პროტოკოლი Hielscher-ის მრავალნიმუშიანი სონიკატორების გამოყენებით ბიოფილმისა და პროტეომიკის ანალიზში

მრავალნიმუშიანი სონიკატორების გამოყენება, როგორიცაა VialTweeter Multi-Tube Sonicator და UIP400MTP Microplate Sonicator, ამარტივებს ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესებს მაღალი წარმადობის ამოცანებისთვის. ორივე მოწყობილობა უზრუნველყოფს მრავალი ნიმუშის ზუსტ და ერთგვაროვან ულტრაბგერით დამუშავებას, ამცირებს ცვალებადობას და ზრდის შედეგების განმეორებადობას. ეს განსაკუთრებით ხელსაყრელია ექსპერიმენტებში, რომლებიც მოითხოვს ნიმუშების თანაბარ ლიზისს, ბიოფილმის მოცილებას, ცილების ექსტრაქციას ან პროტეოლიზურ დაშლას და რომლებშიც ხელით ან თითოეული ნიმუშის ცალ-ცალკე დამუშავება ნაკლებად ეფექტურია და არათანმიმდევრული შედეგების მიღების რისკს ზრდის.

გაამარტივეთ სამუშაო ნაკადები მრავალნიმუშიანი სონიკატორებით

მაგალითად, UIP400MTP უზრუნველყოფს მიკროფირფიტის ფოსოების ერთდროულ ულტრაბგერით დამუშავებას, რაც ბიოფილმების ან უჯრედული მასალის ერთგვაროვან მოცილებას განაპირობებს. VialTweeter კი უზრუნველყოფს რამდენიმე სინჯარაში მოთავსებული ნიმუშების ზუსტ ლიზისსა და ჰომოგენიზაციას ჯვარედინი დაბინძურების გარეშე. ეს სონიკატორები მნიშვნელოვნად ამცირებს დამუშავების დროს, აუმჯობესებს ექსპერიმენტების განმეორებადობას და ინარჩუნებს ნიმუშების მთლიანობის მაღალ ხარისხს, რაც მათ შეუცვლელ ინსტრუმენტებად აქცევს მიკრობიოლოგიურ, პროტეომიკულ და მოლეკულურ-ბიოლოგიურ კვლევებში.
ქვემოთ მოცემულია დეტალური პროტოკოლი, რომელიც ასახავს Hielscher-ის მრავალნიმუშიანი სონიკატორის მოდელების, VialTweeter Multi-Tube Sonicator და Microplate Sonicator UIP400MTP გამოყენებას, კვლევაში, რომელიც მოიცავს E. coli-ს ბიოფილმის ფორმირებას და შემდგომ პროტეომიკულ ანალიზს.

პროტოკოლი: ბიოფილმის ფორმირება, მოცილება და პროტეომიკული ანალიზი Hielscher-ის მრავალნიმუშიანი სონიკატორების გამოყენებით

1. ბაქტერიული კულტურის მომზადება

• მოაშენეთ E. coli-ს ბაქტერიები (შტამი W3110) 30°C-ზე, რაც ხელსაყრელი ტემპერატურაა E. coli-ს ბიოფილმის ფორმირებისთვის, ტრიპტონის ბულიონის (TB) საკვებ არეში, რომელიც შეიცავს:
  – 10 გ/ლ ტრიპტონი
  – 5 გ/ლ NaCl
• პლაზმიდის შენარჩუნების უზრუნველსაყოფად საჭიროებისამებრ დაამატეთ ანტიბიოტიკები.
• მიკროსკოპიული კვლევებისა და პრომოტორის აქტივობის შესასწავლად გამოიყენეთ E. coli-ს W3110 შტამი, რომლის გენომშიც ჩართულია rplL პრომოტორის კონტროლქვეშ მყოფი გაძლიერებული GFP-ის (eGFP) რეპორტერი.
• გამოიყენეთ სხვადასხვა პრომოტორის GFP რეპორტერული პლაზმიდები (მაგ., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) პრომოტორების აქტივობის გასაზომად.

2. ბიოფილმის კულტივაცია და გამოყოფა

• 12-ფოსოიანი ფირფიტის თითოეულ ფოსოში დათესეთ 1,5 mL განზავებული ბაქტერიული კულტურა (CellStar 12-ფოსოიანი ფირფიტები, Greiner Bio-One).
• ინკუბაცია, რათა მოხდეს ბიოფილმის ფორმირება.
• ფრთხილად ამოიღეთ პლანქტონური (არაადჰეზიური) კულტურა.

– გარეცხეთ თითოეული ფოსო 500 µL PBS-ით.
– მოაცილეთ მიმაგრებული უჯრედები 12-ფოსოიანი ფირფიტის ულტრაბგერითი დამუშავებით UIP400MTP მიკროფირფიტების სონიკატორში. UIP400MTP უზრუნველყოფს ერთგვაროვან მოცილებას ყველა ფოსოში თანაბარი ულტრაბგერითი ენერგიის მიწოდებით.
– ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრები: 60% ამპლიტუდა, ციკლის რეჟიმი: 60 წმ ჩართვა / 30 წმ გამორთვა.

3. უჯრედების აღება და ლიზისი

• დააცენტრიფუგირეთ მოცილებული ბიოფილმის უჯრედები 4500 გ-ზე 5 წუთის განმავლობაში.
• გარეცხეთ დალექილი უჯრედები PBS-ით.
• უჯრედები ხელახლა გადაიყვანეთ სუსპენზიაში 100 µL 2% ნატრიუმის ლაუროილსარკოზინატის (SLS) ხსნარში და ჩაატარეთ ინკუბაცია 95°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში.
• უჯრედების სრული ლიზისის უზრუნველსაყოფად ჩაატარეთ ულტრაბგერითი დამუშავება VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ის გამოყენებით.
  – ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრები: 100% ამპლიტუდა, 50 წმ ჩართვა / 10 წმ გამორთვა, მუშაობის საერთო ხანგრძლივობა 10 წთ; ნიმუშები ყინულზე შეინახეთ.

4. რედუქცია და ალკილაცია

• დისულფიდური ბმების აღსადგენად დაამატეთ 5 mM ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინი (TCEP) და ჩაატარეთ ინკუბაცია 95°C-ზე 15 წუთის განმავლობაში.
• ჩაატარეთ ცილების ალკილირება 10 mM იოდოაცეტამიდით 30 წუთის განმავლობაში 25°C-ზე.

5. ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრა და მონელება

• უჯრედული ნარჩენების მოსაცილებლად დააცენტრიფუგირეთ ლიზატები.
• რაოდენობრივად განსაზღვრეთ მთლიანი ცილის შემცველობა Pierce BCA პროტეინის ანალიზის ნაკრების გამოყენებით.
• დაშალეთ 50 µg საერთო ცილა 1 µg ტრიპსინით ხსნარში, რომელიც შეიცავს 2% SLS-სა და 100 mM ამონიუმის ბიკარბონატს.
• მონელების რეაქციის ინკუბაცია ღამით 30°C-ზე.

6. პეპტიდების გაწმენდა

• SLS-ის დალექვა 1,5% ტრიფტორძმარმჟავას (TFA) დამატებით, შემდეგ ცენტრიფუგა.
• გაწმინდეთ პეპტიდები C18 მიკროსპინის სვეტების გამოყენებით.
• გააშრეთ გასუფთავებული პეპტიდები და ხელახლა გადაიყვანეთ სუსპენზიაში 0,1% TFA-ში.

7. თხევადი ქრომატოგრაფია-მასსპექტრომეტრია (LC-MS/MS)

• გაანალიზეთ პეპტიდები Q-Exactive Plus მასის სპექტრომეტრზე Ultimate 3000 RSLC ნანო სისტემასთან ერთად.
• გამოყავით პეპტიდები შებრუნებული ფაზის HPLC სვეტით (75 µm × 42 cm), რომელიც შევსებულია C18 ფისით (2,4 µm).
• 140 წუთის განმავლობაში გამოიყენეთ B გამხსნელის კონცენტრაციის გრადიენტი 2%-დან 35%-მდე (აცეტონიტრილი 0,15% ჭიანჭველმჟავასთან ერთად).
• მიიღეთ მონაცემები მაღალი რეზოლუციის MS სკანირების გამოყენებით, რასაც მოჰყვება 10 ყველაზე ინტენსიური იონის ტანდემი MS/MS სკანირება.

8. მონაცემთა ანალიზი

• დაამუშავეთ ნედლეული LC-MS მონაცემები Progenesis პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
• .mgf ფაილების ექსპორტი და ანალიზი MASCOT-ით.
• შეასრულეთ პეპტიდების რაოდენობრივი განსაზღვრა SafeQuant-ის გამოყენებით ხარისხის კონტროლისა და ცრუ აღმოჩენების კორექტირებისთვის.
• ჩაატარეთ ყველა ექსპერიმენტი დუბლიკატად ან სამჯერ, რათა უზრუნველყოთ განმეორებადობა.

მრავალნიმუშიანი სონიკატორები მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებისთვის

მრავალნიმუშიანი სონიკატორის მოდელები VialTweeter და UIP400MTP მნიშვნელოვნად აძლიერებს ექსპერიმენტული სამუშაოების სიზუსტეს და ეფექტურობას, განსაკუთრებით ბიოფილმის კვლევასა და პროტეომიკაში. მრავალი ნიმუშის ერთგვაროვნად დამუშავების მათი უნარი უზრუნველყოფს მაღალ გამტარუნარიანობას მონაცემთა ხარისხის კომპრომისის გარეშე. ეს უპირატესობები, ზემოთ ჩამოთვლილ გამარტივებულ სამუშაო პროცესებთან ერთად, აქცევს Hielscher-ის მრავალნიმუშიან სონიკატორებს აუცილებელ ინსტრუმენტად თანამედროვე ბიოლოგიური კვლევისთვის.

დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში

Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები ცნობილია ხარისხისა და კონსტრუქციის უმაღლესი სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი ექსპლუატაცია უზრუნველყოფს ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების შეუფერხებელ ინტეგრაციას სამრეწველო ობიექტებში. Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები ადვილად უმკლავდება მძიმე სამუშაო პირობებსა და რთულ გარემოს.

Hielscher Ultrasonics არის ISO-ს სერტიფიცირების მქონე კომპანია, რომელიც განსაკუთრებულ ყურადღებას უთმობს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით აპარატებს, უახლესი ტექნოლოგიებითა და გამოყენების სიმარტივით. რა თქმა უნდა, Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები შეესაბამება CE-ს და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs-ის მოთხოვნებს.