ミトコンドリア診断のためのハイスループット試料調製
研究および臨床におけるミトコンドリア診断は、シークエンシング、PCR、生化学的アッセイなどの様々な技術を用いて行われる。これらの方法はDNAの変異を同定し、ミトコンドリアの機能を測定するために用いられる。シークエンシングは遺伝子変異の検出に役立ち、PCRは特定のDNA配列を定量することができる。生化学的アッセイはミトコンドリアのタンパク質や酵素の機能性を評価する。
ミトコンドリア病の診断は、これらの疾患の顕著な臨床的ばらつきのため、また、ミトコンドリアDNA（mtDNA）と核ゲノムという2つの異なる遺伝ゲノムの間の複雑な相互作用のため、特に困難である。
超音波によるDNA抽出と断片化
筋組織からのDNA抽出は、mtDNAの組織特異的変化が疑われる場合に特に有用である。これらの変化には、慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）におけるmtDNAの欠失、ミトコンドリアミオパチーにおけるmtDNAの点突然変異、アルパース症候群におけるmtDNAの枯渇などが含まれる。筋肉組織から抽出されたDNAは、欠失についてはサザンブロットやロングレンジPCR、欠失についてはリアルタイムPCR、点変異についてはシークエンシングなど、様々な遺伝子検査に使用することができる。
ミトコンドリア診断において、強力な超音波を用いたソニケーションはいくつかの用途に応用されている。ミトコンドリアやDNAのような細胞内内容物を抽出するために細胞を溶解したり、塩基配列決定のためにmtDNAやnDNAのようなDNAをせん断したり、サンプルをホモジナイズするために使用される。
UIP400MTP プレートソニケーター（ハイスループット試料調製用 マルチウェルおよび96ウェルプレート内のサンプルを均一に超音波処理
細胞や組織からミトコンドリアを分離する方法
ミトコンドリアの単離は、細胞を破砕して内容物を放出させるステップと、ミトコンドリア画分を分離・回収するための示差遠心分離のステップの2つからなる。
ソニケーション
Hielscher社のソニケーターは、標準的な溶解バッファーやキットと互換性があり、ミトコンドリアの分離に適している。超音波処理には主に2つの目的がある：
- 細胞溶解： 超音波が細胞膜を破壊し、細胞内の内容物を放出する。
- ミトコンドリアの破壊 続くステップの超音波処理によって、ミトコンドリアは破壊され、ミトコンドリアタンパク質やミトコンドリアDNAが放出される。
- mtDNAの断片化： 超音波処理は、塩基配列決定のためにミトコンドリアDNAをせん断する信頼性の高い技術である。
マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、ミトコンドリアサンプルのハイスループットなサンプル調製を可能にします。ディファレンシャル遠心分離と併用することで、超音波処理によるミトコンドリアの分離効率が向上し、様々なダウンストリームアプリケーションに適したインタクトなミトコンドリアを高収率で得ることができます。
Hielscher UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーター どの標準プレートにも対応
マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、ミトコンドリア診断などのハイスループット試料調製に多くの利点を提供します。
UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーター バイオマーカー診断におけるハイスループットなサンプル前処理に。
超音波によるmtDNA断片化の指示例
調製と抽出：
- C57BL/6マウスは頚椎脱臼により死亡させた。
- 肝臓をすばやく取り出し、氷冷した滅菌PBSで洗浄した。
ミトコンドリアの分離：
- ミトコンドリアは、2mL Dounce組織粉砕機とMitochondria Isolation Kit for Tissueを用いて単離した。
- 最初の遠心分離は700×gと3,000×gで行う。
- バッファーCでさらに2回の洗浄を行う。
DNAの分離：
- 700×gでの最初の遠心分離で得られたペレットを核DNA（nDNA）の単離に使用した。
- DNAはスピンカラムを用いて単離した。
- 単離したミトコンドリアからミトコンドリアDNA（mtDNA）を抽出した。
- 核DNA（nDNA）は、いずれもマウスの肝臓組織からの粗核抽出物から抽出した。
DNAの断片化：
- 30kHz/50Wの超音波ソニケーターUP50Hと0.5mmマイクロチップソノトロードを用い、14μmで2×30秒間、氷上でDNAを断片化した。
フラグメンテーションの可視化と定量化：
- 超音波処理後の断片化は、SYBR safe DNA色素を用いて1％アガロースゲルで可視化した。
- mtDNAとnDNAの相対量はqPCRで測定した。
(参照：Mariero et al.）
ハイスループットなサンプル調製のために、マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、標準的な96ウェル、マルチウェル、マイクロタイタープレートでの大量のサンプル調製を容易にします。
UIP400MTPを使用したハイスループット試料前処理の利点についてはこちらをご覧ください！
ソニケーションを用いた最適なミトコンドリア単離のコツ：
- 温度管理： すべての工程を0℃～4℃の温度範囲で行う。これはミトコンドリアの完全性と機能性を維持するために重要である。
- 効率とスピード： 迅速に作業し、特定の用途に必要な範囲でのみミトコンドリアを精製する。過度の操作は、ミトコンドリア含有量の著しい損失につながる可能性がある。
- 懸濁液の希釈： 分離プロセス中、細胞およびオルガネラ懸濁液の濃度を低く保つ。これにより、捕捉や凝集のリスクを最小限に抑え、単離されたミトコンドリアの純度を向上させることができる。
- サンプル量： 大規模な調製を1回行うよりも、小規模な調製を複数回行うことを選択する。このアプローチでは、スケールアップしても回収可能なミトコンドリアの量は比例して増加しないため、一般的に収率が向上します。マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPは、ミトコンドリア単離のための迅速で信頼性の高い細胞溶解と、ミトコンドリアからのタンパク質抽出を容易にします。
これらのガイドラインにより、超音波溶解と遠心分離を用いた単離プロセスがより効率的になり、下流のアプリケーションに適した高品質のミトコンドリア調製物が得られるようになる。
ソニケーター – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波装置は容易に対応できます。
Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
マイクロタイターおよびマルチウェルプレートの超音波処理用96ウェルプレートソニケーター UIP400MTP
文献・参考文献
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
ミトコンドリアとミトコンドリア診断に関するよくある質問
ミトコンドリアとは何か？
ミトコンドリアは、ほとんどの真核生物の細胞内に存在する膜結合小器官である。細胞呼吸のプロセスを通じてアデノシン三リン酸（ATP）の形でエネルギーを生産することから、細胞の発電所として知られている。さらに、ミトコンドリアは独自のDNAを持ち、細胞周期の調節や細胞死など、他の細胞プロセスにおいても重要な役割を果たしている。
mtDNAとゲノムDNAの違いは何ですか？
ミトコンドリアDNA（mtDNA）はゲノムDNA（gDNA）といくつかの重要な点で異なる。MtDNAはミトコンドリア内にあり、円形で、母方から遺伝するのに対し、gDNAは細胞核内にあり、直鎖状で、両親から遺伝する。MtDNAははるかに小さく、37個の遺伝子しかコードしていないが、gDNAには約20,000-25,000個の遺伝子が含まれている。MtDNAは細胞あたり複数コピー存在し、突然変異率が高く、主にミトコンドリア機能に関与するタンパク質をコードしている。対照的に、gDNAは通常2倍体であり、変異率が低く、生物の発生と機能に必要な膨大な遺伝子をコードしている。さらに、mtDNAの転写と翻訳はミトコンドリア内で起こるのに対し、gDNAの転写は核内で、翻訳は細胞質で起こる。これらの違いは、それぞれの役割と進化の起源を反映している。
無細胞抽出物とは何ですか？
無細胞抽出液とは、タンパク質、核酸、その他の細胞成分を含む、溶解した細胞の内容物を含む溶液であるが、無傷の細胞膜は含まれていない。この抽出液は、生化学や分子生物学の研究において、試験管内での細胞プロセスを研究するために使用され、研究者は生きた細胞の外での反応やメカニズムを分析することができる。
ミトコンドリア診断におけるPCR検査の役割とは？
PCR検査はミトコンドリアDNA（mtDNA）の突然変異、欠失、コピー数の変異を検出することにより、ミトコンドリア診断において重要な役割を果たしている。ミトコンドリア障害に関連する病原性変異体を同定するために、特定のミトコンドリアDNA領域の増幅を可能にする。定量的PCR（qPCR）や長距離PCRのようなPCRベースの技術もまた、ミトコンドリア機能および疾患に関する本質的な洞察を提供する、mtDNAの完全性、ヘテロプラスミーレベル、およびmtDNAの枯渇を評価するために使用される。
UIP400MTPマイクロプレートソニケーターがPCRテストとアッセイをどのように促進するかをご覧ください！
差動遠心分離とは？
示差遠心法は、細胞分画やミトコンドリアの分離に広く用いられている技術である。この方法は、密度と形状の両方に依存する沈降係数に基づいて細胞構造を分離する。このプロセスでは、特定の密度を持つ緩衝塩溶液中のサンプルに、様々なレベルの遠心力を加える。同じような沈降係数を持つ構造体は、同時に収集管の底に沈降し、回収が可能になる。
ミトコンドリアの分離に差動遠心分離はどのように用いられるのか？
差動遠心分離により、研究者はミトコンドリア画分を他の細胞成分から効率的に分離することができる。ミトコンドリアの分離には、いくつかの遠心分離ステップとそれに続く分離物の回収が必要である。
最初の遠心分離： 大きな細胞の残骸や核を沈殿させるために、低い遠心力をかける。
その後の遠心分離： 遠心力を段階的に増加させ、ミトコンドリアを豊富に含む画分をペレット化する。各遠心ステップで、沈降係数が徐々に高くなる構造を除去する。
フラクションの回収： 各遠心分離の後、ペレットを回収し、上清により高いg力をかけて次の画分を分離する。所望の純度のミトコンドリアが得られるまでこれを繰り返す。