सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) ट्रांसपोर्टर के रूप में एग्रोबैक्टीरियम का उपयोग करके विदेशी जीन के साथ पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने का एक कुशल तरीका है। अल्ट्रासोनिक गुहिकायन सोनोपोरेशन का कारण बनता है, जिसे पौधे के ऊतकों के लक्षित सूक्ष्म-घायल होने के रूप में वर्णित किया जा सकता है। इन अल्ट्रासोनिक रूप से सूक्ष्म घावों के माध्यम से, डीएनए और डीएनए वैक्टर को कुशलतापूर्वक सेल मैट्रिक्स में ले जाया जा सकता है।

सोनोपोरेशन – Ultrasonically बढ़ाया सेल परिवर्तन

जब कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (लगभग 20 किलोहर्ट्ज) सेल निलंबन पर लागू होता है, तो ध्वनिक गुहिकायन के प्रभाव सेल ऊतकों पर एक क्षणिक झिल्ली परमीबिलाइजेशन का कारण बनते हैं। इस अल्ट्रासोनिक प्रभाव को सोनोपोरेशन के रूप में जाना जाता है और इसका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों में जीन हस्तांतरण के लिए किया जाता है।
अल्ट्रासोनिकेशन के फायदे इसके गैर-थर्मल मैकेनिकल वर्किंग सिद्धांत पर आधारित हैं, जो सोनिकेशन को अक्सर अधिक बहुमुखी और सेल प्रकारों पर कम निर्भर बनाता है। सोनोपोरेशन का बहुमुखी अनुप्रयोग ट्रांसजेनिक पौधों के उपयोग की संभावना को खोलता है, जिसमें जटिल मानव चिकित्सीय प्रोटीन के जैव उत्पादन में महत्वपूर्ण क्षमता है। इस तरह के पौधे आधारित बायोरिएक्टर आनुवंशिक रूप से आसान हो सकते हैं, मानव रोगजनकों के साथ संभावित संदूषण को रोक सकते हैं, परिवर्तन मध्यस्थता बैक्टीरिया (जैसे एग्रोबैक्टीरियम) को नुकसान नहीं पहुंचाते हैं, और जैव-संश्लेषण की एक सस्ती, प्रभावोत्पादक विधि हैं।

अल्ट्रासोनिक-असिस्टेड सेल ट्रांसफॉर्मेशन

सोनिकेशन एक ऐसी तकनीक है जो समाधान में कणों को उत्तेजित करने के लिए कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड तरंगों को लागू करती है, समाधान ों को मिलाने के लिए, जिससे बड़े पैमाने पर हस्तांतरण और विघटन की दर बढ़ जाती है। इसके साथ ही, सोनिकेशन तरल पदार्थ से भंग गैसों को हटा सकता है। पौधे-परिवर्तन में, सोनिकेशन पौधे के ऊतकों पर माइक्रोवाउंड के गठन का कारण बनेगा और पौधे प्रोटोप्लास्ट में नग्न डीएनए के वितरण को बढ़ाएगा।

आनुवांशिक परिवर्तन के लिए, सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) पसंदीदा विधि है और इसमें नग्न डीएनए और डीएनए वैक्टर को सीधे प्रोटोप्लास्ट में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सोनिकेशन की तुलना में काफी अधिक दक्षता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि सोनिकेशन असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) का उपयोग अल्ट्रासाउंड तरंगों और परिणामी ध्वनिक गुहिकायन द्वारा पौधों की कोशिकाओं पर यांत्रिक व्यवधान और घावों के गठन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। एक छोटा अल्ट्रासोनिक उपचार एक्सप्लैंट्स की सतह पर सूक्ष्म घाव बनाता है। चूंकि घायल कोशिकाएं पौधे के ऊतकों के गहरे हिस्से में एग्रोबैक्टीरियम के प्रवेश की अनुमति देंगी, इस प्रकार पौधे की कोशिकाओं के संक्रमित होने की संभावना बढ़ जाएगी। इसके अतिरिक्त, स्रावित फेनोलिक यौगिक परिवर्तन को बढ़ाते हैं। अल्ट्रासोनिक रूप से उत्पन्न सूक्ष्म घाव बैक्टीरिया द्वारा एक्सप्लैंट प्रवेश को भी अधिक व्यवहार्य बनाते हैं। एसएएटी का सफलतापूर्वक पौधों की प्रजातियों में आनुवंशिक परिवर्तन के लिए उपयोग किया गया था, विशेष रूप से एग्रोबैक्टीरियम के प्रतिरोधी के रूप में माना जाता है।
एक बहुत ही सरल और सस्ती विधि होने के नाते, साथ ही एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण की महत्वपूर्ण वृद्धि एसएएटी के प्रमुख फायदे हैं। चेनोपोडियम रूब्रम एल और बीटा वल्गारिस एल के परिवर्तन में एसएएटी के सफल अनुप्रयोग के अलावा, इस दृष्टिकोण को निकोटियाना टैबाकम में पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोलाई जंगली-प्रकार गर्मी-लेबिल होलोटॉक्सिन और एस्चेरिचिया कोलाई उत्परिवर्ती एलटी वैक्सीन एडजुवेंट्स के उत्पादन में भी लागू किया गया है, जिसमें पक्षियों में उच्चतम प्रणालीगत एलटी-बी-विशिष्ट आईजीजी टाइटर्स का पता चला था।
( सीएफ लायर एट अल, 2016; एम क्लिमेक-चोडाका और आर बारांस्की, 2014)

पादप कोशिकाओं में सोनोपोरेशन के माध्यम से जीन स्थानांतरण के लिए सामान्य प्रक्रिया

1. आनुवंशिक सामग्री की तैयारी: उस आनुवंशिक सामग्री को तैयार करके शुरू करें जिसे आप पौधे की कोशिकाओं में पेश करना चाहते हैं। यह प्लास्मिड डीएनए, आरएनए या अन्य न्यूक्लिक एसिड हो सकता है।
2. प्लांट सेल अलगाव: उन पौधों की कोशिकाओं को अलग करें जिन्हें आप लक्षित करना चाहते हैं। आपके प्रयोग के आधार पर, इन कोशिकाओं को पौधों के ऊतकों या संस्कृतियों से अलग किया जा सकता है।
3. सेल निलंबन: पौधे की कोशिकाओं को एक उपयुक्त माध्यम या बफर में निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि कोशिकाएं स्वस्थ हैं और जीन अपटेक के लिए अनुकूल स्थिति में हैं।
4. अपना Sonicator सेटअप करें: आयाम, समय, ऊर्जा और तापमान जैसे पूर्व-सेटिंग मापदंडों द्वारा अपने प्रोब-टाइप सोनिकेटर को तैयार करें। सेल निलंबन में अल्ट्रासोनिक जांच को डुबोएं।
5. sonication: सोनिकेशन प्रक्रिया शुरू करें। जांच टिप का तेजी से दोलन तरल में गुहिकायन बुलबुले उत्पन्न करता है। ये बुलबुले अल्ट्रासोनिक तरंगों के कारण फैलते हैं और ढह जाते हैं, जिससे निलंबन में यांत्रिक बल और माइक्रोस्ट्रीमिंग होती है।
6. Sonoporation: कैविटेशन द्वारा उत्पन्न यांत्रिक बल और माइक्रोस्ट्रीमिंग पौधे की कोशिकाओं की झिल्ली में अस्थायी रूप से छिद्र और छेद बनाते हैं। निलंबन में मौजूद आनुवंशिक सामग्री इन छिद्रों के माध्यम से पौधे की कोशिकाओं में प्रवेश कर सकती है।
7. इनक्यूबेशन: सोनोपोरेशन उपचार के बाद, पौधे की कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ताकि वे अपनी झिल्ली को ठीक और स्थिर कर सकें। यह सेल अस्तित्व और सफल जीन हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

एग्रोबैक्टीरियम या लिपोसोम के माध्यम से जीन स्थानांतरण

प्लांट सेल को स्थानांतरित करने के लिए दो सामान्य रूप हैं। वे या तो एग्रोबैक्टीरियम, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक जीनस, या लिपोसोम का उपयोग आनुवंशिक सामग्री के वाहक के रूप में करते हैं।

• एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता सोनोपोरेशन: एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसेन्स एक जीवाणु है जिसका उपयोग आमतौर पर प्लांट जेनेटिक इंजीनियरिंग में किया जाता है। इस विधि में, वांछित जीन युक्त प्लास्मिड डीएनए को एग्रोबैक्टीरियम में पेश किया जाता है, जिसे बाद में पौधों की कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। सेल निलंबन को एक जांच-प्रकार सोनिकेटर का उपयोग करके सोनोपोरेशन के अधीन किया जाता है। अल्ट्रासोनिक ऊर्जा एग्रोबैक्टीरियम से पौधे की कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री के हस्तांतरण को बढ़ाती है। इस विधि का व्यापक रूप से पौधों के आनुवंशिक संशोधन के लिए उपयोग किया जाता है।
• लिपोसोम-मध्यस्थता सोनोपोरेशन: लिपोसोम लिपिड-आधारित पुटिका एं हैं जो आनुवंशिक सामग्री ले जा सकती हैं। इस विधि में, प्लास्मिड डीएनए या अन्य न्यूक्लिक एसिड से भरे लिपोसोम को पौधों की कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। पौधों की कोशिकाओं द्वारा लिपोसोम के उत्थान को सुविधाजनक बनाने के लिए एक प्रोब-टाइप सोनिकेटर का उपयोग करके सोनोपोरेशन नियोजित किया जाता है। अल्ट्रासाउंड लिपोसोम के लिपिड बाइलेयर को बाधित करता है, जिससे आनुवंशिक सामग्री पौधे की कोशिकाओं में जारी होती है। यह दृष्टिकोण पौधों की कोशिकाओं में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए उपयोगी है।

सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) के वैज्ञानिक रूप से सिद्ध लाभ

सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) को कई पौधों की प्रजातियों पर लागू किया गया है। पौधे सेल संस्कृतियों का एक छोटा और अपेक्षाकृत हल्का अल्ट्रासोनिक उपचार सोनोपोरेशन का कारण बनता है, जो बाद में जीन ट्रांसपोर्टर के रूप में एग्रोबैक्टीरियम के गहरे प्रवेश की अनुमति देता है। नीचे आप एसएएटी के लाभकारी प्रभावों का प्रदर्शन करने वाले अनुकरणीय अध्ययन पढ़ सकते हैं।

अश्वगंधा का अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त परिवर्तन

सोम्निफेरा (जिसे अश्वगंधा या शीतकालीन चेरी के रूप में जाना जाता है) में परिवर्तन दक्षता में सुधार करने के लिए, देहदाष्टी और सहयोगियों (2016) ने एसिटोसिरिंगोन (एएस) और सोनिकेशन के उपयोग की जांच की।
एसिटोसिरिंगोन (एएस) को तीन चरणों में जोड़ा गया था: एग्रोबैक्टीरियम तरल संस्कृति, एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण और एग्रोबैक्टीरियम के साथ एक्स्प्लैंट्स की सह-संस्कृति। एग्रोबैक्टीरियम तरल संस्कृति के लिए 75 μM एएस के अलावा वीर जीन के प्रेरण के लिए इष्टतम पाया गया था।
सोनिकेशन (एसएएटी) के अतिरिक्त अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप उच्चतम जीन अभिव्यक्ति हुई। बालों की जड़ों में गुसा जीन अभिव्यक्ति सबसे अच्छी पाई गई थी जब पत्तियों और शूट युक्तियों को क्रमशः 10 और 20 के लिए सोनिकेटेड किया गया था। बेहतर प्रोटोकॉल की परिवर्तन दक्षता क्रमशः पत्ती और शूट टिप एक्सप्लैंट्स के मामले में 66.5 और 59.5% दर्ज की गई थी। जब अन्य प्रोटोकॉल के साथ तुलना की जाती है तो इस बेहतर प्रोटोकॉल की परिवर्तन दक्षता पत्तियों के लिए 2.5 गुना अधिक और शूट युक्तियों के लिए 3.7 गुना अधिक पाई गई थी। दक्षिणी धब्बा विश्लेषण ने डब्ल्यू 1-डब्ल्यू 4 लाइनों में गुसा ट्रांसजीन की 1-2 प्रतियों की पुष्टि की, जबकि बेहतर प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न लाइन डब्ल्यू 5 में 1-4 ट्रांसजीन प्रतियों का पता लगाया गया था।

डब्ल्यू सोम्निफेरा पत्ती (ए) और शूट टिप (बी) एक्सप्लैंट्स की परिवर्तन आवृत्ति पर सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) की अवधि का प्रभाव
(अध्ययन और ग्राफिक: © देहदाष्टी एट अल।

कपास के अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त परिवर्तन

हुसैन एट अल (2007) सोनिकेशन-सहायता प्राप्त कपास परिवर्तन के लाभकारी प्रभावों को प्रदर्शित करता है। कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड के कारण ध्वनिक गुहिकायन पौधे के ऊतकों (सोनोपोरेशन) की सतह पर और नीचे सूक्ष्म घाव बनाता है और एग्रोबैक्टीरियम को पूरे पौधे के ऊतकों में गहरी और पूरी तरह से यात्रा करने की अनुमति देता है। यह घायल फैशन ऊतक में गहराई से झूठ बोलने वाली पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने की संभावना को बढ़ाता है। एसएएटी की परिवर्तन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, जीयूएस जीन अभिव्यक्ति को मापा गया था। जीयूएस रिपोर्टर सिस्टम एक रिपोर्टर जीन सिस्टम है, जो विशेष रूप से पौधे आणविक जीव विज्ञान और सूक्ष्म जीव विज्ञान में उपयोगी है। विभिन्न एसएएटी मापदंडों को समायोजित करते हुए, एक्सप्लैंट के रूप में परिपक्व भ्रूण का उपयोग करके कपास में जीयूएस क्षणिक अभिव्यक्ति को काफी बढ़ाया गया था। जीयूएस को पहली बार एक्सप्लैंट्स के इनक्यूबेशन के बाद 24 घंटे का पता लगाया गया था और 48 घंटे तक, जीयूएस अभिव्यक्ति बहुत तीव्र थी जो सोनिकेशन की सहायता से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) के बाद कपास एक्सप्लैंट के सफल परिवर्तन के एक उपयोगी संकेतक के रूप में कार्य करती थी। विभिन्न परिवर्तन तकनीकों (अर्थात् बायोलिस्टिक, एग्रो, बीएएटी, एसएएटी) की तुलना, सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) ने अब तक के परिवर्तन के सर्वोत्तम परिणाम दिखाए।

जीयूएस की क्षणिक अभिव्यक्ति के आधार पर परिवर्तन प्रक्रिया का विकल्प। सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) काफी अधिक क्षणिक अभिव्यक्ति दिखाता है।
(अध्ययन और ग्राफिक: © हुसैन एट अल।

सोनोपोरेशन और एसएएटी के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक समाधान

Hielscher Ultrasonics लंबे समय से प्रयोगशालाओं, अनुसंधान सुविधाओं के साथ-साथ बहुत अधिक थ्रूपुट के साथ औद्योगिक उत्पादन के लिए उच्च प्रदर्शन ultrasonicators के विकास और निर्माण में अनुभवी है। माइक्रोबायोलॉजी और जीवन विज्ञान के लिए, Hielscher विशिष्ट ऊतकों और उनके उपचार के लिए आवश्यक विभिन्न आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है। कई नमूनों के एक साथ अल्ट्रासोनिकेशन के लिए, हिल्सचर मल्टीवेल प्लेटों के लिए यूआईपी 400 एमटीपी प्रदान करता है, 10 शीशियों (जैसे, एपेंडोर्फ ट्यूब) या अल्ट्रासोनिक कपहॉर्न तक के सोनिकेशन के लिए वायलट्वीटर। जांच-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर प्रयोगशाला होमोजेनाइज़र के रूप में 50 से 400 वाट तक उपलब्ध हैं, जबकि औद्योगिक प्रणालियां 500 वाट से 16 किलोवाट तक की बिजली सीमा को कवर करती हैं।
कृपया हमसे संपर्क करें और हमें अपने आवेदन और प्रक्रिया आवश्यकताओं के बारे में बताएं। हमारे अच्छी तरह से अनुभवी कर्मचारियों को आपकी जैविक प्रक्रिया के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिकेटर की सिफारिश करने में खुशी होगी।
नीचे दी गई तालिका आपको हमारे अल्ट्रासोनिकटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है: