अल्ट्रासोनिक्स का उपयोग करके प्लांट सेल में आनुवंशिक परिवर्तन

सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मीडिएटेड ट्रांसफॉर्मेशन (SAAT) ट्रांसपोर्टर के रूप में एग्रोबैक्टीरियम का उपयोग करके विदेशी जीन के साथ पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने का एक कुशल तरीका है। अल्ट्रासोनिक कैविटेशन सोनोपोरेशन का कारण बनता है, जिसे पौधे के ऊतकों के लक्षित सूक्ष्म घाव के रूप में वर्णित किया जा सकता है। इन अल्ट्रासोनिक रूप से सूक्ष्म घावों के माध्यम से, डीएनए और डीएनए वैक्टर को कुशलतापूर्वक सेल मैट्रिक्स में ले जाया जा सकता है।

सोनोपोरेशन – अल्ट्रासोनिक रूप से बढ़ाया सेल परिवर्तन

जब कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (लगभग 20kHz) सेल निलंबन के लिए लागू किया जाता है, ध्वनिक cavitation के प्रभाव सेल ऊतकों पर एक क्षणिक झिल्ली permeabilization कारण. इस अल्ट्रासोनिक प्रभाव को सोनोपोरेशन के रूप में जाना जाता है और इसका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों में जीन स्थानांतरण के लिए किया जाता है।
अल्ट्रासोनिकेशन के लाभ इसके गैर-थर्मल मैकेनिकल वर्किंग सिद्धांत पर आधारित होते हैं, जो सोनिकेशन को अक्सर अधिक बहुमुखी और सेल प्रकारों पर कम निर्भर करता है। सोनोपोरेशन का बहुमुखी अनुप्रयोग ट्रांसजेनिक पौधों के उपयोग की संभावना को खोलता है, जिसमें जटिल मानव चिकित्सीय प्रोटीन के जैव उत्पादन में महत्वपूर्ण क्षमता होती है। इस तरह के पौधे-आधारित बायोरिएक्टर आनुवंशिक रूप से आसानी से हेरफेर कर सकते हैं, मानव रोगजनकों के साथ संभावित संदूषण को रोक सकते हैं, परिवर्तन मध्यस्थता बैक्टीरिया (जैसे एग्रोबैक्टीरियम) को नुकसान नहीं पहुंचाते हैं, और जैव-संश्लेषण की एक सस्ती, प्रभावोत्पादक विधि हैं।

अल्ट्रासोनिक-असिस्टेड सेल ट्रांसफॉर्मेशन

सोनिकेशन एक ऐसी तकनीक है जो समाधान में कणों को उत्तेजित करने के लिए कम आवृत्ति वाली अल्ट्रासाउंड तरंगों को लागू करती है, समाधान मिश्रण करने के लिए, जिससे बड़े पैमाने पर हस्तांतरण और विघटन की दर बढ़ जाती है। इसके साथ ही, सोनिकेशन तरल पदार्थों से भंग गैसों को हटा सकता है। पौधे-परिवर्तन में, सोनिकेशन पौधे के ऊतकों पर माइक्रोवाउंड के गठन का कारण होगा और पौधे प्रोटोप्लास्ट में नग्न डीएनए के वितरण को बढ़ाएगा।

आनुवंशिक परिवर्तन के लिए, सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) पसंदीदा तरीका है और नग्न डीएनए और डीएनए वैक्टर को सीधे प्रोटोप्लास्ट में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सोनिकेशन की तुलना में काफी अधिक दक्षता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि सोनिकेशन असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) का उपयोग अल्ट्रासाउंड तरंगों और परिणामस्वरूप ध्वनिक गुहिकायन द्वारा पौधों की कोशिकाओं पर यांत्रिक व्यवधान और घावों के गठन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। एक छोटा अल्ट्रासोनिक उपचार एक्सप्लांट्स की सतह पर सूक्ष्म घाव बनाता है। चूंकि घायल कोशिकाएं पौधे के ऊतकों के गहरे हिस्से में एग्रोबैक्टीरियम के प्रवेश की अनुमति देंगी, इस प्रकार पौधों की कोशिकाओं के संक्रमित होने की संभावना बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, स्रावित फेनोलिक यौगिक परिवर्तन को बढ़ाते हैं। अल्ट्रासोनिक रूप से उत्पन्न सूक्ष्म घाव बैक्टीरिया द्वारा एक्सप्लांट पैठ को भी अधिक संभव बनाते हैं। SAAT का उपयोग पौधों की प्रजातियों में आनुवंशिक परिवर्तन के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, जिसे विशेष रूप से एग्रोबैक्टीरियम के प्रतिरोधी माना जाता है।
एक बहुत ही सरल और सस्ती विधि होने के साथ-साथ एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन स्थानांतरण की महत्वपूर्ण वृद्धि SAAT के प्रमुख लाभ हैं। चेनोपोडियम रूब्रम एल और बीटा वल्गारिस एल के परिवर्तन में एसएएटी के सफल अनुप्रयोग के अलावा, इस दृष्टिकोण को निकोटियाना टैबाकम में पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोलाई जंगली प्रकार की गर्मी-लेबिल होलोटॉक्सिन और एस्चेरिचिया कोलाई उत्परिवर्ती एलटी वैक्सीन सहायक के उत्पादन में भी लागू किया गया है, जिसमें उच्चतम प्रणालीगत एलटी-बी-विशिष्ट आईजीजी टाइटर्स पक्षियों में पाए गए थे।
, 2016; एम. क्लिमेक-चोडाका और आर. बारांस्की, 2014)

पादप कोशिकाओं में सोनोपोरेशन के माध्यम से जीन स्थानांतरण के लिए सामान्य प्रक्रिया

1. आनुवंशिक सामग्री की तैयारी: उस आनुवंशिक सामग्री को तैयार करके शुरू करें जिसे आप पौधों की कोशिकाओं में पेश करना चाहते हैं। यह प्लास्मिड डीएनए, आरएनए या अन्य न्यूक्लिक एसिड हो सकता है।
2. पादप कोशिका पृथक्करण: उन पौधों की कोशिकाओं को अलग करें जिन्हें आप लक्षित करना चाहते हैं। आपके प्रयोग के आधार पर, इन कोशिकाओं को पौधे के ऊतकों या संस्कृतियों से अलग किया जा सकता है।
3. सेल सस्पेंशन: एक उपयुक्त माध्यम या बफर में संयंत्र कोशिकाओं को निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि कोशिकाएं स्वस्थ हैं और जीन तेज करने के लिए अनुकूल स्थिति में हैं।
4. अपना सोनिकेटर सेटअप करें: इस तरह के आयाम, समय, ऊर्जा, और तापमान के रूप में sonication पूर्व सेटिंग मापदंडों द्वारा अपने जांच प्रकार sonicator तैयार करें. सेल निलंबन में अल्ट्रासोनिक जांच विसर्जित करें।
5. सॉनिकेशन: सोनीशन प्रक्रिया शुरू करें। जांच टिप का तेजी से दोलन तरल में गुहिकायन बुलबुले उत्पन्न करता है। अल्ट्रासोनिक तरंगों के कारण ये बुलबुले फैलते और ढह जाते हैं, जिससे निलंबन में यांत्रिक बल और माइक्रोस्ट्रीमिंग होती है।
6. सोनोपोरेशन: गुहिकायन द्वारा उत्पन्न यांत्रिक बल और माइक्रोस्ट्रीमिंग पौधों की कोशिकाओं की झिल्लियों में अस्थायी रूप से छिद्र और छेद बनाते हैं। निलंबन में मौजूद आनुवंशिक सामग्री इन छिद्रों के माध्यम से पौधों की कोशिकाओं में प्रवेश कर सकती है।
7. अंडे सेना: सोनोपोरेशन उपचार के बाद, पौधों की कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ताकि वे अपनी झिल्ली को ठीक कर सकें और स्थिर कर सकें। सेल अस्तित्व और सफल जीन स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है।

एग्रोबैक्टीरियम या लिपोसोम्स के माध्यम से जीन स्थानांतरण

पादप कोशिका को ट्रांसफ़ेक्ट करने के दो सामान्य रूप हैं। वे या तो एग्रोबैक्टीरियम, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक जीनस, या आनुवंशिक सामग्री के वाहक के रूप में लिपोसोम का उपयोग करते हैं।

• एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता सोनोपोरेशन: एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स एक जीवाणु है जिसका उपयोग आमतौर पर प्लांट जेनेटिक इंजीनियरिंग में किया जाता है। इस विधि में, वांछित जीन युक्त प्लास्मिड डीएनए को एग्रोबैक्टीरियम में पेश किया जाता है, जिसे बाद में पौधों की कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। सेल निलंबन एक जांच-प्रकार के सोनिकेटर का उपयोग करके सोनोपोरेशन के अधीन है। अल्ट्रासोनिक ऊर्जा एग्रोबैक्टीरियम से पौधों की कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री के हस्तांतरण को बढ़ाती है। पौधों के आनुवंशिक संशोधन के लिए इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
• लिपोसोम-मध्यस्थता सोनोपोरेशन: लिपोसोम लिपिड-आधारित पुटिका हैं जो आनुवंशिक सामग्री ले जा सकते हैं। इस विधि में, प्लास्मिड डीएनए या अन्य न्यूक्लिक एसिड से भरे लिपोसोम को पौधों की कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। एक जांच-प्रकार के सोनिकेटर का उपयोग करके सोनोपोरेशन को पौधे की कोशिकाओं द्वारा लिपोसोम के उत्थान को सुविधाजनक बनाने के लिए नियोजित किया जाता है। अल्ट्रासाउंड लिपोसोम्स के लिपिड बाइलेयर को बाधित करता है, आनुवंशिक सामग्री को पौधों की कोशिकाओं में छोड़ देता है। यह दृष्टिकोण पौधों की कोशिकाओं में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए उपयोगी है।

सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (SAAT) के वैज्ञानिक रूप से सिद्ध लाभ

सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मीडिएटेड ट्रांसफॉर्मेशन (SAAT) को कई पौधों की प्रजातियों पर लागू किया गया है। प्लांट सेल संस्कृतियों का एक छोटा और अपेक्षाकृत हल्का अल्ट्रासोनिक उपचार सोनोपोरेशन का कारण बनता है, जो बाद में जीन ट्रांसपोर्टर के रूप में एग्रोबैक्टीरियम की गहरी पैठ की अनुमति देता है। नीचे आप SAAT के लाभकारी प्रभावों को प्रदर्शित करने वाले अनुकरणीय अध्ययन पढ़ सकते हैं।

अश्वगंधा का अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त परिवर्तन

डब्ल्यू सोमनीफेरा (जिसे अश्वगंधा या शीतकालीन चेरी के रूप में जाना जाता है) में परिवर्तन दक्षता में सुधार करने के लिए, देहदाश्ती और सहयोगियों (2016) ने एसीटोसिरिंगोन (एएस) और सोनिकेशन के उपयोग की जांच की।
एसिटोसिरिंगोन (एएस) को तीन चरणों में जोड़ा गया था: एग्रोबैक्टीरियम तरल संस्कृति, एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण और एग्रोबैक्टीरियम के साथ एक्सप्लांट्स का सह-संस्कृति। एग्रोबैक्टीरियम तरल संवर्धन में 75 माइक्रोन एएस की वृद्धि वीर जीन के प्रेरण के लिए इष्टतम पाई गई।
सोनिकेशन (एसएएटी) के अतिरिक्त अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप उच्चतम जीन अभिव्यक्ति हुई। बालों वाली जड़ों में गसा जीन अभिव्यक्ति सबसे अच्छी पाई गई जब पत्तियों और शूट युक्तियों को क्रमशः 10 और 20 के दशक के लिए सोनिकेट किया गया था। बेहतर प्रोटोकॉल की परिवर्तन दक्षता क्रमशः पत्ती और शूट टिप एक्सप्लांट के मामले में 66.5 और 59.5% दर्ज की गई थी। जब अन्य प्रोटोकॉल के साथ तुलना में इस बेहतर प्रोटोकॉल के परिवर्तन दक्षता पत्तियों के लिए 2.5 गुना अधिक और शूट सुझावों के लिए 3.7 गुना अधिक पाया गया. दक्षिणी धब्बा विश्लेषण ने W1-W4 लाइनों में gusA ट्रांसजीन की 1-2 प्रतियों की पुष्टि की, जबकि बेहतर प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न लाइन W5 में 1-4 ट्रांसजीन प्रतियों का पता लगाया गया।

सोनीकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) की अवधि का प्रभाव डब्ल्यू सोम्निफेरा पत्ती (ए) और शूट टिप (बी) एक्सप्लांट्स की परिवर्तन आवृत्ति पर(अध्ययन और ग्राफिक: © देहदाश्ती एट अल।

कपास के अल्ट्रासोनिक रूप से सहायता प्राप्त परिवर्तन

हुसैन एट अल (2007) सोनिकेशन-असिस्टेड कॉटन ट्रांसफॉर्मेशन के लाभकारी प्रभावों को प्रदर्शित करता है। कम आवृत्ति वाले अल्ट्रासाउंड के कारण ध्वनिक गुहिकायन पौधे के ऊतकों (सोनोपोरेशन) की सतह पर और नीचे सूक्ष्म घाव बनाता है और एग्रोबैक्टीरियम को पूरे पौधे के ऊतकों में गहराई से और पूरी तरह से यात्रा करने की अनुमति देता है। इस घायल फैशन से ऊतक में गहराई से पड़ी पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने की संभावना बढ़ जाती है। एसएएटी की परिवर्तन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, जीयूएस जीन अभिव्यक्ति को मापा गया था। जीयूएस रिपोर्टर सिस्टम एक रिपोर्टर जीन सिस्टम है, जो विशेष रूप से प्लांट आणविक जीव विज्ञान और माइक्रोबायोलॉजी में उपयोगी है। विभिन्न SAAT मापदंडों को समायोजित करना, एक्सप्लांट के रूप में परिपक्व भ्रूण का उपयोग करके कपास में जीयूएस क्षणिक अभिव्यक्ति को काफी बढ़ाया गया था। जीयूएस को पहली बार एक्सप्लांट्स के इनक्यूबेशन के बाद 24 घंटे का पता चला था और 48h तक, जीयूएस अभिव्यक्ति बहुत तीव्र थी जो सोनिकेशन असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) के बाद कपास एक्सप्लांट के सफल परिवर्तन के एक उपयोगी संकेतक के रूप में कार्य करती थी। विभिन्न परिवर्तन तकनीकों (अर्थात् बायोलिस्टिक, एग्रो, बैट, एसएएटी), सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (एसएएटी) की तुलना ने परिवर्तन के अब तक के सर्वोत्तम परिणाम दिखाए।

जीयूएस की क्षणिक अभिव्यक्ति के आधार पर परिवर्तन प्रक्रिया का विकल्प। सोनिकेशन-असिस्टेड एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन (SAAT) काफी अधिक क्षणिक अभिव्यक्ति दिखाता है।(अध्ययन और ग्राफिक: © हुसैन एट अल।

Sonoporation और SAAT के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक समाधान

Hielscher Ultrasonics लंबे समय से प्रयोगशालाओं, अनुसंधान सुविधाओं के साथ-साथ बहुत उच्च थ्रूपुट के साथ औद्योगिक उत्पादन के लिए उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर के विकास और निर्माण में अनुभवी है। सूक्ष्म जीव विज्ञान और जीवन विज्ञान के लिए, Hielscher विशिष्ट ऊतकों और उनके उपचार के लिए आवश्यक विभिन्न आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए विभिन्न समाधान प्रदान करता है। कई नमूनों के एक साथ ultrasonication के लिए Hielscher मल्टीवेल प्लेटों के लिए UIP400MTP प्रदान करता है, 10 शीशियों (जैसे, Eppendorf ट्यूब) या अल्ट्रासोनिक CupHorn के sonication के लिए VialTweeter। प्रोब-टाइप अल्ट्रासोनिकेटर लैब होमोजेनाइज़र के रूप में 50 से 400 वाट तक उपलब्ध हैं, जबकि औद्योगिक सिस्टम 500 वाट से 16kW तक की बिजली रेंज को कवर करते हैं।
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