अल्ट्रासोनिक्स का उपयोग करके पादप कोशिकाओं में आनुवंशिक रूपांतरण
सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT), वाहक के रूप में Agrobacterium का उपयोग करके पादप कोशिकाओं को बाहरी जीनों से संक्रमित करने की एक कुशल विधि है। अल्ट्रासोनिक कैविटेशन से सोनोपोरेशन होता है, जिसे पादप ऊतक में लक्षित सूक्ष्म घाव बनाने के रूप में वर्णित किया जा सकता है। अल्ट्रासोनिक रूप से बने इन सूक्ष्म घावों के माध्यम से DNA और DNA संवाहकों को कोशिका मैट्रिक्स में कुशलतापूर्वक पहुँचाया जा सकता है।
सोनोपोरेशन – अल्ट्रासोनिक रूप से संवर्धित कोशिका रूपांतरण
जब कोशिका निलंबनों पर निम्न-आवृत्ति वाला अल्ट्रासाउंड (लगभग 20kHz) लागू किया जाता है, तो ध्वनिक कैविटेशन के प्रभाव कोशिकीय ऊतकों की झिल्लियों की पारगम्यता को अस्थायी रूप से बढ़ा देते हैं। इस अल्ट्रासोनिक प्रभाव को सोनोपोरेशन कहा जाता है और इसका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों में जीन स्थानांतरण के लिए किया जाता है।
अल्ट्रासोनिक उपचार के लाभ इसके गैर-तापीय यांत्रिक कार्य सिद्धांत पर आधारित हैं, जो सोनिकेशन को अक्सर अधिक बहुउपयोगी और कोशिका प्रकारों पर कम निर्भर बनाता है। सोनोपोरेशन के विविध अनुप्रयोग ट्रांसजेनिक पौधों के उपयोग की संभावना खोलते हैं, जिनमें जटिल मानव चिकित्सीय प्रोटीनों के जैवउत्पादन की उल्लेखनीय क्षमता होती है। ऐसे पादप-आधारित बायोरिएक्टरों में आसानी से आनुवंशिक हेरफेर किया जा सकता है, वे मानव रोगजनकों से संभावित संदूषण को रोकते हैं, रूपांतरण में मध्यस्थता करने वाले जीवाणुओं (जैसे Agrobacterium) को क्षति नहीं पहुँचाते और जैवसंश्लेषण की एक सस्ती, प्रभावकारी विधि हैं।
अल्ट्रासोनिकेटर UP200St (200W, 26kHz) ध्वनि-रोधी आवरण के साथ
अल्ट्रासाउंड-सहायित कोशिका रूपांतरण
सोनिकेशन एक ऐसी तकनीक है जिसमें विलयन में कणों को हिलाने और विलयनों को मिलाने के लिए निम्न-आवृत्ति वाली अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग किया जाता है, जिससे द्रव्यमान स्थानांतरण और घुलने की दर बढ़ती है। साथ ही, सोनिकेशन द्रवों से घुली हुई गैसों को हटा सकता है। पादप रूपांतरण में सोनिकेशन पादप ऊतक पर सूक्ष्म घाव बनाएगा और पादप प्रोटोप्लास्ट में अनावृत DNA की आपूर्ति बढ़ाएगा।
आनुवंशिक रूपांतरण के लिए सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) पसंदीदा विधि है और इसकी दक्षता, अनावृत DNA तथा DNA संवाहकों को सीधे प्रोटोप्लास्ट में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सोनिकेशन की तुलना में उल्लेखनीय रूप से अधिक है। अनेक अध्ययनों ने दिखाया है कि सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) का उपयोग अल्ट्रासाउंड तरंगों और उनसे उत्पन्न ध्वनिक कैविटेशन द्वारा पादप कोशिकाओं में यांत्रिक विघटन और घाव उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। संक्षिप्त अल्ट्रासोनिक उपचार एक्सप्लांट की सतह पर सूक्ष्म घाव बनाता है। चूँकि घायल कोशिकाएँ Agrobacterium को पादप ऊतकों के अधिक गहरे भाग में प्रवेश करने देंगी, इसलिए पादप कोशिकाओं के संक्रमित होने की संभावना बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, स्रावित फेनोलिक यौगिक रूपांतरण को बढ़ाते हैं। अल्ट्रासोनिक रूप से उत्पन्न सूक्ष्म घाव जीवाणुओं के लिए एक्सप्लांट में प्रवेश करना भी अधिक सुगम बनाते हैं। SAAT का सफलतापूर्वक उपयोग उन पादप प्रजातियों में आनुवंशिक रूपांतरण के लिए किया गया है जिन्हें विशेष रूप से Agrobacterium के प्रति प्रतिरोधी माना जाता है।
अत्यंत सरल और सस्ती विधि होना तथा Agrobacterium-मध्यस्थ जीन स्थानांतरण में उल्लेखनीय वृद्धि करना SAAT के प्रमुख लाभ हैं। Chenopodium rubrum L. और Beta vulgaris L. के रूपांतरण में SAAT के सफल अनुप्रयोग के अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग Nicotiana tabacum में पुनःसंयोजक Escherichia coli वाइल्ड-टाइप ताप-अस्थिर होलोटॉक्सिन और Escherichia coli उत्परिवर्ती LT टीका सहायक पदार्थों के उत्पादन में भी किया गया है, जिसमें पक्षियों में उच्चतम प्रणालीगत LT-B-विशिष्ट IgG टाइटर पाए गए।
, 2016; एम. क्लिमेक-चोडाका और आर. बारांस्की, 2014)
VialTweeter कई नमूना ट्यूबों के एक साथ सोनिकेशन के लिए, जैसे सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) के लिए
पादप कोशिकाओं में सोनोपोरेशन द्वारा जीन स्थानांतरण की सामान्य प्रक्रिया
- आनुवंशिक सामग्री की तैयारी: सबसे पहले वह आनुवंशिक सामग्री तैयार करें जिसे आप पादप कोशिकाओं में पहुँचाना चाहते हैं। यह प्लास्मिड DNA, RNA या अन्य न्यूक्लिक अम्ल हो सकता है।
- पादप कोशिकाओं का पृथक्करण: उन पादप कोशिकाओं को पृथक करें जिन्हें आप लक्षित करना चाहते हैं। आपके प्रयोग के आधार पर, इन कोशिकाओं को पादप ऊतकों या संवर्धों से पृथक किया जा सकता है।
- कोशिका निलंबन: पादप कोशिकाओं को किसी उपयुक्त माध्यम या बफ़र में निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि कोशिकाएँ स्वस्थ हों और जीन ग्रहण करने के अनुकूल अवस्था में हों।
- अपना सोनिकेटर तैयार करें: आयाम, समय, ऊर्जा और तापमान जैसे सोनिकेशन मापदंडों को पहले से निर्धारित करके अपना प्रोब-प्रकार का सोनिकेटर तैयार करें। अल्ट्रासोनिक प्रोब को कोशिका निलंबन में डुबोएँ।
- सोनिकेशन: सोनिकेशन प्रक्रिया शुरू करें। प्रोब के सिरे का तीव्र दोलन तरल में कैविटेशन बुलबुले उत्पन्न करता है। अल्ट्रासोनिक तरंगों के कारण ये बुलबुले फैलते हैं और ढहते हैं, जिससे निलंबन में यांत्रिक बल और सूक्ष्म प्रवाह उत्पन्न होते हैं।
- सोनोपोरेशन: कैविटेशन से उत्पन्न यांत्रिक बल और सूक्ष्म प्रवाह पादप कोशिकाओं की झिल्लियों में अस्थायी रूप से रंध्र और छिद्र बनाते हैं। निलंबन में उपस्थित आनुवंशिक सामग्री इन रंध्रों के माध्यम से पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर सकती है।
- ऊष्मायन: सोनोपोरेशन उपचार के बाद, पादप कोशिकाओं का ऊष्मायन करें ताकि वे पुनः स्वस्थ हो सकें और अपनी झिल्लियों को स्थिर कर सकें। कोशिकाओं की उत्तरजीविता और सफल जीन स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए यह एक अत्यंत महत्वपूर्ण चरण है।
Agrobacterium या लिपोसोम के माध्यम से जीन स्थानांतरण
पादप कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन करने की दो सामान्य विधियाँ हैं। इनमें आनुवंशिक सामग्री के वाहक के रूप में या तो ग्राम-ऋणात्मक जीवाणुओं के एक वंश, Agrobacterium, या लिपोसोम का उपयोग किया जाता है।
- Agrobacterium-मध्यस्थ सोनोपोरेशन: Agrobacterium tumefaciens एक जीवाणु है जिसका उपयोग आमतौर पर पादप आनुवंशिक अभियांत्रिकी में किया जाता है। इस विधि में, वांछित जीन युक्त प्लास्मिड DNA को Agrobacterium में प्रविष्ट कराया जाता है, जिसे फिर पादप कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। प्रोब-प्रकार के सोनिकेटर का उपयोग करके कोशिका निलंबन का सोनोपोरेशन किया जाता है। अल्ट्रासोनिक ऊर्जा Agrobacterium से पादप कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री के स्थानांतरण को बढ़ाती है। पौधों के आनुवंशिक संशोधन के लिए इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
- लिपोसोम-मध्यस्थ सोनोपोरेशन: लिपोसोम लिपिड-आधारित पुटिकाएँ हैं जो आनुवंशिक सामग्री का वहन कर सकती हैं। इस विधि में, प्लास्मिड DNA या अन्य न्यूक्लिक अम्लों से भरे लिपोसोम को पादप कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। पादप कोशिकाओं द्वारा लिपोसोम का ग्रहण सुगम बनाने के लिए प्रोब-प्रकार के सोनिकेटर का उपयोग करके सोनोपोरेशन किया जाता है। अल्ट्रासाउंड लिपोसोम की लिपिड द्विपरतों को विघटित करता है, जिससे आनुवंशिक सामग्री पादप कोशिकाओं में मुक्त होती है। यह तरीका पादप कोशिकाओं में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के अध्ययनों के लिए उपयोगी है।
सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) के वैज्ञानिक रूप से सिद्ध लाभ
सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) का उपयोग अनेक पादप प्रजातियों में किया गया है। पादप कोशिका संवर्धों का संक्षिप्त और अपेक्षाकृत हल्का अल्ट्रासोनिक उपचार सोनोपोरेशन उत्पन्न करता है, जिससे बाद में जीन वाहक के रूप में Agrobacterium का गहराई तक प्रवेश संभव होता है। नीचे आप SAAT के लाभकारी प्रभावों को दर्शाने वाले उदाहरणात्मक अध्ययन पढ़ सकते हैं।
सोनिकेटर UP200Ht सोनोपोरेशन के माध्यम से जीन ट्रांसफेक्शन के लिए
अश्वगंधा का अल्ट्रासाउंड-सहायित रूपांतरण
W. somnifera (जिसे अश्वगंधा या विंटर चेरी के नाम से जाना जाता है) में रूपांतरण दक्षता बढ़ाने के लिए, Dehdashti और सहकर्मियों (2016) ने एसीटोसिरिंगोन (AS) और सोनिकेशन के उपयोग की जाँच की।
एसीटोसिरिंगोन (AS) तीन चरणों में मिलाया गया: Agrobacterium का तरल संवर्धन, Agrobacterium संक्रमण और Agrobacterium के साथ पादप ऊतकखंडों का सह-संवर्धन। Agrobacterium के तरल संवर्धन में 75 μM AS मिलाना vir जीनों के प्रेरण के लिए इष्टतम पाया गया।
सोनिकेशन (SAAT) के अतिरिक्त उपयोग से उच्चतम जीन अभिव्यक्ति प्राप्त हुई। रोमिल जड़ों में gusA जीन की अभिव्यक्ति तब सर्वोत्तम पाई गई जब पत्तियों और प्ररोह शीर्षों का क्रमशः 10 और 20s तक सोनिकेशन किया गया। बेहतर बनाए गए प्रोटोकॉल की रूपांतरण दक्षता पत्ती और प्ररोह शीर्ष के ऊतकखंडों के मामले में क्रमशः 66.5 और 59.5% दर्ज की गई। अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में इस बेहतर प्रोटोकॉल की रूपांतरण दक्षता पत्तियों के लिए 2.5 गुना अधिक और प्ररोह शीर्षों के लिए 3.7 गुना अधिक पाई गई। सदर्न ब्लॉट विश्लेषणों ने W1-W4 लाइनों में gusA ट्रांसजीन की 1–2 प्रतियों की पुष्टि की, जबकि बेहतर प्रोटोकॉल से उत्पन्न W5 लाइन में ट्रांसजीन की 1–4 प्रतियाँ पाई गईं।
W. somnifera की पत्ती (a) और प्ररोह शीर्ष (b) के ऊतकखंडों की रूपांतरण आवृत्ति पर सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) की अवधि का प्रभाव
(अध्ययन और चित्र: © Dehdashti et al., 2016)
UP200St प्रोब-प्रकार का होमोजेनाइज़र सोनोपोरेशन और जीन ट्रांसफेक्शन के लिए
कपास का अल्ट्रासोनिक-सहायित रूपांतरण
Hussain et al. (2007) कपास के सोनिकेशन-सहायित रूपांतरण के लाभकारी प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं। कम आवृत्ति वाले अल्ट्रासाउंड से उत्पन्न ध्वनिक कैविटेशन पादप ऊतक की सतह पर और उसके नीचे सूक्ष्म घाव बनाता है (सोनोपोरेशन) और Agrobacterium को पादप ऊतक में अधिक गहराई तक तथा पूरे ऊतक में पहुँचने देता है। घाव बनने का यह तरीका ऊतक में अधिक गहराई में स्थित पादप कोशिकाओं के संक्रमित होने की संभावना बढ़ाता है। SAAT की रूपांतरण दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए GUS जीन की अभिव्यक्ति मापी गई। GUS रिपोर्टर प्रणाली एक रिपोर्टर जीन प्रणाली है, जो पादप आणविक जीवविज्ञान और सूक्ष्मजीवविज्ञान में विशेष रूप से उपयोगी है। SAAT के विभिन्न मापदंडों को समायोजित करके, परिपक्व भ्रूणों को ऊतकखंड के रूप में उपयोग करते हुए कपास में GUS की क्षणिक अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि की गई। ऊतकखंडों के ऊष्मायन के 24h बाद पहली बार GUS का पता चला और 48h तक GUS की अभिव्यक्ति बहुत तीव्र हो गई, जो सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) के बाद कपास के ऊतकखंड के सफल रूपांतरण का उपयोगी संकेतक बनी। विभिन्न रूपांतरण तकनीकों (अर्थात् बायोलिस्टिक, Agro, BAAT, SAAT) की तुलना में सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) ने रूपांतरण के कहीं अधिक बेहतर परिणाम दिखाए।
GUS की क्षणिक अभिव्यक्ति के आधार पर रूपांतरण प्रक्रिया का चयन। सोनिकेशन-सहायित Agrobacterium-मध्यस्थ रूपांतरण (SAAT) में क्षणिक अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूप से अधिक होती है।
(अध्ययन और चित्र: © Hussain et al., 2007)
सोनोपोरेशन और SAAT के लिए उच्च-प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक समाधान
Hielscher Ultrasonics को प्रयोगशालाओं, अनुसंधान सुविधाओं और बहुत अधिक प्रसंस्करण क्षमता वाले औद्योगिक उत्पादन के लिए उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिकेटरों के विकास और निर्माण का दीर्घकालिक अनुभव है। सूक्ष्मजीवविज्ञान और जीवन विज्ञान के लिए, Hielscher विशिष्ट ऊतकों और उनके उपचारों की अलग-अलग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है। अनेक नमूनों के एक साथ अल्ट्रासोनिक उपचार के लिए Hielscher मल्टीवेल प्लेटों हेतु UIP400MTP, 10 तक वायल (जैसे, Eppendorf ट्यूब) के सोनिकेशन हेतु VialTweeter या अल्ट्रासोनिक CupHorn प्रदान करता है। प्रयोगशाला होमोजेनाइज़र के रूप में प्रोब-प्रकार के अल्ट्रासोनिकेटर 50 से 400 वाट तक उपलब्ध हैं, जबकि औद्योगिक प्रणालियाँ 500 वाट से 16kW तक की शक्ति सीमा को कवर करती हैं।
कृपया हमसे संपर्क करें और हमें अपने अनुप्रयोग तथा प्रक्रिया संबंधी आवश्यकताओं के बारे में बताएँ। हमारे अनुभवी कर्मचारी आपकी जैविक प्रक्रिया के लिए सबसे उपयुक्त अल्ट्रासोनिकेटर की अनुशंसा करने में प्रसन्न होंगे।
नीचे दी गई तालिका हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| बैच आयतन | प्रवाह दर | अनुशंसित उपकरण |
|---|---|---|
| मल्टीवेल / माइक्रोटाइटर प्लेटें | n.a. | UIP400MTP |
| 10 तक वायल | n.a. | VialTweeter |
| 5 तक वायल/ट्यूब या 1 बड़ा पात्र | n.a. | CupHorn |
| 1 से 500mL | 10 से 200mL/min | UP100H |
| 10 से 2000mL | 20 से 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 से 20L | 0.2 से 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 से 100L | 2 से 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 से 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | अधिक | उपकरणों का समूह: UIP16000 |
हमसे संपर्क करें! / हमसे पूछें!
Hielscher Ultrasonics प्रयोगशाला, पायलट और औद्योगिक पैमाने पर मिश्रण अनुप्रयोगों, परिक्षेपण, पायसीकरण और निष्कर्षण के लिए उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का निर्माण करता है।
साहित्य / संदर्भ
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का निर्माण प्रयोगशाला से औद्योगिक आकार तक करता है।