დეპარაფინიზაცია და ცილის ექსტრაქცია FFPE-დან

ხელი შეუწყოს ცილის ექსტრაქციას ფორმალინში ფიქსირებული პარაფინით ჩაშენებული (FFPE) ქსოვილის სექციებიდან დეპარაფინიზაციის, ხსნადიზაციისა და სონიკაციის ოპტიმიზებული კომბინაციის გამოყენებით VialTweeter მრავალ მილის ულტრაბგერითი აპარატით. ეს პროტოკოლი მხარს უჭერს მასის სპექტრომეტრიაზე დაფუძნებულ პროტეომიკას და თავსებადია SP3 გაწმენდისა და ფერმენტული მონელების სამუშაო პროცესებთან.

ეს SOP განკუთვნილია ლაბორატორიული პერსონალისთვის, რომელიც ჩართულია FFPE ქსოვილის ნიმუშების პროტეომიურ ანალიზში მაღალი ხარისხის სონიკაციის გამოყენებით. ის ოპტიმიზებულია ათამდე FFPE ნიმუშისთვის, რომლებიც დამუშავებულია პარალელურად VialTweeter Multi-Tube Sonicator-ის გამოყენებით.

პროტოკოლი: ცილის მოპოვება FFPE ნიმუშებიდან VialTweeter-ის გამოყენებით

მასალები და რეაგენტები

რეაგენტები

• ქსილენი (ჰისტოლოგიური ხარისხი)
• ეთანოლი (აბსოლუტური 96%)
• ლიზის ბუფერი:

6 მ გუანიდინის ჰიდროქლორიდი
50 მმ ტრის-HCl, pH 8,5
10 მმ TCEP (ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინი)
40 მმ CAA (2-ქლოროაცეტამიდი)

• პროტეაზას ინჰიბიტორი (სურვილისამებრ; მაგ., cOmplete™ მინი EDTA-ის გარეშე)

აღჭურვილობა

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1,5 მლ ან 2,0 მლ დაბალი შეკვრის მიკროცენტრიფუგის მილები
• თბობლოკი ან ინკუბატორი (95°C და 80°C პარამეტრები)
• მიკროცენტრიფუგა
• თერმომიქსერი (სურვილისამებრ, მაგრამ რეკომენდებულია)

შეყვანის ნიმუში

• 10 მკმ სისქის FFPE ქსოვილის 1–2 სექცია თითო ნიმუშზე (ანუ თითო ფლაკონზე)

ან

• მთლიანი ~100 მკგ ქსოვილი თითო ნიმუშზე (ანუ თითო ფლაკონზე)

შენიშვნა: გამოიყენეთ ახალი პირები მიკროტომიისთვის, რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ პარაფინის ნამსხვრევები დაბინძურება.

Პროცედურა

1. დეპარაფინიზაცია
   1. გადაიტანეთ FFPE სექციები დაბალი შებოჭვის მიკროცენტრიფუგის მილებში.
   2. დაამატეთ 1 მლ ქსილენი, მორევით მოკლედ.
   3. ინკუბაცია 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.
   4. ცენტრიფუგა 14000 × გ 2 წუთის განმავლობაში; გადაყარეთ სუპერნატანი.
   5. გაიმეორეთ ქსილენის რეცხვა კიდევ ერთხელ (საფეხურები 2–4).
   6. გარეცხეთ მარცვლები 1 მლ 96% ეთანოლით, მორევით, შემდეგ ცენტრიფუგა 14000 × გ 2 წუთის განმავლობაში. გადაყარეთ სუპერნატანი.
   7. გაიმეორეთ ეთანოლით რეცხვა კიდევ ერთხელ (სულ 2 ეთანოლის რეცხვა).
   8. გააშრეთ მარცვლები ჰაერში 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე ღია ხუფებით ნარჩენი ეთანოლის აორთქლების მიზნით.
2. პროტეინის ექსტრაქცია და გაჟონვა
   1. თითოეულ მშრალ მარცვლს დაამატეთ 200 μL ლიზის ბუფერი.
      შენიშვნა: მიუხედავად იმისა, რომ სონიკატორი იტევს 1 მლ-მდე, 200 μL ოპტიმალურია ქვედა დინებაში დამუშავებისთვის.

   2. შეურიეთ მორევით ან ნაზი პიპეტინგით.
3. პირველი თერმული ინკუბაცია
   1. მილები ინკუბირებულია 95 °C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში, აჟიოტაჟით 400 rpm-ზე თერმომიქსერის ან სითბოს ბლოკის გამოყენებით.
   2. ნიმუშები გაცივდეს ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში.
4. პირველი Sonication VialTweeter-ით
   1. მოათავსეთ მილები VialTweeter-ში.
   2. დააყენეთ VialTweeter UP200St ქვემოთ მოცემულ მნიშვნელობებზე და დააყენეთ სონიკა.
Sonicator პარამეტრები
• დააყენეთ ამპლიტუდა (A) 100%-ზე
• დააყენეთ პულსაციის რეჟიმი (C) 100%-ზე
• პერიოდის საათი: ჩართული
• დროულად: 60 წ
• გამორთვის დრო: 30 წმ
• ლიმიტის მნიშვნელობა: 15 წთ (შეესაბამება 10 ციკლს)
(საანგარიშო შენიშვნა: (60 წმ ჩართვა + 30 წმ გამორთვა) × 10 ციკლი = 900 წმ = 15 წთ)
5. მეორე თერმული ინკუბაცია
   ამოიღეთ მილები და კვლავ ინკუბაცია 95 °C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში, 400 rpm.
6. მეორე გაჟღერება
   გაიმეორეთ sonication VialTweeter-ზე იგივე პარამეტრების გამოყენებით (როგორც ზემოთ) დამატებითი 10 ციკლისთვის (სულ 15 წთ).
7. ლიზატის გარკვევა
   1. ნიმუშების ცენტრიფუგა 13000 × გ 10 წუთის განმავლობაში 23°C (ოთახის ტემპერატურაზე).
   2. ფრთხილად შეაგროვეთ სუპერნატანტი ახალ 2.0 მლ Safe-lock Eppendorf მილში. მოერიდეთ პელეტის დარღვევას.
8. ქვემოთ დამუშავება
   ლიზატი ახლა მზად არის SP3 გაწმენდისა და ფერმენტული მონელებისთვის.

შენიშვნები და საუკეთესო პრაქტიკა

1. სონიკაციის დროს გადახურების რისკი მცირდება დაპროგრამებული ჩართვა/გამორთვის ველოსიპედით.
2. მოერიდეთ მორევას სონიკაციის შემდეგ, რათა თავიდან აიცილოთ ცილების აგრეგაცია.

ნარჩენების გატანა და უსაფრთხოება

ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ მითითებას ჩვენი ლაბორატორიის ზომის ულტრაბგერითი აპარატების სავარაუდო დამუშავების შესაძლებლობის შესახებ: