高純度シゾフィランβグルカンの超音波製造

シゾフィランは、免疫調節作用を持つ真菌のβ-グルカンである。高い薬効を発揮するためには、シゾフィランはバイオアベイラビリティを向上させるために低分子量でなければならない。超音波処理は、シゾフィランの分子量を低下させることが証明されている。信頼性が高く効果的な方法として、超音波処理は低分子量シゾフィランの製造に容易に適用することができる。

シゾフィラム茸と超音波ベータグルカン抽出

シゾフィラム茸の仲間は、自然界では雨季の後に朽ち木に生える。子実体は次の乾季に採取される。シゾフィラムの仲間はグルカンなどの生化学的化合物を豊富に含んでいるため、特に熱帯の国々では食品や医薬品として消費されている。免疫調節作用、抗真菌作用、抗悪性腫瘍作用、抗ウイルス作用があることから、スプリットギル茸としても知られるシゾフィラム属のキノコは、バイオテクノロジー企業や製薬会社を魅了している。
多糖類のシゾフィランは、シゾフィラン、ソニフィラン、シゾフィランとしても知られ、シゾフィラム茸に含まれる主要なβ-グルカンであり、非常に有効な生理活性β-グルカンのシゾフィランを提供する。
Schizophyllum communeキノコは、自然界では木の上に成長し、菌糸体はまた、発酵ブロスで培養することができる。医薬品や化粧品用途では、低分子量シゾフィランは、高分子量シゾフィランよりもはるかに有効である。これは、低分子量シゾフィランが有意に良好な生物学的利用能と吸収率を示すという事実に起因する。さらに、高分子量シゾフィランは、その水溶液の高粘度をもたらすので、アプリケーションではしばしば問題がある。
超音波によるサイズリダクションは、シゾフィランの分子量を低下させ、β-グルカン分子の品質を向上させる非常に効果的で信頼性の高い技術である。

低分子シゾフィラン製造プロトコール

分子量の大きいシゾフィランは、生物学的利用能と応用特性が飛躍的に向上するため、スミノウの研究チームは、β-グルカン分子シゾフィランの切断とサイズ縮小のための超音波処理を研究した。

シゾフィランの超音波処理

β-1.3(1.6)-グルカン・シゾフィラン(SPG)は、スクロースを基質とするバイオリアクターでS. commune菌を浸漬培養することにより生産された。
培養終了後、培養ブロスを脱塩水で希釈し、シゾフィラン濃度2g/Lに調整した。 超音波プロセッサ UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germany)を使用し、以下のパラメーターと条件で、リサイクルモードで行った：培地フロー50 mL/s、周波数20 kHz、出力2000 W、ソノトロードタイプBS2d22、ブースタータイプB2-1.4、振幅100%。超音波処理開始時の培養ブロス温度は25℃であった。超音波処理した培養ブロス（比エネルギー入力100 Ws/mL）を、40℃で1.5 barの圧力下、Seitz HS800デプスフィルターでろ過した。濾液を3倍量のイソプロピルアルコールで沈殿させ、60℃で12時間乾燥させた：(1) 超音波処理した培養ブロス濾液を0.1m2のPall Centramate TシリーズPESカセット（100 kDaカットオフ）にて0.8 barで透析濾過し、返送液の導電率が20 μS/cmになるまで透析濾過を続けた；(2) 透析濾過により溶液をuSPG濃度1 g/Lまで濃縮し、120℃/20分のオートクレーブ滅菌を行った。NaOHを0.2Mの濃度で培養ブロス濾液に添加し、アルカリ化した溶液を透析濾過の前に実験室温度で30分間インキュベートした以外は、同様の方法で変性uSPGを調製した。

分析方法

菌糸体の収量は、培養ブロスを水で1:4に希釈し、10000×g、25℃で20分間遠心分離した後、沈殿物を3倍量の水で洗浄し、60℃で乾燥して重量を測定した。上清からシゾフィランを3倍量のイソプロピルアルコールで沈殿させ、60℃で24時間乾燥させ、その収量を重量法で測定した。培養ブロス中のpO2は光学プローブHamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Switzerland)で測定した。
培養ブロスの動的粘度は、HAAKE Visco Tester 6Lを用い、スピンドル1Lおよび2L、温度4℃、回転数30rpmで測定した。濾過速度は、500mLの培養ブロスを200×200mmのSeitz HS800（Pall、USA）デプスフィルターに通し、1.5barの圧力、40℃で濾過した時間から算出した。
uSPGの分子量は、PL aquagel OH60およびPL aquagel OH40カラムを直列に接続したHPLCシステムAlliance（Waters）を用いてSEC-MALLSで測定し、検出器miniDAWN TREOS（Wyatt）を用いてuSPG濃度1g/Lまで透析濾過で濃縮し、120℃/20分のオートクレーブ滅菌を行った。変性uSPGは、培養ブロス濾液に0.2MのNaOHを加え、アルカリ化した溶液を透析濾過前に実験室温度で30分間インキュベートした以外は同様の方法で調製した。

結果
超音波処理は、SPGの下流処理を容易にするため、菌糸を含むS. communeの144時間培養ブロスに直接適用した。
 
音波処理したシゾフィランの特徴： 超音波処理したシゾフィラン（uSPG）を培養ブロス濾液からアルコールで沈殿させ、その特性を調べた。SEC-MALLSにより、uSPGのMwは約1 MDaと推定された。液体発酵によるシゾフィランの平均分子量は約5 MDaであるが、固体培養では10 MDaに達することもある。超音波処理したシゾフィランの分子量を、未処理のネイティブなシゾフィランの分子量と比較すると、超音波処理によって分子量が5〜10倍減少していることが観察される。
超音波処理されたuSPGは0.7%w/wのタンパク質と1.0%w/wの点火後の残渣を含んでいた。この分析結果は、超音波処理によってβ-グルカン骨格がランダムに切断され、側枝はそのまま残るため、シゾフィランのサイズと分子量が減少することを示している。本質的にタンパク質とエンドトキシンを含まないuSPGの免疫学的研究は、超音波処理された低Mwシゾフィランが顕著な免疫調節活性を有することを示した。

 
粘度の低下： 超音波処理により、培養ブロスの粘度は著しく低下した。超音波処理中、培養ブロスの粘度は非線形に変化した。粘度の低下は超音波処理の初期には急激であったが、その後緩やかになった。比エネルギー入力100 Ws/mLは、培養ブロスの粘度をほぼ7倍低下させるのに十分であった。

ろ過性能の向上： 超音波処理した培養ブロスは、高分子SPGで未処理の培養ブロス（比エネルギー入力0Ws/mL）よりも速くフィルターを通過した。その上、超音波処理により、濾過中の生成物の損失が有意に減少した。高分子SPGを添加した未処理培養ブロス（比エネルギー投入量0 Ws/mL）の濾液には0.3±0.07 g/LのSPGが含まれていたが、深層濾過前のSPG濃度は2 g/Lであった。一方、100 Ws/mL超音波処理した培養液の濾液には2.2±0.2 g/LのSPGが含まれており、生成物の損失はほぼゼロであった。

結論 研究チームは結論として、超音波処理は低分子化シゾフィラン製造のための効率的な技術であり、化粧品や医薬品に利用できる、と述べている。超音波処理は、菌糸体を含む完全培養ブロスに適用すると、シゾフィラン製造に一定の利点をもたらす。それは、下流の処理の間に製品の損失を低減し、限外ろ過の効率的な使用のために高度に精製された多糖類の生産が可能になります。
さらに研究者らは、シゾフィランの超音波処理は容易に拡張可能であることを発見した。パイロットプラントの超音波分解装置UIP2000hdTの1ユニットは、フローモードで1リットルの培養ブロスを110秒で処理した。システムの生産性は、追加の超音波ユニットを順次接続することで容易に向上させることができる。

 
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真菌グルカン処理用高性能超音波装置

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下の表は、超音波処理装置の処理能力の目安です：