高純度シゾフィランβ-グルカンの超音波製造

シゾフィランは、免疫調節特性を持つ真菌由来のβ-グルカンです。高い薬効を発揮するには、シゾフィランの分子量が低く、生物学的利用能が向上している必要があります。超音波処理によってシゾフィランの分子量が低下することが実証されています。信頼性が高く効果的な方法である超音波処理は、低分子量シゾフィランの製造に容易に適用できます。

スエヒロタケ属のキノコと超音波によるβ-グルカン抽出

スエヒロタケ属のキノコは、自然界では雨季の後に腐朽した樹木上に生育します。子実体は、その後の乾季に採取されます。スエヒロタケ属の種はグルカンなどの生化学物質を豊富に含むため、特に熱帯諸国では食品や薬として利用されています。スエヒロタケとも呼ばれるSchizophyllum communeは、免疫調節、抗真菌、抗腫瘍、抗ウイルス特性を持つことから、バイオテクノロジー企業や製薬企業の関心を集めています。
sizofiran、sonifilan、sizofilanとも呼ばれる多糖類シゾフィランは、スエヒロタケ属のキノコに含まれる主要なβ-グルカンです。これらのキノコからは、非常に高い効果を持つ生理活性β-グルカンであるシゾフィランが得られます。
Schizophyllum communeは自然界では樹木上に生育しますが、その菌糸体は発酵培地でも培養できます。医薬品や化粧品への用途では、低分子量シゾフィランは高分子量シゾフィランよりもはるかに効果的です。これは、低分子量シゾフィランの生物学的利用能と吸収率が著しく優れているためです。また、高分子量シゾフィランは水溶液の粘度を高くするため、用途によっては問題になることがよくあります。
超音波によるサイズ低減は、シゾフィランの分子量を低下させ、それによってβ-グルカン分子の品質を向上させる、非常に効果的で信頼性の高い技術です。

低分子量シゾフィランの製造プロトコル

分子量のシゾフィランは、生物学的利用能と用途上の特性が格段に優れているため、Smirnouの研究チームは、β-グルカン分子であるシゾフィランの切断とサイズ低減を目的として超音波処理を検討しました。

シゾフィランの超音波処理

β-1.3(1.6)-Glucanであるシゾフィラン（SPG）は、スクロースを基質として、バイオリアクター内でS. commune菌を液中培養することにより製造されました。
培養終了後、培養液を脱塩水で希釈してシゾフィラン濃度を2 g/Lとし、 超音波処理装置UIP2000hdT （Hielscher Ultrasonics GmbH、ドイツ）を使用して、循環モードで超音波処理しました。パラメーターと条件は、培養液の流量50 mL/s、周波数20 kHz、出力2000 W、ソノトロード型式BS2d22、ブースター型式B2-1.4、振幅100%でした。超音波処理開始時の培養液温度は25°Cでした。超音波処理した培養液（比エネルギー投入量100 Ws/mL）を、40°C、圧力1.5 barでSeitz HS800デプスフィルターを通してろ過しました。化学的特性評価用の超音波処理シゾフィラン（uSPG）は、実験室温度でろ液に三倍量のイソプロピルアルコールを加えて沈殿させ、60°Cで12h乾燥しました。免疫学的研究用のuSPG溶液は、次のように調製しました。（1）超音波処理した培養液のろ液を、0.8 barで0.1m2のPall Centramate T-series PESカセット（分画分子量100 kDa）を使用してダイアフィルトレーションし、保持液の導電率が20 μS/cmになるまでダイアフィルトレーションを続けました。（2）溶液をダイアフィルトレーションによりuSPG濃度1 g/Lまで濃縮し、120°C/20 minのオートクレーブ処理で滅菌しました。変性uSPGも同様に調製しましたが、ダイアフィルトレーション前に、培養液のろ液にNaOHを濃度0.2 Mとなるように加え、アルカリ化した溶液を実験室温度で30 minインキュベートしました。

分析方法

菌糸体収量は重量法で評価しました。培養液を水で1:4に希釈し、25°C、10,000 × gで20 min遠心分離しました。沈殿物を三倍量の水で洗浄し、60°Cで乾燥して秤量しました。上清に三倍量のイソプロピルアルコールを加えてシゾフィランを沈殿させ、60°Cで24h乾燥し、その収量を重量法で測定しました。培養液中のpO2は、光学プローブHamilton-Visiferm DO 120（Hamilton、スイス）で測定しました。
培養液の粘度は、スピンドル1Lおよび2Lを装着したHAAKE Visco Tester 6Lを用いて、4°C、回転速度30 rpmで測定しました。ろ過速度は、500 mLの培養液を圧力1.5 bar、40°Cで200 × 200 mmのSeitz HS800（Pall、米国）デプスフィルターに通した際のろ過時間から算出しました。
uSPGの分子量は、直列接続したPL aquagel OH60およびPL aquagel OH40カラムを備えたHPLCシステムAlliance（Waters）でSEC-MALLSにより測定し、検出器miniDAWN TREOS（Wyatt）はダイアフィルトレーションによりuSPG濃度1 g/Lまで濃縮され、120°C/20 minのオートクレーブ処理で滅菌されました。変性uSPGも同様に調製しましたが、ダイアフィルトレーション前に、培養液のろ液にNaOHを濃度0.2 Mとなるように加え、アルカリ化した溶液を実験室温度で30 minインキュベートしました。

結果：
SPGの下流工程を容易にするため、菌糸体を含むS. communeの144-h培養液に直接超音波処理を適用しました。
 
超音波処理したシゾフィランの特性： 超音波処理したシゾフィラン（uSPG）を、培養液のろ液からアルコールで沈殿させ、特性を評価しました。SEC-MALLSにより、uSPGのMwは約1 MDaと推定されました。液体発酵によるシゾフィランの平均分子量は約5 MDaですが、固体培養では最大10 MDaに達する場合があります。超音波処理したシゾフィランの分子量を未処理の天然シゾフィランの分子量と比較すると、超音波処理によって分子量が元の5–10分の一に低下することが確認できます。
超音波処理した多糖類uSPGには、0.7%w/wのタンパク質と1.0%w/wの強熱残分が含まれていました。uSPG加水分解物は、99%を超えるグルコースで構成されていました。分析結果は、超音波処理がβ-グルカンの主鎖をランダムに切断する一方、側鎖はそのまま保持されることで、シゾフィランのサイズと分子量が低減することを示しています。タンパク質とエンドトキシンを実質的に含まないuSPGの免疫学的研究では、超音波処理した低Mwシゾフィランに顕著な免疫調節活性があることが示されました。

 
粘度の低下： 超音波処理によって培養液の粘度が大幅に低下しました。超音波処理中、培養液の粘度は非線形に変化しました。超音波処理の開始時には粘度が急速に低下しましたが、その後は低下が緩やかになりました。比エネルギー投入量100 Ws/mLで、培養液の粘度をほぼ7分の一に低下させることができました。

ろ過の改善： 超音波処理した培養液は、高分子量SPGを含む未処理の培養液（比エネルギー投入量0 Ws/mL）よりも速くフィルターを通過しました。また、超音波処理によってろ過中の製品損失が大幅に減少しました。高分子量SPGを含む未処理の培養液（比エネルギー投入量0 Ws/mL）のろ液には0.3 ± 0.07 g/LのSPGが含まれていましたが、デプスろ過前のSPG濃度は2 g/Lでした。これに対して、100 Ws/mLで超音波処理した培養液のろ液には、濃度2.2 ± 0.2 g/LのSPGが含まれており、これは製品損失がほぼゼロであることに相当します。

結論： 研究チームは結論として、超音波処理は、化粧品や医薬品に使用できる低分子量シゾフィランを製造するための効率的な技術であるとまとめています。菌糸体を含む培養液全体に超音波処理を適用すると、シゾフィランの製造に一定の利点がもたらされます。下流工程での製品損失が減少し、限外ろ過を効率的に利用することで高純度多糖類の製造が可能になります。
さらに研究者らは、シゾフィランの超音波処理は容易にスケールアップできることを確認しました。パイロットプラント用超音波破砕装置UIP2000hdTの一台で、フローモードにより1 リットルの培養液を110 sで処理しました。超音波装置を追加して直列に接続することで、システムの生産性を容易に高めることができます。

 
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真菌由来グルカン処理用の高性能超音波装置

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シゾフィランなどのβ-グルカンの分子量を低減するには、狙いどおりの切断を実現し、医薬用途に使用できる高品質のシゾフィラン最終製品を得るために、強力な超音波が必要です。
 
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以下の表は、当社の超音波処理装置のおおよその処理能力を示しています。