სტაფილოკოკის ბიოფილმის კულტივაციისა და გამოყოფის პროტოკოლი

სტანდარტიზებული მეთოდები აუცილებელია კვლევის საიმედო შედეგების მისაღებად. აქ შეგიძლიათ გაეცნოთ სტაფილოკოკური ბიოფილმების კულტივირებისა და მოცილების პროტოკოლს. ეს პროტოკოლი ორიენტირებულია ნიმუშების გამარტივებულ, მაღალგამტარუნარიან მომზადებაზე UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორის გამოყენებით, 96-ფოსოიანი ფირფიტებიდან ბიოფილმების ეფექტური, მაღალგამტარუნარიანი მოცილებისთვის. პროტოკოლი ასევე შეიცავს ბიოფილმის კულტივირების, რეცხვისა და ვიზუალიზაციის ძირითად ეტაპებს, ცვალებადობის მინიმუმამდე შემცირებასა და შედეგების განმეორებადობის უზრუნველყოფაზე აქცენტით.

სტაფილოკოკის ბიოფილმისა და ანტიბიოტიკების კვლევა

სტაფილოკოკის ბიოფილმები მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ხანგრძლივად მიმდინარე ინფექციებში, ანტიბიოტიკებისა და იმუნური რეაქციების მიმართ მათი გამძლეობის გამო. ბიოფილმის წარმოქმნა ბაქტერიებისთვის დამცავ გარემოს ქმნის, რაც ინფექციების მკურნალობას ართულებს. ბიოფილმების კვლევა ხშირად მიმართულია მათი წარმოქმნის, ქცევისა და ანტიმიკრობული საშუალებებისადმი მგრძნობელობის შესწავლაზე, ექსპერიმენტული სამუშაო პროცესების გასამარტივებლად მაღალგამტარუნარიან მეთოდებზე აქცენტით.
UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი მნიშვნელოვან უპირატესობას იძლევა ბიოფილმების კვლევაში, რადგან 96-ფოსოიანი ფირფიტებიდან ბიოფილმების სწრაფად და ეფექტურად მოცილების საშუალებას იძლევა. ეს მოწყობილობა ყველა ფოსოს თანაბრად აწვდის ულტრაბგერით ენერგიას, რაც სტაბილურ შედეგებს უზრუნველყოფს და ცვალებადობას ამცირებს.

სტაფილოკოკის ბიოფილმის კულტივაციისა და გამოყოფის პროტოკოლი

ქვემოთ მოცემული ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქცია გაგაცნობთ სტაფილოკოკის ბიოფილმის კულტივირებისა და მოცილების პროცესს. ანალიტიკური ეტაპის მაგალითად გაჩვენებთ, როგორ განისაზღვროს კულტივირებული ბიომასის რაოდენობა სპექტროფოტომეტრიულად, კრისტალური იისფერით შეღებვის გამოყენებით.

სტაფილოკოკის ბიოფილმის კულტივაცია

საჭირო მასალები:

• სტერილური, ბრტყელძირიანი, 96-ფოსოიანი პოლისტიროლის მიკროტიტრული ფირფიტები ხუფებით, რომელთა ზედაპირიც დამუშავებულია ქსოვილოვანი კულტურებისთვის
• ტრიპტიკური სოიოს ბულიონი (TSB) 0.25% გლუკოზით
• ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტი

ნაბიჯები:

1. მოამზადეთ სტერილური სამუშაო გარემო ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტში დაბინძურების შესამცირებლად.
2. მიკროტიტრული ფირფიტის ფოსოებში დაამატეთ TSB, რომელიც შეიცავს 0,25% გლუკოზას. გლუკოზის გარეშე TSB, როგორც წესი, არ უწყობს ხელს ბიოფილმის წარმოქმნას და საჭიროების შემთხვევაში მხოლოდ საკონტროლო ვარიანტად უნდა გამოიყენოთ.
3. ფოსოებში შეიტანეთ ქვემოთ აღწერილი წესით მომზადებული ბაქტერიული შტამების ინოკულუმი:
4. მოამზადეთ ბაქტერიული სუსპენზიები და უზრუნველყავით, რომ მათში არ დარჩეს წინასწარ არსებული უჯრედული გროვები: სუსპენზიები გააჰომოგენიზეთ ულტრაბგერით ან გროვები დაშალეთ 23-კალიბრიანი ნემსით და ვორტექსზე ხანმოკლე შერევით.
5. დახურეთ ფირფიტა სახურავით და ინკუბაცია მოახდინეთ ბიოფილმის ფორმირებისთვის ოპტიმალურ პირობებში (მაგ. 37°C 24 საათის განმავლობაში).
6. საიმედოობის უზრუნველსაყოფად ექსპერიმენტი თითოეული ბაქტერიული შტამისთვის სამ პარალელურ განმეორებაში ჩაატარეთ (სამი ფოსო თითო შტამზე).
7. თითოეულ ფირფიტაზე უარყოფითი კონტროლისთვის გამოყავით ექვსი ფოსო. თითო 96-ფოსოიან ფირფიტაზე შესაძლებელია 30-მდე შტამის შემოწმება.

ბიოფილმის ვიზუალიზაცია და რეცხვა

1. ინკუბაციის შემდეგ ფრთხილად მოაცილეთ საკვები არე ისე, რომ ბიოფილმი არ დაზიანდეს.
2. პლანქტონური ბაქტერიების მოსაშორებლად თითოეული ფოსო ოთხჯერ გარეცხეთ ფიზიოლოგიური ხსნარით.
3. დაათვალიერეთ ფოსოების ფსკერი თეთრი უბნების გამოსავლენად, რომლებიც ბიოფილმის არსებობაზე მიუთითებს.

ბიოფილმის მოცილება მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორ UIP400MTP-ის გამოყენებით

მოწყობილობის დაყენება და პარამეტრები:

• UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი
• ოპერაციული პარამეტრები: 60% ამპლიტუდა, ციკლის რეჟიმი 60 წამის ჩართვით / 30 წამის გამორთვით

ნაბიჯები:

1. მოათავსეთ გარეცხილი მიკროტიტრის ფირფიტა UIP400MTP პლატფორმაზე.
2. ნიმუშები დაამუშავეთ ულტრაბგერით რეკომენდებული პარამეტრებით (60% ამპლიტუდა, 60 წამი ჩართული, 30 წამი გამორთული). პარამეტრები მოარგეთ ბაქტერიულ შტამს.
3. დაიწყეთ ულტრაბგერითი დამუშავება ბიოფილმის მოსაცილებლად. ულტრაბგერითი ტალღები შლის ბიოფილმის მატრიქსს და ათავისუფლებს მიმაგრებულ ბაქტერიებს.
4. UIP400MTP უზრუნველყოფს ყველა ფოსოზე თანაბარ ზემოქმედებას, რათა ბიოფილმის მოცილების შედეგები სტაბილური იყოს.

ანალიტიკური ნაბიჯი: მოწყვეტილი სტაფილოკოკის ბიოფილმის ბიომასის რაოდენობრივი განსაზღვრა კრისტალური იისფერის გამოყენებით (CV)

საჭირო მასალები:

• 0.1% კრისტალური იისფერი (CV) ხსნარი
• 95% ეთანოლი ან 30% ძმარმჟავა (გასახსნელად)
• მიკროფირფიტების წამკითხველი, რომელსაც შეუძლია გაზომვა 570 ნმ ტალღის სიგრძეზე
• სტერილური მიკროტიტრული ფირფიტები შეღებვისთვის

ნაბიჯები:

1. შესაღები ფირფიტის მომზადება: ულტრაბგერით დამუშავებული ფირფიტის თითოეული ფოსოდან გადაიტანეთ მოცილებული ბიოფილმის სუსპენზიის 100 µL სუფთა, სტერილური 96-ფოსოიანი მიკროტიტრული ფირფიტის შესაბამის ფოსოებში. ეს შეღებვისთვის სუფთა და ერთგვაროვან გარემოს უზრუნველყოფს.
2. მოცილებული ბიოფილმის შეღებვა: თითოეულ ფოსოში, რომელიც მოცილებული ბიოფილმის სუსპენზიას შეიცავს, დაამატეთ 150 µL 0.1% კრისტალური იისფერის ხსნარი. პიპეტით ნაზად აურიეთ, რათა ბიოფილმის სუსპენზია და კრისტალური იისფერი თანაბრად შეერიოს.
3. ინკუბაცია: ფირფიტა 15 წუთის განმავლობაში გააჩერეთ ოთახის ტემპერატურაზე, რათა კრისტალურმა იისფერმა ბიომასა ეფექტურად შეღებოს.
4. რეცხვა: ინკუბაციის შემდეგ ფოსოებიდან ფრთხილად მოაცილეთ კრისტალური იისფერის ხსნარი ისე, რომ ბიომასა არ დაზიანდეს. თითოეული ფოსო სამჯერ გარეცხეთ სტერილური ფიზიოლოგიური ხსნარით შეუკავშირებელი საღებავის მოსაშორებლად.
5. გაშრობა: გააშრეთ ფირფიტა ჰაერში ოთახის ტემპერატურაზე ან სტერილური ჰაერის ნაკადის ქვეშ. მოერიდეთ გათბობას, რადგან ამან შეიძლება შეცვალოს შედეგები.
6. გახსნა: შეკავშირებული კრისტალური იისფერის გასახსნელად თითოეულ ფოსოში დაამატეთ 200 µL 95% ეთანოლი (ან 30% ძმარმჟავა, სტანდარტული ლაბორატორიული პრაქტიკის მიხედვით). ნაზად აურიეთ პიპეტით ან ფირფიტის შენჯღრევით 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.
7. გაზომვა: მიკროფირფიტების წამკითხველით გაზომეთ გახსნილი კრისტალური იისფერის ხსნარის ოპტიკური სიმკვრივე (OD) 570 ნმ ტალღის სიგრძეზე.
8. მონაცემთა ანალიზი: გამოაკლეთ უარყოფითი კონტროლის საშუალო OD570 მნიშვნელობა (ჭები TSB-ით, მაგრამ არა ბაქტერიული ინოკულუმი) ექსპერიმენტული ჭაბურღილებიდან, რათა მოხდეს ფონის შეღებვა. ჩაწერეთ და გააანალიზეთ მონაცემები.

შენიშვნა: განმეორებადობის უზრუნველსაყოფად ექსპერიმენტი თითოეული პირობისთვის სამ პარალელურ განმეორებაში ჩაატარეთ. კრისტალურ იისფერსა და ეთანოლთან მუშაობისას დაიცავით სათანადო მოპყრობის, უსაფრთხოებისა და უტილიზაციის წესები.
 

UIP400MTP-ის ძირითადი უპირატესობები ერთი შეხედვით:

• მაღალი გამტარუნარიანობის დამუშავება: შექმნილია სპეციალურად მრავალფოსოიანი ფირფიტებისთვის, რაც საშუალებას გაძლევთ ერთდროულად დაამუშაოთ მრავალი ნიმუში.
• ულტრაბგერის თანაბარი განაწილება: უზრუნველყოფს ყველა ფოსოში ულტრაბგერის თანაბარ ინტენსივობას და ყველა ნიმუშისთვის სტაბილურ შედეგებს.
• გამოიყენეთ ნებისმიერი სტანდარტული ფირფიტა: UIP400MTP-თან შესაძლებელია ნებისმიერი სტანდარტული მრავალფოსოიანი ფირფიტის, პეტრის ფინჯნისა და სინჯარების შტატივის გამოყენება. ძვირადღირებული, მხოლოდ ამ მოწყობილობისთვის განკუთვნილი ფირფიტები საჭირო არ არის!
• მომხმარებლისთვის მოსახერხებელი ინტერფეისი: მარტივი დაყენება და კონტროლი, რაც მას შესანიშნავ ინსტრუმენტად აქცევს ლაბორატორიის პროდუქტიულობის გაზრდისთვის. პროგრამირებადი პარამეტრები და ავტომატიზაცია ხელს უწყობს პროცესის სტანდარტიზაციას!