Fermentazione assistita da ultrasuoni per la produzione di bioetanolo

La fermentazione assistita da ultrasuoni può migliorare la produzione di bioetanolo favorendo la scomposizione dei carboidrati complessi in zuccheri più semplici, rendendoli più facilmente disponibili per la conversione in etanolo da parte dei lieviti. Allo stesso tempo, la sonicazione migliora anche la permeabilità della parete cellulare dei lieviti, consentendo un rilascio più rapido dell’etanolo e un aumento della produzione complessiva. La fermentazione del bioetanolo assistita da ultrasuoni permette quindi di ottenere tassi di conversione più elevati e rese migliori.

Fermentazione

La fermentazione può essere un processo aerobico (= fermentazione ossidativa) o anaerobico, utilizzato nelle applicazioni biotecnologiche per convertire materiale organico mediante colture cellulari batteriche, fungine o di altri organismi, oppure mediante enzimi. Attraverso la fermentazione si ricava energia dall’ossidazione di composti organici, ad esempio i carboidrati.
Lo zucchero è il substrato più comune della fermentazione, che dà origine a prodotti quali acido lattico, lattosio, etanolo e idrogeno. Nella fermentazione alcolica si produce etanolo – soprattutto per l’impiego come combustibile, ma anche per le bevande alcoliche. Quando determinati ceppi di lievito, come Saccharomyces cerevisiae metabolizzano lo zucchero, le cellule di lievito convertono il materiale di partenza in etanolo e anidride carbonica.

Le equazioni chimiche riportate di seguito riassumono la conversione:

Se il materiale di partenza è amido, ad esempio proveniente dal mais, occorre innanzitutto convertire l’amido in zucchero. Per il bioetanolo utilizzato come combustibile, la conversione dell’amido richiede l’idrolisi. In genere, l’idrolisi viene accelerata mediante un trattamento acido o enzimatico, oppure mediante una combinazione di entrambi. Normalmente, la fermentazione viene effettuata a circa 35–40 °C.
Panoramica dei diversi processi di fermentazione:

Alimenti:

• produzione & conservazione
• prodotti lattiero-caseari (fermentazione lattica), ad esempio yogurt, latticello, kefir
• vegetali sottoposti a fermentazione lattica, ad esempio kimchi, miso, natto, tsukemono, crauti
• sviluppo di composti aromatici, ad esempio nella salsa di soia
• decomposizione delle sostanze tanniche, ad esempio in tè, cacao, caffè, tabacco
• bevande alcoliche, ad esempio birra, vino, whisky

Farmaci:

• produzione di composti medicinali, ad esempio insulina, acido ialuronico

Biogas/Etanolo:

• miglioramento della produzione di biogas/bioetanolo

Diversi lavori di ricerca e prove su scala da banco e pilota hanno dimostrato che gli ultrasuoni migliorano il processo di fermentazione rendendo disponibile una maggiore quantità di biomassa per la fermentazione enzimatica. Nella sezione seguente vengono approfonditi gli effetti degli ultrasuoni in un liquido.

Effetti del trattamento dei liquidi con ultrasuoni

Gli ultrasuoni ad alta potenza/bassa frequenza consentono di generare ampiezze elevate. Possono quindi essere utilizzati per il trattamento dei liquidi, ad esempio per miscelazione, emulsionamento, dispersione e deagglomerazione, oppure macinazione.
Durante la sonicazione dei liquidi ad alta intensità, le onde sonore che si propagano nel mezzo liquido producono cicli alternati di alta pressione (compressione) e bassa pressione (rarefazione), con una frequenza di ripetizione dipendente dalla frequenza degli ultrasuoni. Durante il ciclo di bassa pressione, le onde ultrasoniche ad alta intensità creano piccole bolle di vuoto o cavità nel liquido. Quando le bolle raggiungono un volume tale da non poter più assorbire energia, collassano violentemente durante un ciclo di alta pressione. Questo fenomeno è chiamato cavitazione. Cavitazione, ossia «la formazione, la crescita e il collasso implosivo di bolle in un liquido. Il collasso cavitazionale produce un intenso riscaldamento locale (~5000 K), pressioni elevate (~1000 atm) ed enormi velocità di riscaldamento e raffreddamento (>109 K/sec)» e getti di liquido (~400 km/h). (Suslick 1998)

Esistono diversi modi per generare cavitazione, ad esempio mediante ugelli ad alta pressione, miscelatori rotore-statore o processori a ultrasuoni. In tutti questi sistemi, l’energia immessa viene trasformata in attrito, turbolenze, onde e cavitazione. La frazione dell’energia immessa che viene trasformata in cavitazione dipende da diversi fattori che descrivono il movimento dell’apparecchiatura che genera cavitazione nel liquido. L’intensità dell’accelerazione è uno dei fattori più importanti che influenzano la trasformazione efficiente dell’energia in cavitazione. Un’accelerazione maggiore crea differenze di pressione più elevate. Questo, a sua volta, aumenta la probabilità che si formino bolle di vuoto anziché onde che si propagano nel liquido. Pertanto, maggiore è l’accelerazione, maggiore è la frazione di energia trasformata in cavitazione.
Nel caso di un trasduttore a ultrasuoni, l’ampiezza dell’oscillazione descrive l’intensità dell’accelerazione. Ampiezze maggiori consentono una generazione più efficace della cavitazione. Oltre all’intensità, il liquido dovrebbe essere accelerato in modo da ridurre al minimo le perdite dovute a turbolenze, attrito e generazione di onde. A tal fine, la soluzione ottimale è una direzione di movimento unilaterale. Modificando l’intensità e i parametri del processo di sonicazione, l’azione degli ultrasuoni può essere molto intensa o molto delicata. Questo rende gli ultrasuoni uno strumento estremamente versatile per diverse applicazioni.

Le applicazioni delicate, che utilizzano una sonicazione lieve in condizioni blande, comprendono il degasaggio, emulsionamento e l’attivazione degli enzimi. Le applicazioni intensive con ultrasuoni ad alta intensità/alta potenza (perlopiù a pressione elevata) comprendono la macinazione a umido, deagglomerazione e la riduzione delle dimensioni delle particelle, e la dispersione. Per molte applicazioni, come l’ estrazione, la disgregazione o la sonochimica, l’intensità ultrasonica richiesta dipende dal materiale specifico da sottoporre a sonicazione. Grazie alla varietà dei parametri, adattabili al singolo processo, gli ultrasuoni consentono di individuare le condizioni ottimali per ogni processo.
Oltre a un’eccellente conversione della potenza, la sonicazione offre il grande vantaggio del controllo completo sui parametri più importanti: ampiezza, pressione, temperatura, viscosità e concentrazione. Questo permette di regolare tutti questi parametri con l’obiettivo di individuare i parametri di trattamento ideali per ciascun materiale specifico. Ne derivano una maggiore efficacia e un’efficienza ottimizzata.

Ultrasuoni per migliorare i processi di fermentazione: l’esempio della produzione di bioetanolo

Il bioetanolo è un prodotto della decomposizione della biomassa o della materia biodegradabile presente nei rifiuti da parte di batteri anaerobici o aerobici. L’etanolo prodotto viene utilizzato principalmente come biocombustibile. Questo rende il bioetanolo un’alternativa rinnovabile e rispettosa dell’ambiente ai combustibili fossili, come il gas naturale.
Per produrre etanolo dalla biomassa si possono utilizzare zucchero, amido e materiale lignocellulosico come materie prime. Nella produzione su scala industriale, zucchero e amido sono attualmente predominanti perché economicamente vantaggiosi.
Il modo in cui gli ultrasuoni migliorano un processo specifico del cliente, con una determinata materia prima e in determinate condizioni, può essere verificato molto semplicemente mediante prove di fattibilità. Come primo passo, la sonicazione di una piccola quantità della sospensione della materia prima con un dispositivo a ultrasuoni da laboratorio mostrerà se gli ultrasuoni hanno un effetto sulla materia prima.

Prove di fattibilità

Nella prima fase di prova è opportuno introdurre una quantità relativamente elevata di energia ultrasonica in un piccolo volume di liquido, poiché questo aumenta la probabilità di verificare se sia possibile ottenere risultati. Un piccolo volume di campione riduce anche il tempo di utilizzo del dispositivo da laboratorio e i costi delle prime prove.
Le onde ultrasoniche vengono trasmesse dalla superficie del sonotrodo al liquido. Immediatamente sotto la superficie del sonotrodo, l’intensità ultrasonica è massima. Sono quindi preferibili distanze brevi tra il sonotrodo e il materiale sottoposto a sonicazione. Quando si tratta un piccolo volume di liquido, la distanza dal sonotrodo può essere mantenuta ridotta.
La tabella seguente mostra i livelli tipici di energia/volume per i processi di sonicazione dopo l’ottimizzazione. Poiché le prime prove non verranno eseguite nella configurazione ottimale, un’intensità e un tempo di sonicazione da 10 a 50 volte superiori al valore tipico mostreranno se vi sia o meno un effetto sul materiale sottoposto a sonicazione.

Processo	Energia/ Volume	Volume del campione	Potenza	Tempo
Semplice	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Medio	da 100Ws/mL a 500Ws/mL	10mL	50W	da 20 a 100 sec
Intensivo	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Tabella 1 – Valori tipici di sonicazione dopo l’ottimizzazione del processo

La potenza effettivamente immessa durante le prove può essere registrata mediante la registrazione dati integrata (UP200Ht e UP200St), un’interfaccia PC o un misuratore di potenza. In combinazione con i dati registrati relativi all’impostazione dell’ampiezza e alla temperatura, è possibile valutare i risultati di ogni prova e stabilire un valore di riferimento per l’energia/volume.
Se durante le prove è stata scelta una configurazione ottimale, le sue prestazioni possono essere verificate durante una fase di ottimizzazione e infine trasferite su scala commerciale. Per facilitare l’ottimizzazione, si raccomanda vivamente di esaminare anche i limiti della sonicazione, ad esempio temperatura, ampiezza o energia/volume, per le formulazioni specifiche. Poiché gli ultrasuoni possono generare effetti negativi su cellule, sostanze chimiche o particelle, è necessario esaminare i livelli critici di ciascun parametro per limitare la successiva ottimizzazione all’intervallo di parametri in cui non si osservano effetti negativi. Per lo studio di fattibilità si raccomandano piccole unità da laboratorio o da banco, in modo da contenere le spese per apparecchiature e campioni durante tali prove. In generale, le unità da 100 a 1.000 watt soddisfano molto bene le esigenze dello studio di fattibilità. (cfr. Hielscher 2005)

Ottimizzazione

I risultati ottenuti durante gli studi di fattibilità possono evidenziare un consumo energetico piuttosto elevato rispetto al piccolo volume trattato. Tuttavia, lo scopo della prova di fattibilità è principalmente quello di mostrare gli effetti degli ultrasuoni sul materiale. Se nelle prove di fattibilità si sono verificati effetti positivi, occorre compiere ulteriori sforzi per ottimizzare il rapporto energia/volume. Questo significa esplorare la configurazione ideale dei parametri ultrasonici per ottenere la resa più elevata utilizzando la minore quantità possibile di energia, così da rendere il processo il più conveniente ed efficiente possibile dal punto di vista economico. Per individuare la configurazione ottimale dei parametri – ottenendo i benefici desiderati con un apporto energetico minimo – occorre studiare la correlazione tra i parametri più importanti: ampiezza, pressione, temperatura e composizione del liquido . In questa seconda fase si raccomanda di passare dalla sonicazione in batch a una configurazione di sonicazione continua con un reattore a cella di flusso, poiché nella sonicazione in batch non è possibile intervenire sull’importante parametro della pressione. Durante la sonicazione in batch, la pressione è limitata alla pressione ambiente. Se il processo di sonicazione avviene in una camera di una cella di flusso pressurizzabile, la pressione può essere aumentata (o ridotta), influenzando generalmente in modo drastico la cavitazione ultrasonica. Utilizzando una cella di flusso è possibile determinare la correlazione tra pressione ed efficienza del processo. I processori a ultrasuoni con una potenza compresa tra 500 watt e 2000 watt sono i più adatti per ottimizzare un processo.

Passaggio alla produzione su scala commerciale

Una volta individuata la configurazione ottimale, il successivo aumento di scala è semplice, poiché i processi a ultrasuoni sono completamente riproducibili con un aumento di scala lineare. Questo significa che, quando gli ultrasuoni vengono applicati a una formulazione liquida identica con una configurazione identica dei parametri di trattamento, è necessaria la stessa energia per volume per ottenere un risultato identico, indipendentemente dalla scala del trattamento. (Hielscher 2005). Questo permette di applicare la configurazione ottimale dei parametri ultrasonici alla produzione su scala industriale. In pratica, il volume che può essere trattato con ultrasuoni è illimitato. Sono disponibili sistemi a ultrasuoni commerciali con potenze fino a 16.000 watt per unità, che possono essere installati in gruppi. Questi gruppi di processori a ultrasuoni possono essere installati in parallelo o in serie. Con l’installazione in gruppi di processori a ultrasuoni ad alta potenza, la potenza totale è pressoché illimitata, permettendo di trattare senza problemi flussi volumetrici elevati. Anche quando è necessario adattare il sistema a ultrasuoni, ad esempio per adeguare i parametri a una formulazione liquida modificata, questo può essere fatto nella maggior parte dei casi sostituendo il sonotrodo, il booster o la cella di flusso. La scalabilità lineare, la riproducibilità e l’adattabilità degli ultrasuoni rendono questa tecnologia innovativa efficiente ed economicamente conveniente.

Parametri del trattamento con ultrasuoni

Il trattamento dei liquidi con ultrasuoni è descritto da una serie di parametri. I più importanti sono ampiezza, pressione, temperatura, viscosità e concentrazione. Per una determinata configurazione dei parametri, il risultato del processo, ad esempio la dimensione delle particelle, è una funzione dell’energia per volume trattato. La funzione cambia al variare dei singoli parametri. Inoltre, la potenza effettivamente erogata per unità di superficie del sonotrodo di un’unità a ultrasuoni dipende dai parametri. La potenza erogata per unità di superficie del sonotrodo è l’intensità superficiale (I). L’intensità superficiale dipende dall’ampiezza (A), dalla pressione (p), dal volume del reattore (VR), dalla temperatura (T), dalla viscosità (η) e da altri parametri.

L’effetto della cavitazione generata dipende dall’intensità superficiale. Il risultato del processo è correlato allo stesso modo. La potenza totale erogata da un’unità a ultrasuoni è il prodotto dell’intensità superficiale (I) e dell’area superficiale (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Ampiezza

L’ampiezza dell’oscillazione descrive la distanza (ad esempio 50 µm) percorsa dalla superficie del sonotrodo in un dato intervallo di tempo (ad esempio 1/20.000s a 20kHz). Maggiore è l’ampiezza, maggiore è la velocità con cui la pressione diminuisce e aumenta a ogni movimento. Inoltre, aumenta il volume spostato a ogni movimento, determinando un volume di cavitazione maggiore (dimensione e/o numero delle bolle). Quando applicate alle dispersioni, ampiezze maggiori esercitano un’azione distruttiva più intensa sulle particelle solide. La Tabella 1 mostra valori generali per alcuni processi a ultrasuoni.

Pressione

Il punto di ebollizione di un liquido dipende dalla pressione. Maggiore è la pressione, maggiore è il punto di ebollizione, e viceversa. Una pressione elevata consente la cavitazione a temperature prossime o superiori al punto di ebollizione. Aumenta inoltre l’intensità dell’implosione, che è correlata alla differenza tra la pressione statica e la pressione di vapore all’interno della bolla (cfr. Vercet et al. 1999). Poiché la potenza e l’intensità ultrasoniche cambiano rapidamente al variare della pressione, è preferibile una pompa a pressione costante. Quando si alimenta una cella di flusso con il liquido, la pompa deve essere in grado di gestire la portata specifica del liquido a pressioni adeguate. Le pompe a diaframma o a membrana; le pompe a tubo flessibile, a tubo o a schiacciamento; le pompe peristaltiche; oppure le pompe a pistone o a stantuffo generano fluttuazioni alternate della pressione. Sono preferibili le pompe centrifughe, a ingranaggi, a spirale e a cavità progressiva, che alimentano il liquido da sottoporre a sonicazione a una pressione costantemente stabile. (Hielscher 2005)

Temperatura

Durante la sonicazione di un liquido, la potenza viene trasmessa al mezzo. Poiché l’oscillazione generata dagli ultrasuoni causa turbolenze e attrito, il liquido sottoposto a sonicazione – in conformità alla legge della termodinamica – si riscalda. Temperature elevate del mezzo trattato possono danneggiare il materiale e diminuire l’efficacia della cavitazione ultrasonica. Le innovative celle di flusso a ultrasuoni sono dotate di una camicia di raffreddamento (vedere la figura). Questo consente un controllo preciso della temperatura del materiale durante il trattamento con ultrasuoni. Per la sonicazione in becher di volumi più piccoli si raccomanda un bagno di ghiaccio per dissipare il calore.

Viscosità e concentrazione

La macinazione e la dispersione a ultrasuoni sono processi in fase liquida. Le particelle devono essere in sospensione, ad esempio in acqua, olio, solventi o resine. Utilizzando sistemi a ultrasuoni a flusso continuo, è possibile sottoporre a sonicazione materiali molto viscosi e pastosi.
Un processore a ultrasuoni ad alta potenza può operare con concentrazioni di solidi piuttosto elevate. Una concentrazione elevata garantisce l’efficacia del trattamento con ultrasuoni, poiché l’effetto di macinazione ultrasonica è causato dalle collisioni tra le particelle. Le ricerche hanno dimostrato che la velocità di frantumazione della silice è indipendente dalla concentrazione dei solidi fino al 50% in peso. Il trattamento di masterbatch con un’elevata concentrazione di materiale è una procedura produttiva comune che utilizza la sonicazione.

Potenza e intensità rispetto all’energia

L’intensità superficiale e la potenza totale descrivono soltanto l’intensità del trattamento. Per descrivere un processo di sonicazione in modo da renderlo scalabile e riproducibile, occorre considerare il volume del campione sottoposto a sonicazione e il tempo di esposizione a una determinata intensità. Per una data configurazione dei parametri, il risultato del processo, ad esempio la dimensione delle particelle o la conversione chimica, dipenderà dall’energia per volume (E/V).

Risultato = f (E /V )

Dove l’energia (E) è il prodotto della potenza erogata (P) e del tempo di esposizione (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Le modifiche alla configurazione dei parametri cambiano la funzione del risultato. Questo, a sua volta, modifica la quantità di energia (E) necessaria per un dato volume di campione (V) per ottenere un determinato valore del risultato. Per questo motivo, non è sufficiente applicare una certa potenza ultrasonica a un processo per ottenere un risultato. È necessario un approccio più approfondito per individuare la potenza richiesta e la configurazione dei parametri con cui tale potenza deve essere immessa nel materiale da trattare. (Hielscher 2005)

Produzione di bioetanolo assistita da ultrasuoni

È già noto che gli ultrasuoni migliorano la produzione di bioetanolo. Si raccomanda di addensare il liquido con la biomassa fino a ottenere una sospensione altamente viscosa ma ancora pompabile. I reattori a ultrasuoni possono gestire concentrazioni di solidi piuttosto elevate, consentendo di eseguire il processo di sonicazione con la massima efficienza. Quanto più materiale è contenuto nella sospensione, tanto minore sarà la quantità di liquido vettore trattato, che non trae beneficio dal processo di sonicazione. Poiché, secondo la legge della termodinamica, l’immissione di energia in un liquido ne provoca il riscaldamento, questo significa che l’energia ultrasonica viene applicata, per quanto possibile, al materiale bersaglio. Una progettazione del processo così efficiente evita di sprecare energia riscaldando il liquido vettore in eccesso.
Gli ultrasuoni favoriscono l’ estrazione del materiale intracellulare, rendendolo così disponibile per la fermentazione enzimatica. Un trattamento ultrasonico lieve può aumentare l’attività enzimatica, ma per l’estrazione della biomassa sono necessari ultrasuoni più intensi. Pertanto, gli enzimi devono essere aggiunti alla sospensione di biomassa dopo la sonicazione, poiché gli ultrasuoni intensi inattivano gli enzimi, un effetto indesiderato.

Risultati attuali ottenuti dalla ricerca scientifica:

Gli studi di Yoswathana et al. (2010) sulla produzione di bioetanolo dalla paglia di riso hanno dimostrato che la combinazione di pretrattamento acido e ultrasonico prima del trattamento enzimatico porta a una maggiore resa in zuccheri, fino al 44% (rispetto alla paglia di riso). Questo dimostra l’efficacia della combinazione di pretrattamento fisico e chimico prima dell’idrolisi enzimatica del materiale lignocellulosico in zuccheri. 

Il Grafico 2 illustra graficamente gli effetti positivi dell’irradiazione ultrasonica durante la produzione di bioetanolo dalla paglia di riso. (È stato utilizzato carbone vegetale per detossificare i campioni sottoposti a pretrattamento acido/enzimatico e a pretrattamento ultrasonico.)

In un altro studio recente è stata esaminata l’influenza della sonicazione sui livelli extracellulari e intracellulari dell’enzima β-galattosidasi. Sulaiman et al. (2011) sono riusciti a migliorare sostanzialmente la produttività della produzione di bioetanolo utilizzando ultrasuoni a temperatura controllata per stimolare la crescita del lievito Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Gli autori dell’articolo concludono che la sonicazione intermittente con ultrasuoni di potenza (20 kHz), con cicli di lavoro ≤20%, ha stimolato la produzione di biomassa, il metabolismo del lattosio e la produzione di etanolo in K. marxianus a un’intensità di sonicazione relativamente elevata di 11,8Wcm². Nelle condizioni migliori, la sonicazione ha aumentato la concentrazione finale di etanolo di quasi 3,5 volte rispetto al controllo. Questo corrispondeva a un aumento di 3,5 volte della produttività dell’etanolo, ma richiedeva un apporto aggiuntivo di potenza di 952W per metro cubo di brodo mediante sonicazione. Questo fabbisogno energetico aggiuntivo rientrava certamente nei normali limiti operativi accettabili per i bioreattori e, per i prodotti di alto valore, poteva essere facilmente compensato dall’aumento della produttività.

Conclusione: vantaggi della fermentazione assistita da ultrasuoni

Il trattamento con ultrasuoni si è dimostrato una tecnica efficiente e innovativa per aumentare la resa in bioetanolo. Gli ultrasuoni vengono utilizzati principalmente per estrarre materiale intracellulare dalla biomassa, ad esempio mais, soia, paglia, materiale lignocellulosico o scarti vegetali.

• Aumento della resa in bioetanolo
• Disgregazione/distruzione cellulare e rilascio di materiale intracellulare
• Miglioramento della decomposizione anaerobica
• Attivazione degli enzimi mediante sonicazione lieve
• Miglioramento dell’efficienza del processo mediante sospensioni ad alta concentrazione

La semplicità delle prove, l’aumento di scala riproducibile e la facilità di installazione (anche nei flussi produttivi già esistenti) rendono gli ultrasuoni una tecnologia redditizia ed efficiente. Sono disponibili processori industriali a ultrasuoni affidabili per il trattamento su scala commerciale, che permettono di sottoporre a sonicazione volumi di liquido praticamente illimitati.