური სისტემის აქტივაციის ხელშეწყობაში და მონაწილეობენ ბაქტერიების მდგრადობასა და პათოგენურობაში.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია რომ სამრეწველო ზომა.