Preparazione dei campioni ad alta produttività per la diagnostica mitocondriale
La diagnostica mitocondriale nella ricerca e nelle cliniche viene eseguita con varie tecniche, come il sequenziamento, la PCR e i test biochimici. Questi metodi sono utilizzati per identificare le mutazioni del DNA e misurare la funzione mitocondriale. Il sequenziamento aiuta a rilevare le mutazioni genetiche, mentre la PCR può quantificare specifiche sequenze di DNA. I test biochimici valutano la funzionalità delle proteine e degli enzimi mitocondriali.
La diagnosi delle malattie mitocondriali è particolarmente difficile a causa della marcata variabilità clinica di queste malattie e della complessa interazione tra due genomi ereditati in modo diverso: il DNA mitocondriale (mtDNA) e il genoma nucleare.
Estrazione e frammentazione del DNA mediante sonicazione
L'estrazione del DNA dal tessuto muscolare è particolarmente utile quando si sospettano alterazioni del mtDNA specifiche del tessuto. Queste alterazioni possono includere delezioni del mtDNA nell'oftalmoplegia esterna cronica progressiva (CPEO), mutazioni puntiformi del mtDNA nelle miopatie mitocondriali o deplezione del mtDNA nella sindrome di Alpers. Il DNA estratto dal tessuto muscolare può essere utilizzato per vari test genetici, come il Southern blot e la PCR a lungo raggio per le delezioni, la PCR in tempo reale per la deplezione o il sequenziamento per le mutazioni puntiformi.
La sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche intense, viene applicata per diverse applicazioni nella diagnostica mitocondriale. Viene utilizzata per lisciviare le cellule ed estrarre i contenuti intracellulari come i mitocondri e il DNA, per tagliare il DNA come il mtDNA e l'nDNA per il sequenziamento e per omogeneizzare i campioni.
Sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione di campioni ad alta produttività sonicazione uniforme dei campioni in piastre a più pozzetti e a 96 pozzetti
Come isolare i mitocondri da cellule e tessuti
L'isolamento mitocondriale comprende due fasi essenziali: la rottura delle cellule per liberarne il contenuto e la centrifugazione differenziale per separare e recuperare le frazioni mitocondriali.
Sonicazione
I sonicatori Hielscher sono compatibili con i tamponi di lisi e i kit standard, il che li rende adatti all'isolamento dei mitocondri. La sonicazione ha due scopi principali:
- Lisi cellulare: Le onde ultrasoniche rompono le membrane cellulari, liberando il contenuto intracellulare.
- Interruzione mitocondriale: La sonicazione in una fase successiva può rompere i mitocondri per rilasciare proteine mitocondriali o DNA mitocondriale.
- Frammentazione del mtDNA: La sonicazione è una tecnica affidabile per tagliare il DNA mitocondriale per il sequenziamento.
Il sonicatore per piastre a pozzetti multipli UIP400MTP consente la preparazione di campioni mitocondriali ad alta produttività. Insieme alla centrifugazione differenziale, la sonicazione migliora l'efficienza dell'isolamento mitocondriale, garantendo un'elevata resa di mitocondri intatti adatti a varie applicazioni a valle.
Hielscher UIP400MTP sonicatore per piastre multipozzetto funziona con qualsiasi piastra standard
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre numerosi vantaggi per la preparazione di campioni ad alta produttività, ad esempio nella diagnostica mitocondriale.
UIP400MTP Sonicatore per piastre multipozzetto per la preparazione di campioni ad alta produttività nella diagnostica dei biomarcatori.
Istruzioni esemplari per la frammentazione del mtDNA a ultrasuoni
Preparazione ed estrazione:
- I topi C57BL/6 sono stati uccisi mediante dislocazione cervicale.
- I fegati sono stati rapidamente estratti e lavati in PBS sterile ghiacciato.
Isolamento dei mitocondri:
- I mitocondri sono stati isolati utilizzando un macinatore di tessuti Dounce da 2 ml e un kit di isolamento dei mitocondri per tessuti.
- Centrifugazione iniziale a 700×g e 3.000×g.
- Eseguire altre due fasi di lavaggio con il tampone C.
Isolamento del DNA:
- Il pellet della prima centrifugazione a 700×g è stato utilizzato per isolare il DNA nucleare (nDNA).
- Il DNA è stato isolato utilizzando colonne di spin.
- Il DNA mitocondriale (mtDNA) è stato estratto dai mitocondri isolati.
- Il DNA nucleare (nDNA) è stato estratto da estratti nucleari grezzi, entrambi provenienti da tessuto epatico di topo.
Frammentazione del DNA:
- Il DNA è stato frammentato in ghiaccio utilizzando un sonicatore a ultrasuoni UP50H a 30 kHz/50 W con un sonotrodo a micropunte da 0,5 mm a 14 μm per 2 × 30 secondi.
Visualizzazione e quantificazione della frammentazione:
- La frammentazione dopo l'ultrasonificazione è stata visualizzata su un gel di agarosio all'1% con il colorante SYBR safe DNA.
- L'abbondanza relativa di mtDNA e nDNA è stata determinata mediante qPCR.
(cfr. Mariero et al., 2019)
Per la preparazione di campioni ad alta produttività, il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita la preparazione di un gran numero di campioni in piastre standard a 96 pozzetti, multipozzetto e microtitolazione.
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Suggerimenti per un isolamento ottimale dei mitocondri mediante sonicazione:
- Controllo della temperatura: Eseguire tutte le fasi a una temperatura compresa tra 0°C e 4°C. Questo è fondamentale per mantenere l'integrità e la funzionalità dei mitocondri.
- Efficienza e velocità: Lavorare rapidamente e purificare i mitocondri solo nella misura necessaria per l'applicazione specifica. Una manipolazione eccessiva può portare a perdite significative del contenuto mitocondriale.
- Diluizione delle sospensioni: Mantenere basse concentrazioni di sospensioni di cellule e organelli durante tutto il processo di isolamento. Ciò consente di ridurre al minimo i rischi di intrappolamento e agglutinazione, migliorando così la purezza dei mitocondri isolati.
- Volume del campione: Optare per più preparazioni su piccola scala piuttosto che per un'unica grande preparazione. Questo approccio consente di ottenere rendimenti migliori, poiché l'aumento della scala non aumenta proporzionalmente la quantità di mitocondri recuperabili. Il sonicatore per piastre a più pozzetti UIP400MTP facilita la lisi rapida e affidabile delle cellule per l'isolamento dei mitocondri e l'estrazione di proteine dai mitocondri.
Queste linee guida renderanno più efficiente il processo di isolamento mediante lisi ad ultrasuoni e centrifugazione, ottenendo preparati mitocondriali di alta qualità adatti alle applicazioni a valle.
Sonicatori Hielscher – Qualità Made in Germany
Gli ultrasuoni Hielscher sono noti per i loro elevati standard di qualità e design. La robustezza e la facilità d'uso consentono un'agevole integrazione dei nostri ultrasuoni negli impianti industriali. Gli ultrasuonatori Hielscher sono in grado di gestire facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.
Hielscher Ultrasonics è un'azienda certificata ISO e pone particolare enfasi sugli ultrasuonatori ad alte prestazioni, caratterizzati da tecnologia all'avanguardia e facilità d'uso. Naturalmente, gli ultrasuoni Hielscher sono conformi alla normativa CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoH.
Sonicatore per piastre da 96 pozzetti UIP400MTP per la sonicazione di piastre da microtitolazione e multipozzetto
Letteratura / Riferimenti
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Domande frequenti sui mitocondri e sulla diagnostica mitocondriale
Cosa sono i mitocondri?
I mitocondri sono organelli legati alla membrana presenti nelle cellule della maggior parte degli organismi eucarioti. Sono noti come le centrali elettriche della cellula perché producono energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) attraverso il processo di respirazione cellulare. Inoltre, i mitocondri hanno un proprio DNA e svolgono ruoli chiave in altri processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare e la morte cellulare.
Cosa differenzia il mtDNA dal DNA genomico?
Il DNA mitocondriale (mtDNA) si differenzia dal DNA genomico (gDNA) per diversi aspetti fondamentali. L'MtDNA si trova nei mitocondri, è circolare e viene ereditato dalla madre, mentre il gDNA si trova nel nucleo della cellula, è lineare e viene ereditato da entrambi i genitori. L'MtDNA è molto più piccolo e codifica solo 37 geni, mentre il gDNA contiene circa 20.000-25.000 geni. L'MtDNA è presente in più copie per cellula, ha un tasso di mutazione più elevato e codifica principalmente per proteine coinvolte nella funzione mitocondriale. Il gDNA, invece, è tipicamente diploide, ha un tasso di mutazione inferiore e codifica una vasta gamma di geni necessari per lo sviluppo e la funzione dell'organismo. Inoltre, la trascrizione e la traduzione del mtDNA avvengono all'interno dei mitocondri, mentre la trascrizione del gDNA avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma. Queste differenze riflettono i loro ruoli distinti e le loro origini evolutive.
Che cos'è l'Estratto senza cellule?
Un estratto senza cellule è una soluzione che contiene il contenuto di cellule lisate, comprese proteine, acidi nucleici e altri componenti cellulari, ma senza membrane cellulari intatte. Questo estratto viene utilizzato nella ricerca biochimica e di biologia molecolare per studiare i processi cellulari in vitro, consentendo ai ricercatori di analizzare reazioni e meccanismi al di fuori delle cellule viventi.
Che ruolo hanno i test PCR nella diagnostica mitocondriale?
I test PCR svolgono un ruolo fondamentale nella diagnostica mitocondriale consentendo di rilevare mutazioni, delezioni o variazioni del numero di copie nel DNA mitocondriale (mtDNA). Consentono l'amplificazione di specifiche regioni di mtDNA per identificare le varianti patogene associate ai disturbi mitocondriali. Le tecniche basate sulla PCR, come la PCR quantitativa (qPCR) e la PCR a lungo raggio, sono utilizzate anche per valutare l'integrità del mtDNA, i livelli di eteroplasmia e la deplezione del mtDNA, fornendo approfondimenti essenziali sulla funzione mitocondriale e sulle malattie.
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Che cos'è la centrifugazione differenziale?
La centrifugazione differenziale è una tecnica ampiamente utilizzata per il frazionamento delle cellule e l'isolamento dei mitocondri. Questo metodo separa le strutture cellulari in base al loro coefficiente di sedimentazione, che dipende dalla densità e dalla forma. Il processo prevede l'applicazione di diversi livelli di forza centrifuga ai campioni in soluzioni saline tamponate con densità specifiche. Le strutture con coefficienti di sedimentazione simili si depositano contemporaneamente sul fondo della provetta di raccolta, consentendo il loro recupero.
Come si usa la centrifugazione differenziale per l'isolamento dei mitocondri?
La centrifugazione differenziale consente ai ricercatori di separare efficacemente le frazioni mitocondriali dagli altri componenti cellulari. L'isolamento dei mitocondri comporta diverse fasi di centrifugazione e il successivo recupero dell'isolato.
Centrifugazione iniziale: Applicare una bassa forza centrifuga per sedimentare i detriti cellulari e i nuclei di grandi dimensioni.
Centrifugazioni successive: Aumentare la forza centrifuga in modo graduale per ottenere frazioni arricchite di mitocondri. Ogni fase di centrifugazione rimuove le strutture con coefficienti di sedimentazione progressivamente più elevati.
Recupero della frazione: Dopo ogni centrifugazione, il pellet viene raccolto e il surnatante viene sottoposto a forze g più elevate per isolare la frazione successiva. Questa operazione viene ripetuta fino a raggiungere la purezza desiderata dei mitocondri.