Aplikasi Ultrasonik pada Virus Cacar Monyet
Ultrasonikasi merupakan metode pemrosesan penting untuk isolasi virus cacar monyet (MPXV) dari sampel analitis, fragmentasi DNA virus, serta pembuatan vaksin cacar monyet. Untuk preparasi sampel sebelum diagnostik dan analisis (PCR, ELISA, dll.), ultrasonikasi digunakan untuk melisis sel agar virus cacar monyet terlepas dari bagian dalam sel dan / atau untuk memfragmentasi DNA. Dalam produksi vaksin, aplikasinya mencakup preparasi partikel virus / DNA, enkapsulasi dalam pembawa obat, dan formulasi inokulum.
Di bawah ini Anda dapat menemukan informasi terperinci tentang preparasi sampel virus cacar monyet secara ultrasonik serta produksi vaksin MPXV berbantuan ultrasonik.
Yang akan Anda temukan di halaman ini:
- Lisis Ultrasonik untuk Ekstraksi Virus Cacar Monyet
- Fragmentasi Ultrasonik DNA Virus Cacar Monyet
- Aplikasi Ultrasonik dalam Produksi Vaksin MPXV
Sistem sonikator 2x 1kW untuk operasi aliran kontinu ini dipasang di fasilitas produksi vaksin.
Lisis Ultrasonik dan Fragmentasi DNA sebelum Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Infeksi virus cacar monyet dideteksi dengan pengujian amplifikasi asam nukleat (NAAT), menggunakan reaksi berantai polimerase (PCR) waktu nyata atau konvensional, untuk mendeteksi sekuens unik DNA virus. Sampel (misalnya dari usap nasofaring atau biopsi kulit) mengandung virus di dalam sel.
Untuk analisis, virus harus dilepaskan dari sel dan DNA virus harus difragmentasi untuk PCR.
Lisis Ultrasonik:
Disrupsi sel / lisis ultrasonik merupakan metode yang andal dan efisien untuk mengisolasi virus dari sampel sel, sehingga menjadi teknik yang lebih disukai dibandingkan penggunaan agen kimia, seperti lisozim, proteinase K, dan berbagai detergen yang digunakan sebagai alternatif untuk melisis sel dan melepaskan DNA.
Namun, penggunaan reagen kimia tersebut memerlukan preparasi sampel yang memakan waktu dalam beberapa tahap sebelum analisis PCR untuk mencegah penghambatan reaksi PCR. Karena inhibitor PCR memengaruhi efisiensi amplifikasi, variasi kecil dalam jumlah inhibitor yang tidak dihilangkan dapat menyebabkan variasi besar dalam amplifikasi produk PCR (Diaco, 1995).
Keunggulan ultrasonikasi untuk lisis adalah bahwa disrupsi menyeluruh struktur sel dan pelepasan DNA tanpa memerlukan reagen pelisis dan preparasi sampel yang memakan waktu merupakan hal yang diinginkan. (lihat Fykse et al., 2003)
Fragmentasi DNA Ultrasonik:
Fragmentasi DNA ultrasonik sederhana dan andal karena menghasilkan fragmen DNA yang panjangnya dapat diatur (pasangan basa, bp). Dengan menggunakan ultrasonik, DNA dapat difragmentasi secara efektif hingga mencapai panjang DNA yang ditargetkan. Kontrol presisi atas parameter ultrasonik dan opsi pendinginan canggih mencegah degradasi DNA.
Baca selengkapnya tentang fragmentasi DNA ultrasonik!
Aplikasi Ultrasonik pada Vaksin Virus Cacar Monyet
Vaksin yang digunakan untuk melawan virus cacar monyet saat ini merupakan vaksin virus hidup. Vaksin yang baru dikembangkan mungkin menggunakan platform lain seperti yang berbasis DNA Yang saat ini mengandung virus Vaccinia Ankara yang dimodifikasi, suatu orthopoxvirus yang dilemahkan dan tidak bereplikasi. Vaksin ini juga mengandung Tris (tris-aminometana) dan natrium klorida. Vaksin ini juga dapat mengandung sejumlah kecil DNA dan protein dari sel fibroblas embrio ayam, yang digunakan untuk menumbuhkan virus vaksin, benzonase, serta senyawa antibiotik seperti gentamisin dan siprofloksasin.
Homogenisasi ultrasonik digunakan dalam produksi vaksin virus hidup yang dilemahkan, vaksin DNA, koktail DNA multivalen, vaksin mRNA, vaksin protein rekombinan, vaksin partikel mirip virus, dll.
- dispersi partikel virus dan agen
- emulsifikasi
- inaktivasi virus
- formulasi pembawa obat (NLC, SLN)
- enkapsulasi
- pelarutan agen
- preparasi adjuvan
- penghilangan gas / deaerasi
Protokol Isolasi Ultrasonik Virus Cacar Monyet
Tim peneliti Stittelaar (2005) menggunakan lisis ultrasonik untuk melepaskan virus cacar monyet dari kultur sel inang tempat pertumbuhannya serta dari sel yang diperoleh melalui usap tenggorokan primata yang terinfeksi.
Preparasi Vaksin Cacar Monyet:
Virus cacar monyet ditumbuhkan pada sel fibroblas embrio ayam yang bebas patogen spesifik. Setelah inkubasi selama 1 hingga 2 hari, suspensi virus-sel dipanen melalui satu siklus pembekuan-pencairan, kemudian dipekatkan dengan sentrifugasi. Pelet disuspensikan kembali dan menjalani beberapa siklus homogenisasi ultrasonik.
Isolasi Virus Cacar Monyet dari Makaka yang Divaksinasi:
Sampel dibekukan dan dicairkan tiga kali, lalu disonikasi dalam CupHorn ultrasonik. Dua pengenceran (1:10 dan 1:100) dalam medium transpor yang ditambah 1% serum janin sapi digunakan untuk menginokulasi lapisan tunggal sel Vero dalam pelat enam sumur. Setelah inkubasi selama 1 h pada 37°C, inokulum dibuang dan diganti dengan medium kultur yang ditambah 1% serum janin sapi. Lapisan tunggal tersebut dikultur selama 5 hari pada 37°C dan diwarnai dengan larutan kristal violet.
(lihat Stittelaar et al., 2005)
Sonikator untuk Analisis Virus dan Produksi Vaksin
Portofolio produk Hielscher Ultrasonics yang luas menawarkan sonikator ideal untuk laboratorium penelitian dan analisis serta pembuatan vaksin industri.
Hielscher Ultrasonics mengkhususkan diri dalam perancangan, pembuatan, dan distribusi sonikator berkinerja tinggi serta sonobioreaktor untuk digunakan di laboratorium penelitian dan analisis serta untuk diterapkan dalam produksi vaksin industri (misalnya vaksin, bahan aktif farmasi (API)).
Sonikasi dapat diterapkan pada bejana terbuka, reaktor tertutup yang diaduk terus-menerus, dan reaktor aliran kontinu. Semua bagian sistem ultrasonik yang bersentuhan dengan medium cair terbuat dari baja tahan karat, titanium, atau kaca. Bagian yang dapat diautoklaf dan sambungan saniter memastikan produksi berlangsung dalam kondisi yang memenuhi standar farmasi.
Perekaman Data Otomatis: Perangkat lunak cerdas merekam parameter proses sonikasi secara otomatis pada kartu memori SD terintegrasi. Kontrol presisi atas seluruh parameter proses memastikan reprodusibilitas, standardisasi produksi, dan memudahkan pemenuhan standar keamanan produk farmasi.
Prosesor ultrasonik Hielscher Ultrasonics sangat andal dan dapat dikontrol secara presisi. Semua sonikator industri dapat diatur untuk menghasilkan seluruh rentang amplitudo, dari rendah hingga sangat tinggi. Ketangguhan sistem ultrasonik Hielscher memungkinkan operasi 24/7 dengan beban kerja berat dan di lingkungan yang menuntut.
Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sonikator kami:
| Volume Batch | Laju Alir | Perangkat yang Direkomendasikan |
|---|---|---|
| pelat multisumur / mikrotiter | n/a | UIP400MTP |
| 1 hingga 500mL | 10 hingga 200mL/min | UP100H |
| 10 hingga 2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 hingga 20L | 0,2 hingga 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 hingga 100L | 2 hingga 10L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 hingga 100L/min | UIP16000 |
| n/a | lebih besar | gabungan beberapa UIP16000 |
Hubungi Kami! / Tanyakan kepada Kami!
Pemotongan DNA dengan gaya geser ultrasonik
Diadaptasi dari Jkwchui berdasarkan CC-BY-SA.03
Literatur / Referensi
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakta yang Perlu Diketahui
Virus Cacar Monyet
Cacar monyet (MPV, MPXV, atau hMPXV) adalah spesies virus DNA beruntai ganda yang menyebabkan penyakit zoonosis akibat virus. Penyakit ini dikenal sebagai infeksi cacar monyet dan dapat terjadi pada manusia dan hewan. Virus ini termasuk dalam genus Orthopoxvirus dalam famili Poxviridae. Virus cacar monyet merupakan salah satu orthopoxvirus manusia, bersama virus variola (VARV), cacar sapi (CPX), dan vaccinia (VACV). Orthopoxvirus dicirikan oleh partikel virus besar berbentuk batu bata yang mengandung genom DNA beruntai ganda dengan panjang sekitar 200.000 bp.
Uji ELISA
ELISA merupakan singkatan dari Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (uji imunosorben terkait enzim) dan merupakan imunoasai berlabel yang dianggap sebagai standar emas imunoasai. ELISA adalah uji imunologis yang dihargai karena sensitivitas diagnostiknya yang tinggi dan digunakan untuk mendeteksi serta mengukur jumlah molekul, termasuk antibodi, antigen, protein, glikoprotein, dan hormon. Prinsip ELISA didasarkan pada interaksi antigen-antibodi. Melalui interaksi antigen-antibodi ini, antibodi spesifik berikatan dengan antigen targetnya. Hanya ketika interaksi ini terjadi, substrat dapat berikatan dengan enzim dan konversi substrat berikutnya dapat diamati, yang berarti hasil positif diperoleh.
Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi dari skala laboratorium hingga industri.