MBEC ანალიზის პროტოკოლი 96 ჭაბურღილის Plate Sonicator UIP400MTP გამოყენებით
MBEC ანალიზი გამოიყენება ანტიმიკრობული აგენტების კონცენტრაციის დასადგენად, რომელიც საჭიროა სამაგრების ხუფებზე წარმოქმნილი ბიოფილმების აღმოსაფხვრელად. ბიოფილმის სიცოცხლისუნარიანობის შესაფასებლად, ბიოფილები ჯერ უნდა მოიხსნას 96 ჭაბურღილის ფირფიტის სამაგრის ხუფებიდან. Sonication არის ყველაზე საიმედო და ეფექტური მეთოდი ამ რაზმისთვის. მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP სპეციალურად შექმნილია საანალიზო ფირფიტების დასამუშავებლად მაქსიმალური ეფექტურობით და მოხერხებულობით, აუმჯობესებს და აჩქარებს მაღალი გამტარუნარიანობის MBEC ანალიზებს.
Sonication for Biofilm Detachment
Sonication არის გადამწყვეტი ნაბიჯი ბიოფილმის აღმოფხვრის მინიმალური კონცენტრაციის (MBEC) ანალიზში, რაც საშუალებას აძლევს ბიოფილმის უჯრედების ეფექტურ განდევნას მათი ზედაპირიდან. ბიოფილმები არის მიკროორგანიზმების არსებითად სტრუქტურირებული ერთობლიობა, რომელიც ჩასმულია უჯრედგარე მატრიქსში, რაც მათ მნიშვნელოვნად უფრო მდგრადს ხდის ანტიმიკრობული აგენტების მიმართ პლანქტონურ უჯრედებთან შედარებით. MBEC ანალიზების დროს, სონიკა იყენებს ულტრაბგერითი ტალღებს კონტროლირებადი კავიტაციის შესაქმნელად, ბიოფილმის მატრიცას არღვევს და ჩაშენებულ უჯრედებს სუსპენზიაში ათავისუფლებს. ეს ნაბიჯი უზრუნველყოფს ბიოფილმის უჯრედების თანაბრად განაწილებას აღდგენის გარემოში, რაც ხელს უწყობს სიცოცხლისუნარიანობის ზუსტ შეფასებას დაფარვის, განზავების ან სპექტროფოტომეტრიული მეთოდების მეშვეობით. სათანადო ბიოფილმის გამოყოფის გარეშე, მატრიცის ნარჩენმა კომპონენტებმა შეიძლება დაიცვან უჯრედები, რაც გამოიწვევს ანტიმიკრობული ეფექტურობის არასაკმარის შეფასებას. მაშასადამე, სონიკა აუცილებელია საიმედო და რეპროდუცირებადი MBEC მნიშვნელობების მისაღებად, რაც ასახავს გამოცდილი აგენტების ნამდვილ ერადიკაციის პოტენციალს. მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP საშუალებას იძლევა მარტივი მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადება საანალიზო ფირფიტებში.
მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებას საკვლევ ფირფიტებში.
მინიმალური ბიოფილმის ერადიკაციის კონცენტრაციის (MBEC) ანალიზის პროტოკოლი
ნაბიჯი 1: ბიოფილმის ფორმირება
- მოამზადეთ ბაქტერიული სუსპენზია:
გაზარდეთ ბაქტერიები შესაბამის გარემოში ლოგ-ფაზის ზრდისთვის.
განზავდეს ბაქტერიული კულტურა განსაზღვრულ ოპტიკურ სიმკვრივემდე (მაგ., OD600 ~0.1). - ჩაასხით 96 ჭაბურღილის ფირფიტა:
დაამატეთ ბაქტერიული სუსპენზია (მაგ., 150–200 μL) სტანდარტული 96 ჭაბურღილების მიკროტიტრული ფირფიტის თითოეულ ჭაბურღილში. - მიამაგრეთ სამაგრის სახურავი:
მოათავსეთ სამაგრი სახურავი ინოკულირებულ ფირფიტაზე, რათა მოხდეს ბიოფილმის წარმოქმნა სამაგრის ზედაპირებზე. - ფირფიტის ინკუბაცია:
ინკუბაცია ჩაატარეთ შესაბამის ტემპერატურაზე (მაგ., 37°C) 24-48 საათის განმავლობაში შერყევის გარეშე, რათა ხელი შეუწყოს ბიოფილმის ზრდას.
ნაბიჯი 2: მკურნალობა ანტიმიკრობული აგენტებით
- მოამზადეთ ანტიმიკრობული ხსნარები:
მოამზადეთ ანტიმიკრობული კონცენტრაციების სპექტრი ახალ გარემოში.
ბიოფილების გამოვლენა ანტიმიკრობულ აგენტებთან:
ამოიღეთ სამაგრი სახურავი ბაქტერიული კულტურისგან და ჩამოიბანეთ იგი სტერილურ ფიზიოლოგიურ ხსნარში ან PBS-ში პლანქტონური უჯრედების მოსაშორებლად.
მოათავსეთ სამაგრი სახურავი ახალ 96 ჭაბურღილში, რომელიც შეიცავს ანტიმიკრობულ ხსნარებს. - ფირფიტის ინკუბაცია:
ინკუბაცია განსაზღვრული პერიოდის განმავლობაში (მაგ., 24 საათი), რათა დაუშვას ანტიმიკრობული ზემოქმედება.
მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP მაღალი წარმადობის ნიმუშის მომზადებისთვის
ნაბიჯი 3: გაჟღენთვა 96 ჭაბურღილის ფირფიტის Sonicator UIP400MTP-ით
სონიკაციის საფეხური გადამწყვეტია ბიოფილების ამოსაღებად სამაგრის ხუფებიდან სიცოცხლისუნარიანობის შესაფასებლად. მიჰყევით ამ ნაბიჯებს UIP400MTP sonicator-ისთვის:
- მოამზადეთ კონფიგურაცია:
შეავსეთ ახალი 96 ჭაბურღილის ფირფიტა აღდგენითი საშუალებებით (მაგ., ნეიტრალიზებული ბულიონი ან ახალი ზრდის საშუალება) თითოეულ ჭაბურღილში. - გადაიტანეთ სამაგრის სახურავი:
ამოიღეთ სამაგრის სახურავი ანტიმიკრობული სამკურნალო ფირფიტიდან.
ჩამოიბანეთ სამაგრის სახურავი სტერილურ ფიზიოლოგიურ ხსნარში ან PBS-ში ნარჩენი ანტიმიკრობული აგენტების მოსაშორებლად. - მოათავსეთ ფირფიტა და სონიკატორი:
მიამაგრეთ სამაგრი სახურავი აღდგენის საშუალო ფირფიტაზე.
მოათავსეთ აღდგენის საშუალო ფირფიტა UIP400MTP sonicator პლატფორმაზე, დარწმუნდით, რომ ფირფიტა არის ცენტრში და სტაბილური. - დაარეგულირეთ ბგერითი პარამეტრები:
დააყენეთ ხმოვანი პარამეტრები UIP400MTP-ზე (პარამეტრები შეიძლება დარეგულირდეს ბიოფილმზე):
ამპლიტუდა: 70–100%.
გახმოვანების დრო: 1-3 წუთი (შესწორება ბიოფილმის სიმტკიცეზე დაყრდნობით) ციკლის რეჟიმში. - Sonicate:
დაიწყეთ სონიკაციის პროცესი. ულტრაბგერითი ვიბრაცია გადაანაწილებს ბიოფილებს სამაგრის ზედაპირებიდან აღდგენის გარემოში. - პროცესის მონიტორინგი:
გამოიყენეთ ჩამრთველი ტემპერატურის სენსორი ჭაბურღილების ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგისთვის. UIP400MTP შეიძლება დაუკავშირდეს ლაბორატორიულ ჩილერს გაგრილებისთვის. - პოსტ-სონიკაციის მართვა:
დაუყოვნებლივ გადაიტანეთ აღდგენის საშუალება (ახლა შეიცავს მოწყვეტილ ბიოფილებს) ახალ სტერილურ ფირფიტაში ქვედა დინების ანალიზისთვის.
(A) ფირფიტა, რომელიც შეიცავს TSB 2% გლუკოზას, გამოიყენება ბიოფილმის ფორმირებისთვის, უჯრედების აღდგენისთვის და
MIC და MBCB-ის განსაზღვრა; (B) სახურავი ქინძისთავებით სტაფილოკოკური ბიოფილების ფორმირებისთვის. MIC და MBCB-ის განსაზღვრა; (B) სახურავი ქინძისთავებით სტაფილოკოკური ბიოფილების ფორმირებისთვის.
ქინძისთავებზე წარმოქმნილი ბიოფილმის უჯრედები განადგურდა სონიკაციით (Hielscher Ultrasound Technology) 5 წუთის განმავლობაში 96 ჭაბურღილიან თეფშებში, რომლებიც შეიცავდნენ ახალ კულტურას უჯრედების აღდგენისთვის.
(სურათი და შესწავლა: ©de Oliveira et al., 2016)
ნაბიჯი 4: სიცოცხლისუნარიანობის შეფასება
ფირფიტებისა და კულტურის მოწყვეტილი ბიოფილები:
- შეასრულეთ აღდგენის გარემოსა და ფირფიტის სერიული განზავება აგარზე კოლონიების წარმომქმნელი ერთეულების (CFU) დასათვლელად.
ალტერნატიულად, გამოიყენეთ კოლორიმეტრიული ან ფლუორესცენტზე დაფუძნებული სიცოცხლისუნარიანობის ანალიზი. - შედეგების ჩანაწერი:
განსაზღვრეთ MBEC, როგორც ანტიმიკრობული ნივთიერების ყველაზე დაბალი კონცენტრაცია, რომელმაც აღმოფხვრა ბიოფილმის სიცოცხლისუნარიანობა.
დიზაინი, წარმოება და კონსულტაცია – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher sonicators.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
გაამარტივეთ ნიმუშის მომზადება 96 ჭაბურღილიან ფირფიტებში და საანალიზო ფირფიტებში მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორის UIP400MTP გამოყენებით
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
ხშირად დასმული შეკითხვები
რა არის MBEC ანალიზი?
მინიმალური ბიოფილმის ერადიკაციის კონცენტრაციის ანალიზი (MBEC) არის სტანდარტიზებული მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ანტიმიკრობული აგენტის ყველაზე დაბალი კონცენტრაციის დასადგენად, რომელიც საჭიროა ბიოფილმთან ასოცირებული ბაქტერიების აღმოსაფხვრელად. იგი მოიცავს ბიოფილების გაზრდას სპეციალიზებულ ზედაპირებზე, მათ სხვადასხვა ანტიმიკრობული კონცენტრაციის ზემოქმედებას და ბიოფილმის დაშლის შემდეგ გამოყოფილი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის შეფასებას, როგორც წესი, სონიკაციის გზით, მკურნალობის ეფექტურობის შესაფასებლად.
რა განსხვავებაა MBIC-სა და MBEC-ს შორის?
ბიოფილმის მინიმალური ინჰიბიტორული კონცენტრაცია (MBIC) არის ანტიმიკრობული აგენტის ყველაზე დაბალი კონცენტრაცია, რომელიც საჭიროა ბიოფილმის წარმოქმნის თავიდან ასაცილებლად, ხოლო ბიოფილმის ერადიკაციის მინიმალური კონცენტრაცია (MBEC) არის ყველაზე დაბალი კონცენტრაცია, რომელიც საჭიროა დადგენილი ბიოფილმის აღმოსაფხვრელად. MBIC ფოკუსირებულია ბიოფილმის პრევენციაზე, ხოლო MBEC აფასებს მკურნალობის ეფექტურობას სექსუალურ ბიოფილმებთან მიმართებაში.
რა ფირფიტები გამოიყენება ჩვეულებრივ MBEC ანალიზებისთვის?
მიკროტიტრული ფირფიტები, რომლებიც ჩვეულებრივ გამოიყენება MBEC ანალიზებისთვის, არის 96 ჭაბურღილის ფირფიტები, რომლებიც დამზადებულია პოლისტიროლის ან პოლიპროპილენისგან. ეს მასალები უზრუნველყოფს შესაფერის ზედაპირს ბიოფილმის ფორმირებისთვის და ქიმიურად მდგრადია ანალიზის დროს შემოწმებული ანტიმიკრობული აგენტების მიმართ. პოლისტირონის ფირფიტები ფართოდ არის სასურველი მათი ოპტიკური გამჭვირვალობის გამო, რაც ხელსაყრელია ქვედა დინების ანალიზებისთვის, როგორიცაა სპექტროფოტომეტრიული ან ფლუორესცენციის საფუძველზე გაზომვები. ამ ფირფიტების დიზაინი მოიცავს მოხსნადი სამაგრის ხუფებს, რომლებიც აუცილებელია ანალიზისთვის, ვინაიდან ბიოფილები წარმოიქმნება კალმებზე, რომლებიც ჩაძირულია ზრდის მედიის შემცველ ჭებში. სტანდარტიზებული ფირფიტები, როგორიცაა MBEC ანალიზის პროტოკოლთან შესაბამისობა, სპეციალურად არის შემუშავებული, რათა უზრუნველყოფილი იყოს განმეორებადობა და თავსებადობა UIP400MTP sonicator-თან ან სხვა გადამამუშავებელ მოწყობილობასთან.
რა არის PEG-Lid ფირფიტები?
PEG-სახურავი ფირფიტები არის სპეციალიზებული მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტების სისტემები, სადაც სახურავი აღჭურვილია მცირე ზომის პოლიეთილენ გლიკოლის (PEG) სამაგრებით ან ქინძისთავებით, რომლებიც ვრცელდება თითოეულ ჭაბურღილში. ეს სამაგრები უზრუნველყოფს ზედაპირს მიკრობული ბიოფილმის ფორმირებისთვის კონტროლირებად პირობებში, რეალურ სამყაროში ბიოფილმის ზრდის მიბაძვით. დიზაინი საშუალებას აძლევს ბიოფილებს განვითარდეს სამაგრებზე, ხოლო ჭაბურღილები შეიცავს ზრდის მედიას ან ანტიმიკრობულ აგენტებს, რაც საშუალებას იძლევა ბიოფილმის მგრძნობელობის მაღალი გამტარუნარიანობის ტესტირება მკურნალობაზე, როგორიცაა MBEC და MBIC ანალიზები.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი ხარისხის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორებისგან ლაბორატორია რომ სამრეწველო ზომა.