ミトコンドリア診断のためのハイスループットサンプル調製

研究や臨床におけるミトコンドリア診断は、シーケンシング、PCR、生化学的アッセイなど、さまざまな技術を用いて行われます。これらの方法は、DNA変異の同定とミトコンドリア機能の測定に使用されます。シーケンシングは遺伝子変異の検出に役立ち、PCRは特定のDNA配列を定量できます。生化学的アッセイは、ミトコンドリアのタンパク質や酵素の機能を評価します。

ミトコンドリア疾患の診断は、これらの疾患の臨床像に顕著な多様性があることに加え、異なる遺伝様式を持つ二つのゲノム、すなわちミトコンドリアDNA（mtDNA）と核ゲノムの間に複雑な相互作用があるため、特に困難です。

超音波処理によるDNAの抽出と断片化

筋組織からのDNA抽出は、mtDNAに組織特異的な変化が疑われる場合に特に有用です。こうした変化には、慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）におけるmtDNAの欠失、ミトコンドリアミオパチーにおけるmtDNAの点変異、アルパース症候群におけるmtDNAの枯渇などが含まれる可能性があります。筋組織から抽出したDNAは、その後、欠失を調べるサザンブロットやロングレンジPCR、枯渇を調べるリアルタイムPCR、点変異を調べるシーケンシングなど、さまざまな遺伝子検査に使用できます。
強力な超音波を用いる超音波処理は、ミトコンドリア診断のさまざまな用途に適用されます。細胞を溶解してミトコンドリアやDNAなどの細胞内成分を抽出すること、シーケンシングのためにmtDNAやnDNAなどのDNAをせん断すること、サンプルを均質化することに使用されます。

ハイスループットサンプル調製用のプレート超音波処理装置UIP400MTP：UIP400MTPは、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、96ウェルプレート内のサンプルを均一に超音波処理し、細胞破砕、タンパク質抽出、mtDNAやnDNAなどのDNAの断片化を行います。

ハイスループットサンプル調製用のプレート超音波処理装置UIP400MTPはマルチウェルプレートおよび96ウェルプレート内のサンプルを均一に超音波処理します

細胞や組織からミトコンドリアを単離する方法

ミトコンドリアの単離には、細胞を破砕して内容物を放出させることと、分画遠心法を用いてミトコンドリア画分を分離・回収することの二つの不可欠な工程があります。

超音波処理
Hielscherの超音波処理装置は、標準的な溶解バッファーやキットに対応しているため、ミトコンドリアの単離に適しています。超音波処理には、主に二つの目的があります。

細胞溶解： 超音波が細胞膜を破砕し、細胞内成分を放出させます。
ミトコンドリアの破砕： 後続工程での超音波処理により、ミトコンドリアを破砕してミトコンドリアタンパク質やミトコンドリアDNAを放出させることができます。
mtDNAの断片化： 超音波処理は、シーケンシングのためにミトコンドリアDNAをせん断する信頼性の高い技術です。

マルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPは、ミトコンドリアサンプルのハイスループットサンプル調製を可能にします。分画遠心法と組み合わせることで、超音波処理はミトコンドリアの単離効率を高め、さまざまな後続の用途に適した、損傷のないミトコンドリアを高収量で確保します。

PCRプレートを装着したHielscherのマルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP

Hielscherのマルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPはあらゆる標準プレートで使用できます

細胞の剥離、バイオフィルムの除去、細胞の可溶化、溶解、DNAのせん断など、ハイスループットサンプル調製におけるマルチウェルプレート超音波処理装置の利点。

マルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPは、ミトコンドリア診断などにおけるハイスループットサンプル調製に数多くの利点をもたらします。

バイオマーカー診断におけるハイスループットサンプル調製用のマルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP。

超音波によるmtDNA断片化の手順例

準備と摘出：

C57BL/6マウスを頸椎脱臼により安楽死させました。
肝臓を速やかに摘出し、氷冷した滅菌PBSで洗浄しました。

ミトコンドリアの単離：

2-mLのDounce組織グラインダーとMitochondria Isolation Kit for Tissueを用いてミトコンドリアを単離しました。
最初の遠心分離を700× gおよび3,000× gで行いました。
バッファーCでさらに二回の洗浄を行ってください。

DNAの単離：

700× gでの最初の遠心分離で得られたペレットを、核DNA（nDNA）の単離に使用しました。
スピンカラムを用いてDNAを単離しました。
単離したミトコンドリアからミトコンドリアDNA（mtDNA）を抽出しました。
核DNA（nDNA）は粗核抽出物から抽出しました。両方のDNAはいずれもマウス肝組織由来です。

DNAの断片化：

0.5-mmのマイクロチップソノトロードを備えた30-kHz/50-Wの超音波処理装置UP50Hを用い、氷上で14 μm、2 × 30秒の超音波処理によりDNAを断片化しました。

断片化の可視化と定量：

超音波処理後の断片化を、SYBR safe DNA染色剤を用いた1%アガロースゲルで可視化しました。
mtDNAとnDNAの相対量をqPCRで測定しました。

（参照：Mariero et al., 2019）

ハイスループットサンプル調製では、マルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPが、標準的な96ウェルプレート、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレートでの多数のサンプルの調製を容易にします。
UIP400MTPを使用したハイスループットサンプル調製の利点について、詳しくご覧ください！

この動画では、高強度超音波を用いてあらゆる標準的なマルチウェルプレートで確実な試料調製を可能にする超音波試料調製システムUIP400MTPを紹介します。UIP400MTPの代表的な用途には、細胞溶解、DNA・RNA・クロマチンのせん断、タンパク質抽出などがあります。

超音波処理を用いてミトコンドリアを最適に単離するためのヒント：

温度管理： すべての工程を0°C–4°Cの温度範囲で行ってください。これはミトコンドリアの完全性と機能を維持するために極めて重要です。
効率と速度： 迅速に作業し、ミトコンドリアの精製は、特定の用途に必要な範囲にとどめてください。過度な操作は、ミトコンドリア成分の大幅な損失につながる可能性があります。
懸濁液の希釈： 単離工程全体を通じて、細胞および細胞小器官の懸濁液を低濃度に保ってください。これにより、捕捉や凝集のリスクを最小限に抑え、単離したミトコンドリアの純度を向上させることができます。
サンプル量： 大規模な調製を一回行うよりも、小規模な調製を複数回行ってください。規模を拡大しても回収可能なミトコンドリア量は比例して増加しないため、この方法では通常、より高い収量が得られます。マルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPは、ミトコンドリア単離のための迅速で信頼性の高い細胞溶解と、ミトコンドリアからのタンパク質抽出を容易にします。

これらの指針により、超音波による溶解と遠心分離を用いる単離工程がより効率的になり、後続の用途に適した高品質のミトコンドリア調製物が得られます。

Hielscherの超音波処理装置 – ドイツ製の品質

Hielscherの超音波処理装置は、最高水準の品質と設計基準で広く知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業設備に円滑に組み込むことができます。Hielscherの超音波処理装置は、過酷な条件や厳しい環境にも容易に対応します。

Hielscher UltrasonicsはISO認証を取得した企業であり、最先端技術と使いやすさを備えた高性能超音波処理装置に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。

細胞の剥離、細胞溶解、DNA抽出、DNA断片化、細胞の可溶化、タンパク質精製用の96ウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP。

マイクロタイタープレートおよびマルチウェルプレートの超音波処理用の96ウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP

文献 / 参考資料

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.

ミトコンドリアとミトコンドリア診断に関するよくある質問

ミトコンドリアとは何ですか？

ミトコンドリアは、ほとんどの真核生物の細胞に存在する、膜で囲まれた細胞小器官です。細胞呼吸の過程を通じてアデノシン三リン酸（ATP）の形でエネルギーを産生するため、細胞の発電所として知られています。また、ミトコンドリアは独自のDNAを持ち、細胞周期や細胞死の制御を含む、その他の細胞内過程でも重要な役割を果たします。

mtDNAとゲノムDNAにはどのような違いがありますか？

ミトコンドリアDNA（mtDNA）は、ゲノムDNA（gDNA）といくつかの重要な点で異なります。mtDNAはミトコンドリア内に存在し、環状で、母系遺伝します。一方、gDNAは細胞核内に存在し、線状で、両親から受け継がれます。mtDNAははるかに小さく、わずか37個の遺伝子をコードするのに対し、gDNAは約20,000–25,000個の遺伝子を含みます。mtDNAは細胞あたり複数のコピーとして存在し、変異率が高く、主にミトコンドリア機能に関与するタンパク質をコードします。対照的に、gDNAは通常二倍体で、変異率が低く、生物の発生と機能に必要な非常に多くの遺伝子をコードします。また、mtDNAの転写と翻訳はミトコンドリア内で行われるのに対し、gDNAの転写は核内で、翻訳は細胞質で行われます。これらの違いは、それぞれの異なる役割と進化的起源を反映しています。

無細胞抽出液とは何ですか？

無細胞抽出液は、タンパク質、核酸、その他の細胞成分など、溶解した細胞の内容物を含む一方、完全な細胞膜は含まない溶液です。この抽出液は、生化学および分子生物学の研究で細胞内過程をin vitroで調べるために使用され、研究者が生きた細胞の外で反応や機構を解析できるようにします。

ミトコンドリア診断でPCR検査はどのような役割を果たしますか？

PCR検査は、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の変異、欠失、コピー数変異の検出を可能にすることで、ミトコンドリア診断において極めて重要な役割を果たします。特定のmtDNA領域を増幅し、ミトコンドリア疾患に関連する病原性バリアントを同定できます。定量PCR（qPCR）やロングレンジPCRなどのPCRに基づく技術は、mtDNAの完全性、ヘテロプラスミーのレベル、mtDNAの枯渇の評価にも使用され、ミトコンドリアの機能と疾患に関する重要な知見を提供します。
マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPがPCR検査やアッセイをどのように容易にするかをご覧ください！

分画遠心法とは何ですか？

分画遠心法は、細胞分画やミトコンドリアの単離に広く使用される技術です。この方法は、密度と形状の両方に依存する沈降係数に基づいて細胞構造を分離します。この工程では、特定の密度を持つ緩衝塩溶液中のサンプルに、さまざまな大きさの遠心力を加えます。沈降係数が似ている構造は同時に回収チューブの底に沈降するため、回収できます。

ミトコンドリアの単離に分画遠心法をどのように使用しますか？

分画遠心法により、研究者はミトコンドリア画分を他の細胞成分から効果的に分離できます。ミトコンドリアの単離には、数段階の遠心分離と、その後の単離物の回収が含まれます。
最初の遠心分離： 低い遠心力を加え、大きな細胞残渣と核を沈降させます。
後続の遠心分離： 遠心力を段階的に増加させ、ミトコンドリアに富む画分をペレットとして沈殿させます。各遠心分離工程で、沈降係数が次第に高くなる構造を除去します。
画分の回収： 各遠心分離の後にペレットを回収し、上清により高いgの遠心力を加えて次の画分を単離します。ミトコンドリアが目的の純度に達するまで、これを繰り返します。