Preparazione dei campioni ad alta capacità di trattamento per la diagnostica mitocondriale
La diagnostica mitocondriale nella ricerca e in ambito clinico viene eseguita utilizzando varie tecniche, quali il sequenziamento, la PCR e i saggi biochimici. Questi metodi vengono utilizzati per identificare mutazioni del DNA e misurare la funzione mitocondriale. Il sequenziamento aiuta a rilevare le mutazioni genetiche, mentre la PCR può quantificare specifiche sequenze di DNA. I saggi biochimici valutano la funzionalità delle proteine e degli enzimi mitocondriali.
La diagnosi delle malattie mitocondriali è particolarmente difficile a causa della marcata variabilità clinica di queste malattie e della complessa interazione tra due genomi ereditati secondo modalità diverse: il DNA mitocondriale (mtDNA) e il genoma nucleare.
Estrazione e frammentazione del DNA mediante sonicazione
L’estrazione del DNA dal tessuto muscolare è particolarmente utile quando si sospettano alterazioni del mtDNA specifiche del tessuto. Queste alterazioni possono includere delezioni del mtDNA nell’oftalmoplegia esterna progressiva cronica (CPEO), mutazioni puntiformi del mtDNA nelle miopatie mitocondriali o deplezione del mtDNA nella sindrome di Alpers. Il DNA estratto dal tessuto muscolare può quindi essere utilizzato per vari test genetici, quali il Southern blot e la PCR a lungo raggio per le delezioni, la PCR in tempo reale per la deplezione o il sequenziamento per le mutazioni puntiformi.
La sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche intense, trova diverse applicazioni nella diagnostica mitocondriale. Viene utilizzata per lisare le cellule ed estrarne il contenuto intracellulare, come mitocondri e DNA, per frammentare mediante taglio il DNA, come mtDNA e nDNA, per il sequenziamento e per omogeneizzare i campioni.
Il sonicatore per piastre UIP400MTP per la preparazione dei campioni ad alta capacità di trattamento sonica uniformemente i campioni in piastre multipozzetto e a 96 pozzetti
Come isolare i mitocondri da cellule e tessuti
L’isolamento mitocondriale comprende due fasi essenziali: la disgregazione delle cellule per rilasciarne il contenuto e l’impiego della centrifugazione differenziale per separare e recuperare le frazioni mitocondriali.
Sonicazione
I sonicatori Hielscher sono compatibili con i tamponi e i kit di lisi standard, risultando quindi adatti all’isolamento dei mitocondri. La sonicazione ha due scopi principali:
- Lisi cellulare: Le onde ultrasoniche disgregano le membrane cellulari, rilasciando il contenuto intracellulare.
- Disgregazione mitocondriale: La sonicazione in una fase successiva può rompere i mitocondri per rilasciare le proteine mitocondriali o il DNA mitocondriale.
- Frammentazione del mtDNA: La sonicazione è una tecnica affidabile per frammentare mediante taglio il DNA mitocondriale per il sequenziamento.
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP consente la preparazione dei campioni mitocondriali con un’elevata capacità di trattamento dei campioni. In combinazione con la centrifugazione differenziale, la sonicazione migliora l’efficienza dell’isolamento mitocondriale, garantendo rese elevate di mitocondri intatti adatti a varie applicazioni successive.
Il sonicatore per piastre multipozzetto Hielscher UIP400MTP funziona con qualsiasi piastra standard
Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP offre numerosi vantaggi per la preparazione dei campioni ad alta capacità di trattamento, ad esempio nella diagnostica mitocondriale.
Sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP per la preparazione dei campioni ad alta capacità di trattamento nella diagnostica dei biomarcatori.
Esempio di istruzioni per la frammentazione del mtDNA mediante ultrasuoni
Preparazione ed estrazione:
- I topi C57BL/6 sono stati soppressi mediante dislocazione cervicale.
- I fegati sono stati estratti rapidamente e lavati in PBS sterile raffreddato in ghiaccio.
Isolamento dei mitocondri:
- I mitocondri sono stati isolati utilizzando un omogeneizzatore per tessuti Dounce da 2-mL e un Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Centrifugazione iniziale a 700× g e 3.000× g.
- Eseguire due ulteriori fasi di lavaggio con il tampone C.
Isolamento del DNA:
- Il pellet della prima centrifugazione a 700× g è stato utilizzato per isolare il DNA nucleare (nDNA).
- Il DNA è stato isolato utilizzando colonne per centrifugazione.
- Il DNA mitocondriale (mtDNA) è stato estratto dai mitocondri isolati.
- Il DNA nucleare (nDNA) è stato estratto da estratti nucleari grezzi; entrambi i tipi di DNA provenivano da tessuto epatico di topo.
Frammentazione del DNA:
- Il DNA è stato frammentato su ghiaccio utilizzando un sonicatore a ultrasuoni UP50H da 30-kHz/50-W con un sonotrodo a micropunta da 0,5-mm, a 14 μm per 2 × 30 secondi.
Visualizzazione e quantificazione della frammentazione:
- La frammentazione dopo la sonicazione è stata visualizzata su un gel di agarosio all’1% con il colorante per DNA SYBR safe.
- L’abbondanza relativa di mtDNA e nDNA è stata determinata mediante qPCR.
(cfr. Mariero et al., 2019)
Per la preparazione dei campioni ad alta capacità di trattamento, il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita la preparazione di un gran numero di campioni in piastre standard a 96 pozzetti, multipozzetto e per microtitolazione.
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Consigli per un isolamento ottimale dei mitocondri mediante sonicazione:
- Controllo della temperatura: Eseguire tutte le fasi a una temperatura compresa tra 0°C e 4°C. Questo è fondamentale per mantenere l’integrità e la funzionalità dei mitocondri.
- Efficienza e rapidità: Lavorare rapidamente e purificare i mitocondri solo nella misura richiesta dall’applicazione specifica. Una manipolazione eccessiva può causare perdite significative di contenuto mitocondriale.
- Diluizione delle sospensioni: Mantenere basse le concentrazioni delle sospensioni di cellule e organelli durante l’intero processo di isolamento. Questo contribuisce a ridurre al minimo i rischi di intrappolamento e agglutinazione, migliorando così la purezza dei mitocondri isolati.
- Volume del campione: Preferire più preparazioni su piccola scala a un’unica preparazione di grandi dimensioni. Questo approccio produce generalmente rese migliori, poiché l’aumento della scala non incrementa proporzionalmente la quantità di mitocondri recuperabili. Il sonicatore per piastre multipozzetto UIP400MTP facilita la lisi rapida e affidabile delle cellule per l’isolamento dei mitocondri, nonché l’estrazione delle proteine dai mitocondri.
Queste linee guida renderanno più efficiente il processo di isolamento mediante lisi a ultrasuoni e centrifugazione, producendo preparazioni mitocondriali di alta qualità adatte alle applicazioni successive.
Sonicatori Hielscher – Qualità Made in Germany
I sonicatori Hielscher sono noti per i loro elevatissimi standard di qualità e progettazione. La robustezza e la facilità d’uso consentono di integrare agevolmente i nostri sonicatori negli impianti industriali. I sonicatori Hielscher affrontano facilmente condizioni difficili e ambienti impegnativi.
Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e pone particolare attenzione ai sonicatori ad alte prestazioni dotati di tecnologia all’avanguardia e caratterizzati dalla facilità d’uso. Naturalmente, i sonicatori Hielscher sono conformi alle norme CE e soddisfano i requisiti UL, CSA e RoHs.
Sonicatore per piastre a 96 pozzetti UIP400MTP per la sonicazione di piastre per microtitolazione e multipozzetto
Bibliografia / Riferimenti
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Domande frequenti sui mitocondri e sulla diagnostica mitocondriale
Che cosa sono i mitocondri?
I mitocondri sono organelli delimitati da membrane, presenti nelle cellule della maggior parte degli organismi eucarioti. Sono noti come le centrali energetiche della cellula perché producono energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) attraverso il processo di respirazione cellulare. Inoltre, i mitocondri possiedono un proprio DNA e svolgono ruoli fondamentali in altri processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare e della morte cellulare.
Che cosa distingue il mtDNA dal DNA genomico?
Il DNA mitocondriale (mtDNA) differisce dal DNA genomico (gDNA) per diversi aspetti fondamentali. Il mtDNA si trova nei mitocondri, è circolare ed è ereditato dalla madre, mentre il gDNA si trova nel nucleo cellulare, è lineare ed è ereditato da entrambi i genitori. Il mtDNA è molto più piccolo e codifica soltanto 37 geni, mentre il gDNA contiene circa 20.000–25.000 geni. Il mtDNA è presente in più copie per cellula, ha un tasso di mutazione più elevato e codifica principalmente proteine coinvolte nella funzione mitocondriale. Al contrario, il gDNA è tipicamente diploide, ha un tasso di mutazione inferiore e codifica un’ampia gamma di geni necessari per lo sviluppo e il funzionamento dell’organismo. Inoltre, la trascrizione e la traduzione del mtDNA avvengono all’interno dei mitocondri, mentre la trascrizione del gDNA avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma. Queste differenze riflettono i loro ruoli distinti e le loro origini evolutive.
Che cos’è un estratto acellulare?
Un estratto acellulare è una soluzione contenente il contenuto delle cellule lisate, tra cui proteine, acidi nucleici e altri componenti cellulari, ma priva di membrane cellulari intatte. Questo estratto viene utilizzato nella ricerca biochimica e di biologia molecolare per studiare i processi cellulari in vitro, consentendo ai ricercatori di analizzare reazioni e meccanismi al di fuori delle cellule viventi.
Quale ruolo svolgono i test PCR nella diagnostica mitocondriale?
I test PCR svolgono un ruolo fondamentale nella diagnostica mitocondriale, consentendo il rilevamento di mutazioni, delezioni o variazioni del numero di copie nel DNA mitocondriale (mtDNA). Permettono di amplificare regioni specifiche del mtDNA per identificare varianti patogene associate a patologie mitocondriali. Le tecniche basate sulla PCR, quali la PCR quantitativa (qPCR) e la PCR a lungo raggio, vengono utilizzate anche per valutare l’integrità del mtDNA, i livelli di eteroplasmia e la deplezione del mtDNA, fornendo informazioni essenziali sulla funzione mitocondriale e sulle malattie mitocondriali.
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Che cos’è la centrifugazione differenziale?
La centrifugazione differenziale è una tecnica ampiamente utilizzata per il frazionamento cellulare e l’isolamento mitocondriale. Questo metodo separa le strutture cellulari in base al loro coefficiente di sedimentazione, che dipende sia dalla densità sia dalla forma. Il processo prevede l’applicazione di diversi livelli di forza centrifuga a campioni in soluzioni saline tamponate con densità specifiche. Le strutture con coefficienti di sedimentazione simili si depositano contemporaneamente sul fondo della provetta di raccolta, consentendone il recupero.
Come viene utilizzata la centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri?
La centrifugazione differenziale consente ai ricercatori di separare efficacemente le frazioni mitocondriali dagli altri componenti cellulari. L’isolamento dei mitocondri prevede diverse fasi di centrifugazione e il successivo recupero della frazione isolata.
Centrifugazione iniziale: Applicare una bassa forza centrifuga per sedimentare i detriti cellulari di grandi dimensioni e i nuclei.
Centrifugazioni successive: Aumentare gradualmente la forza centrifuga per sedimentare in un pellet le frazioni arricchite di mitocondri. Ogni fase di centrifugazione rimuove strutture con coefficienti di sedimentazione progressivamente più elevati.
Recupero delle frazioni: Dopo ogni centrifugazione, il pellet viene raccolto e il surnatante viene sottoposto a forze g più elevate per isolare la frazione successiva. Questa procedura viene ripetuta fino a raggiungere la purezza desiderata dei mitocondri.