Aplikasi Ultrasonik dalam Virus Cacar Monyet
Ultrasonikasi adalah metode pemrosesan penting untuk isolasi virus cacar monyet (MPXV) dari sampel analitik, untuk fragmentasi DNA virus serta dalam pembuatan vaksin cacar monyet. Untuk persiapan sampel sebelum diagnostik dan analisis (PCR, ELISA dll.) ultrasonikasi digunakan untuk melisiskan sel untuk melepaskan virus cacar monyet dari bagian dalam sel dan / atau untuk memecah DNA. Dalam produksi vaksin, aplikasinya berkisar dari persiapan partikel virus/DNA, enkapsulasi dalam pembawa obat dan formulasi inokula.
Di bawah ini Anda dapat menemukan informasi terperinci tentang persiapan sampel virus cacar monyet ultrasonik serta produksi vaksin MPXV yang dibantu secara ultrasonik.
Apa yang akan Anda temukan di halaman ini:
- Lisis Ultrasonik untuk Ekstraksi Virus Cacar Monyet
- Fragmentasi Ultrasonik DNA Virus Cacar Monyet
- Aplikasi Ultrasonik dalam Produksi Vaksin MPXV
Sistem ultrasonicators 2x 1kW untuk operasi aliran kontinu ini dipasang di fasilitas produksi vaksin.
Lisis Ultrasonik dan Fragmentasi DNA sebelum Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Infeksi virus cacar monyet dideteksi dengan pengujian amplifikasi asam nukleat (NAAT), menggunakan reaksi berantai polimerase (PCR) real-time atau konvensional, untuk mendeteksi urutan unik DNA virus. Sampel (misalnya dari pertukaran nasofaring atau biopsi kulit) mengandung virus dalam sel.
Untuk analisis, virus harus dilepaskan dari sel dan DNA virus harus terfragmentasi untuk PCR.
Lisis Ultrasonik:
Gangguan / lisis sel ultrasonik adalah metode yang andal dan efisien untuk mengisolasi virus dari sampel sel dan dengan demikian teknik yang lebih disukai daripada agen kimia, seperti lisozim, proteinase K dan deterjen yang berbeda yang secara alternatif digunakan untuk mencapai lisis sel dan pelepasan DNA.
Namun, penggunaan reagen kimia tersebut membutuhkan persiapan sampel yang memakan waktu dalam beberapa langkah sebelum analisis PCR untuk mencegah penghambatan reaksi PCR. Karena inhibitor PCR mempengaruhi efisiensi amplifikasi, variasi kecil dari jumlah inhibitor yang tidak dihilangkan dapat menyebabkan variasi besar dalam amplifikasi produk PCR (Diaco, 1995).
Keuntungan ultrasonikasi untuk lisis adalah bahwa gangguan total struktur seluler dan pelepasan DNA tanpa perlu reagen lisis dan persiapan sampel yang memakan waktu diinginkan. (lih. Fykse et al., 2003)
Fragmentasi DNA Ultrasonik:
Fragmentasi DNA ultrasonik sederhana dan dapat diandalkan karena menghasilkan fragmen DNA yang dapat disesuaikan dengan panjang (basepair, bp). Dengan menggunakan ultrasound, DNA dapat secara efektif terfragmentasi ke panjang DNA yang ditargetkan. Kontrol yang tepat atas parameter ultrasonik dan opsi pendinginan yang canggih mencegah degradasi DNA.
Baca lebih lanjut tentang fragmentasi DNA ultrasonik!
Aplikasi Ultrasonik dalam Vaksin Virus Cacar Monyet
Vaksin yang digunakan untuk melawan virus cacar monyet saat ini adalah vaksin virus hidup. Vaksin yang baru dikembangkan mungkin menggunakan platform lain seperti berbasis DNA Saat ini mengandung vaccinia Ankara viurs yang dimodifikasi, orthopoxvirus yang dilemahkan dan tidak mereplikasi. Ini juga mengandung Tris (tris-aminomethane) dan natrium klorida. Vaksin ini juga dapat mengandung sejumlah kecil DNA dan protein dari sel Fibroblas Embrio Ayam, yang digunakan untuk menumbuhkan virus vaksin, benzonase dan senyawa antibiotik seperti gentamisin dan ciprofloxacin.
Homogenisasi ultrasonik digunakan dalam produksi vaksin virus hidup yang dilemahkan, vaksin DNA, koktail DNA multi-valen, vaksin mRNA, vaksin protein rekombinan, vaksin partikel seperti virus, dll.
- dispersi partikel dan agen virus
- emulsi
- Inaktivasi Virus
- formulasi pembawa obat (NLC, SLN)
- enkapsulasi
- pelarutan agen
- Persiapan adjuvan
- Degassing / De-Aerasi
Protokol untuk Isolasi Ultrasonik Virus Cacar Monyet
Tim peneliti Stittelaar (2005) menggunakan lisis ultrasonik untuk melepaskan virus cacar monyet dari kultur sel inang pertumbuhan serta dari sel yang diperoleh melalui pertukaran tenggorokan dari primata yang terinfeksi.
Persiapan Vaksin Cacar Monyet:
Virus cacar monyet ditanam pada sel fibroblas embrio ayam bebas patogen spesifik. Setelah inkubasi selama 1 hingga 2 hari, suspensi sel virus dipanen dengan satu putaran pencairan beku dan kemudian dikonsentrasikan dengan sentrifugasi. Pelet ditangguhkan kembali dan mengalami beberapa putaran homogenisasi ultrasonik.
Isolasi Virus Cacar Monyet dari Kera yang Divaksinasi:
Sampel dibekukan dicairkan tiga kali dan disonikasi dalam CupHorn ultrasonik. Dua pengenceran (1:10 dan 1:100) dalam media transportasi yang dilengkapi dengan serum sapi janin 1% digunakan untuk menginokulasi monolayer sel Vero dalam pelat enam sumur. Setelah 1 jam inkubasi pada suhu 37°C, inokula dikeluarkan dan diganti dengan media kultur yang dilengkapi dengan serum sapi janin 1%. Monolayer dibiakkan selama 5 hari pada suhu 37°C dan diwarnai dengan larutan kristal violet.
(lih. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonicators untuk Analisis Virus dan Produksi Vaksin
Portofolio produk Hielscher Ultrasonics yang luas menawarkan ultrasonicator yang ideal untuk laboratorium penelitian dan analitik serta untuk pembuatan vaksin industri.
Hielscher Ultrasonics mengkhususkan diri dalam desain, manufaktur, dan distribusi ultrasonicator berkinerja tinggi dan sono-bioreaktor untuk digunakan dalam laboratorium penelitian dan analitik serta untuk implementasi dalam produksi vaksin industri (misalnya Vaksin, Api).
Sonikasi dapat diterapkan pada bejana terbuka, reaktor yang diaduk terus menerus tertutup dan reaktor aliran terus menerus. Semua bagian dari sistem ultrasonik, yang bersentuhan dengan media cair, terbuat dari baja tahan karat, titanium, atau kaca. Suku cadang yang dapat diautoklaf dan alat kelengkapan sanitasi memastikan produksi di bawah kondisi kelas farmasi.
Perekaman Data Otomatis: Perangkat lunak cerdas merekam parameter proses sonikasi secara otomatis pada kartu memori SD terintegrasi. Kontrol yang tepat dari semua parameter proses memastikan reproduktibilitas, standarisasi produksi, dan memfasilitasi pemenuhan standar keamanan produk farmasi.
Hielscher Ultrasonics’ Prosesor ultrasonik sangat andal dan dapat dikontrol dengan tepat. Semua ultrasonicator industri dapat disesuaikan untuk memberikan rentang penuh dari amplitudo yang lebih rendah hingga sangat tinggi. Kekokohan sistem ultrasonik Hielscher memungkinkan pengoperasian 24/7 di bawah tugas berat dan di lingkungan yang menuntut.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami:
| Batch Volume | Flow Rate | Direkomendasikan perangkat |
|---|---|---|
| Pelat multi-sumur / mikrotiter | N/a | UIP400MTP |
| 1 hingga 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
| 10-2000mL | 20 hingga 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 hingga 20L | 0.2 sampai 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 sampai 100L | 2-10L/min | UIP4000hdT |
| N/a | 10 sampai 100L/menit | UIP16000 |
| N/a | kristal yang lebbig | cluster UIP16000 |
Hubungi Kami! / Tanya Kami!
Ultrasonic DNA Shearing
Diadaptasi dari Jkwchui di bawah CC-BY-SA.03
Literatur / Referensi
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakta-fakta yang Patut Diketahui
Virus cacar monyet
Cacar monyet (MPV, MPXV, atau hMPXV) adalah spesies virus DNA beruntai ganda, yang menyebabkan penyakit zoonosis virus. Penyakit ini dikenal sebagai infeksi cacar monyet dan dapat terjadi pada manusia dan hewan. Itu milik genus Orthopoxvirus dalam famili Poxviridae. Virus cacar monyet merupakan salah satu virus orthopox manusia bersama dengan virus variola (VARV), cowpox (CPX), dan vaccinia (VACV). Orthopoxvirus ditandai dengan partikel virus berbentuk batu bata besar, mengandung genom DNA beruntai ganda sekitar 200.000 bp.
Uji ELISA
ELISA adalah singkatan dari Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay dan merupakan immunoassay berlabel yang dianggap sebagai standar emas immunoassays. ELISA adalah tes imunologis, yang dihargai karena sensitivitas diagnostiknya yang tinggi, digunakan untuk mendeteksi dan mengukur molekul, termasuk antibodi, antigen, protein, glikoprotein, dan hormon. Prinsip ELISA didasarkan pada interaksi antigen-antibodi. Dengan interaksi antigen-antibodi ini, antibodi spesifik berikatan dengan antigen targetnya. Hanya ketika interaksi terjadi, substrat dapat mengikat enzim dan konversi substrat berikutnya dapat diamati, yang berarti hasil positif diperoleh.
Hielscher Ultrasonics memproduksi homogenizer ultrasonik berkinerja tinggi dari laboratorium hingga ukuran industri.