პარაფინის მოცილება და ცილების ექსტრაქცია FFPE-დან

გაამარტივეთ ცილების ექსტრაქცია ფორმალინით ფიქსირებული და პარაფინში ჩაყალიბებული (FFPE) ქსოვილის ანათლებიდან პარაფინის მოცილების, ხსნად მდგომარეობაში გადაყვანისა და VialTweeter მრავალსინჯარიანი ულტრაბგერითი აპარატით დამუშავების ოპტიმიზებული კომბინაციის გამოყენებით. ეს პროტოკოლი ხელს უწყობს შემდგომ მას-სპექტრომეტრიაზე დაფუძნებულ პროტეომულ ანალიზს და თავსებადია SP3 გასუფთავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზის სამუშაო პროცესებთან.

ეს SOP განკუთვნილია ლაბორატორიული პერსონალისთვის, რომელიც FFPE ქსოვილის ნიმუშების პროტეომულ ანალიზში მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით დამუშავებას იყენებს. ის ოპტიმიზებულია მაქსიმუმ ათი FFPE ნიმუშის პარალელურად დასამუშავებლად VialTweeter მრავალსინჯარიანი ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით.

პროტოკოლი: ცილების ექსტრაქცია FFPE ნიმუშებიდან VialTweeter-ის გამოყენებით

მასალები და რეაგენტები

რეაგენტები

• ქსილოლი (ჰისტოლოგიური ხარისხის)
• ეთანოლი (აბსოლუტური 96%)
• ლიზის ბუფერი:

6 M გუანიდინის ჰიდროქლორიდი
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• პროტეაზის ინჰიბიტორი (სურვილისამებრ; მაგ., cOmplete™ mini EDTA-free)

აპარატურა

• VialTweeter მრავალსინჯარიანი ულტრაბგერითი აპარატი
• 1,5 mL ან 2,0 mL მიკროცენტრიფუგის სინჯარები ცილების შეკავშირების დაბალი უნარით
• სითბური ბლოკი ან ინკუბატორი (95°C და 80°C პარამეტრები)
• მიკროცენტრიფუგა
• თერმომიქსერი (სურვილისამებრ, მაგრამ რეკომენდებული)

ნიმუშის შეყვანა

• 10 µm სისქის FFPE ქსოვილის 1–2 ანათალი თითო ნიმუშზე (ანუ, თითო სინჯარაზე)

ან

• სულ ~100 µg ქსოვილი თითო ნიმუშზე (ანუ, თითო სინჯარაზე)

შენიშვნა: გამოიყენეთ ახალი დანები მიკროტომიისთვის პარაფინის ნაშთების კონტამინაციის მინიმიზაციისთვის.

პროცედურა

1. პარაფინის მოცილება
   1. გადაიტანეთ FFPE ანათლები მიკროცენტრიფუგის სინჯარებში ცილების შეკავშირების დაბალი უნარით.
   2. დაამატეთ 1 mL ქსილოლი, მოკლედ აურიეთ ვორტექსით.
   3. ინკუბირეთ 10 წუთი ოთახის ტემპერატურაზე.
   4. ცენტრიფუგირეთ 14 000 × g-ზე 2 წუთის განმავლობაში; გადაასხით ზედა ფენა.
   5. გაიმეორეთ ქსილოლით რეცხვა კიდევ ერთხელ (ნაბიჯები 2–4).
   6. გამოირეცხეთ ნალექი 1 mL 96% ეთანოლით, აურიეთ ვორტექსით, შემდეგ ცენტრიფუგირეთ 14 000 × g-ზე 2 წუთის განმავლობაში. გადაასხით ზედა ფენა.
   7. გაიმეორეთ ეთანოლით რეცხვა კიდევ ერთხელ (სულ 2 ეთანოლით რეცხვა).
   8. გააშრეთ ნალექი ჰაერზე 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე ღია თავსახურებით, რათა აორთქლდეს დარჩენილი ეთანოლი.
2. ცილების ექსტრაქცია და ულტრაბგერითი დამუშავება
   1. დაამატეთ 200 µL ლიზის ბუფერი თითოეულ მშრალ ნალექში.

      შენიშვნა: მიუხედავად იმისა, რომ ულტრაბგერითი დამუშავებელი იტევს მაქსიმუმ 1 mL-ს, 200 µL ოპტიმალურია შემდგომი დამუშავებისთვის.

   2. აურიეთ ვორტექსით ან ნაზი პიპეტირებით.
3. პირველი თერმული ინკუბაცია
   1. ინკუბირეთ სინჯარები 95 °C-ზე 30 min განმავლობაში, 400 rpm სიჩქარით შერევით, თერმომიქსერის ან სითბური ბლოკის გამოყენებით.
   2. დატოვეთ ნიმუშები გასაგრილებლად ოთახის ტემპერატურაზე 5 წთ.
4. პირველი ულტრაბგერითი დამუშავება VialTweeter-ით
   1. მოათავსეთ სინჯარები VialTweeter-ში.
   2. დააყენეთ VialTweeter UP200St ქვემოთ მოცემულ მნიშვნელობებზე და ჩაატარეთ ულტრაბგერითი დამუშავება.
ულტრაბგერითი დამუშავებლის პარამეტრები
• დააყენეთ ამპლიტუდა (A) 100%-ზე
• დააყენეთ პულსაციის რეჟიმი (C) 100%-ზე
• პერიოდული ტაიმერი: ჩართულია
• ჩართვის დრო: 60s
• გამორთვის დრო: 30s
• ზღვრული მნიშვნელობა: 15 წთ (შესაბამისობაშია 10 ციკლთან)
(გამოთვლის შენიშვნა: (60 s ჩართვა + 30 s გამორთვა) × 10 ციკლი = 900 s = 15 წთ)
5. მეორე თერმული ინკუბაცია
   ამოიღეთ სინჯარები და კვლავ ინკუბირეთ 95 °C-ზე 15 min განმავლობაში, 400 rpm სიჩქარით შერევით.
6. მეორე ულტრაბგერითი დამუშავება
   გაიმეორეთ ულტრაბგერითი დამუშავება VialTweeter-ზე იგივე პარამეტრებით (ზემოთ მითითებული) დამატებით 10 ციკლისთვის (სულ 15 წთ).
7. ლიზატის გასუფთავება
   1. ცენტრიფუგირეთ ნიმუშები 13 000 × g-ზე 10 წთ 23°C-ზე (ოთახის ტემპერატურა).
   2. ფრთხილად გადაიტანეთ სუპერნატანტი ახალ 2,0 mL Safe-lock Eppendorf სინჯარაში. მოერიდეთ ნალექის ამღვრევას.
8. შემდგომი დამუშავება
   ლიზატი ახლა მზადაა SP3 გასუფთავებისა და ფერმენტული ჰიდროლიზისთვის.

შენიშვნები და საუკეთესო პრაქტიკა

1. გადახურების რისკი ულტრაბგერითი დამუშავების დროს შემცირებულია პროგრამირებული ჩართვა/გამორთვის ციკლირების გამოყენებით.
2. თავი აარიდეთ ვორტექსირებას ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ცილების აგრეგაციის თავიდან ასაცილებლად.

ნარჩენების გადაყრა და უსაფრთხოება

ქვემოთ მოცემული ცხრილი გაძლევთ წარმოდგენას ჩვენი ლაბორატორიული ზომის ულტრაბგერითი დამუშავებლების მიახლოებითი დამუშავების შესაძლებლობების შესახებ: