કોષ લાયસિસ માટે સોનિકેશન: કોષ વિઘટન અને નિષ્કર્ષણ
આધુનિક બાયોટેક પ્રયોગશાળાઓમાં અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ નમૂના તૈયાર કરવા માટે વ્યાપકપણે વપરાતી તકનીક છે. તેનો મુખ્ય હેતુ પ્રોટીન, ન્યુક્લિક એસિડ અથવા કોષાંગો જેવા અંતઃકોષીય ઘટકોને મુક્ત કરવા માટે કોષપટલો અથવા આખા કોષોનું વિઘટન કરવાનો છે. રોજિંદા પ્રયોગશાળાના કાર્યમાં આનો અર્થ એ છે કે નિયંત્રિત કોષ વિઘટન અને જૈવઅણુઓના કાર્યક્ષમ નિષ્કર્ષણ માટે સોનિકેશન એક પ્રમાણભૂત પદ્ધતિ છે. સોનિકેટરોનો મુખ્ય લાભ અલ્ટ્રાસાઉન્ડની તીવ્રતા, સ્પંદન અને તાપમાન નિયંત્રણ સહિતનાં મહત્ત્વપૂર્ણ પ્રક્રિયા પરિમાણોને ચોકસાઈપૂર્વક સમાયોજિત કરવાની તેમની ક્ષમતામાં રહેલો છે. આ નિયંત્રણ સંશોધકોને સંવેદનશીલ જૈવઅણુઓને થતું ઉષ્મીય અથવા યાંત્રિક નુકસાન ન્યૂનતમ રાખીને વિશ્વસનીય લાયસિસ પ્રાપ્ત કરવા દે છે, જેના પરિણામે સૌમ્ય છતાં અત્યંત કાર્યક્ષમ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયા મળે છે.
સોનિકેટરોનો ઉપયોગ કરીને કોષ લાયસિસ
અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસમાં કોષપટલોનું વિઘટન કરવા અને અંતઃકોષીય અણુઓને મુક્ત કરવા માટે ધ્વનિક કેવિટેશનનો ઉપયોગ થાય છે. Hielscher Ultrasonics પરંપરાગત પ્રોબ પ્રકારના સોનિકેટર ઉપરાંત જંતુરહિત પ્રક્રિયા માટે બહુવિધ નમૂનાઓના સોનિકેટરો પણ પ્રદાન કરે છે: બહુવિધ ટ્યુબો અને વાયલો માટે VialTweeter અને પ્રમાણભૂત માઇક્રોપ્લેટો માટે 96-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP.
Hielscher Ultrasonics નમૂના તૈયારી અને ક્લિનિકલ વિશ્લેષણ માટે શક્તિશાળી બિનસંપર્ક સોનિકેટરો પૂરા પાડે છે. મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn અને GDmini2 ફ્લો સોનિકેટર જંતુરહિત પરિસ્થિતિઓમાં નમૂનાઓ પર પ્રક્રિયા કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરો UP100H (100 વૉટ) અને UP400St (400 વૉટ): કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ માટે સોનિકેશન.
કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ માટે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરો
| અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણનો પ્રકાર | મુખ્ય ઉપયોગ | નમૂનાનું આયતન | સામાન્ય ઉપયોગનું ઉદાહરણ | લાભો | મૉડેલોનાં ઉદાહરણો |
|---|---|---|---|---|---|
| પ્રોબ પ્રકારના સોનિકેટરો | એક નમૂનાનું સોનિકેશન | 0.1 mL થી ~1000 mL | કોષ લાયસિસ, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ, DNA/RNA ખંડન | ઊર્જાનું ચોક્કસ નિયંત્રણ; વિવિધ સોનોટ્રોડો; નાનાથી મધ્યમ કદના નમૂનાઓ માટે શ્રેષ્ઠ | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | બહુવિધ સીલબંધ વાયલો પર સમાંતર પ્રક્રિયા | 8–10 વાયલો (દરેકમાં ~1–20 mL) | બહુવિધ કોષ નિલંબનોનું પ્રમાણિત લાયસિસ | એકસમાન સોનિકેશન; નમૂનાઓ વચ્ચેનું પરસ્પર દૂષણ ટાળે છે; પુનરુત્પાદનક્ષમ પરિણામો | VialTweeter, CupHorn |
| 96-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર | મલ્ટિવેલ અને માઇક્રોટાઇટર પ્લેટોનું સોનિકેશન | માઇક્રોપ્લેટ સ્વરૂપ | ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળું સ્ક્રીનિંગ, પ્રોટિઓમિક્સ, કોષ પરીક્ષણો | બધા વેલમાં એકસાથે, સમાન સોનિકેશન; બહુવિધ નમૂનાઓની કાર્યપ્રણાલીઓ માટે આદર્શ | UIP400MTP |
| ફ્લો સેલ રિએક્ટરો | વધુ આયતન માટે સતત સોનિકેશન | >1 L, પ્રક્રિયાનું પ્રમાણ વધારી શકાય તેવું | ઔદ્યોગિક પાયે કોષ વિઘટન, નિષ્કર્ષનું ઉત્પાદન | સતત પ્રક્રિયા; પ્રક્રિયાનું પ્રમાણ વધારી શકાય છે; સંપૂર્ણ પ્રક્રિયા નિયંત્રણ (કંપવિસ્તાર, દબાણ, તાપમાન) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + ફ્લો સેલ |
| જંતુરહિત / પરોક્ષ સોનિકેશન પ્રણાલીઓ | દૂષણમુક્ત નમૂના પ્રક્રિયા | વાયલ/ટ્યુબ/માઇક્રોપ્લેટ પર આધારિત | સંવેદનશીલ નમૂનાઓ, જંતુરહિત વાતાવરણ, નિયમનકારી આવશ્યકતાઓ હેઠળની પરિસ્થિતિઓ | પ્રોબનો સંપર્ક થતો નથી; અગાઉના નમૂનાના અવશેષોનું વહન ટાળે છે; સફાઈ માટે ન્યૂનતમ પ્રયત્ન | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
કોષ લાયસિસ માટે સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરવાના લાભો
કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણની અન્ય પદ્ધતિઓની સરખામણીમાં અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસના ઘણા લાભો છે:
- ઝડપ: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ એક ઝડપી પદ્ધતિ છે, જે ગણતરીની સેકન્ડોમાં કોષોને તોડીને ખોલી શકે છે. આ હોમોજેનાઇઝેશન, હિમીકરણ–વિગલન અથવા બીડ-મિલિંગ જેવી અન્ય પદ્ધતિઓ કરતાં ઘણી ઝડપી છે.
- કાર્યક્ષમતા: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણનો ઉપયોગ નાના, મોટા અથવા બહુવિધ નમૂનાઓ પર એકસાથે પ્રક્રિયા કરવા માટે થઈ શકે છે, જેના કારણે તે નાના નમૂનાઓ પર અલગ અલગ પ્રક્રિયા કરવી પડે તેવી અન્ય પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ કાર્યક્ષમ બને છે.
- રસાયણમુક્ત: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ એક બિનઆક્રમક પદ્ધતિ છે, જેમાં તીવ્ર રસાયણો અથવા ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ જરૂરી નથી. આ કારણે, કોષની અંદરના પદાર્થોની અખંડિતતા જાળવવી જરૂરી હોય તેવા ઉપયોગો માટે તે આદર્શ બને છે. નમૂનાઓનું અનિચ્છનીય દૂષણ ટાળી શકાય છે.
- ઉચ્ચ ઉપજ: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ દ્વારા DNA, RNA અને પ્રોટીન સહિતના કોષીય પદાર્થોની ઊંચી ઉપજ મેળવી શકાય છે. તેનું કારણ એ છે કે ઉચ્ચ આવૃત્તિનાં ધ્વનિતરંગો કોષભિત્તિઓને તોડીને ખોલે છે અને અંદરના પદાર્થોને આસપાસના દ્રાવણમાં મુક્ત કરે છે.
- તાપમાન નિયંત્રણ: અદ્યતન અલ્ટ્રાસોનિકેટરો નમૂનાના તાપમાનનું ચોક્કસ નિયંત્રણ શક્ય બનાવે છે. Hielscher ડિજિટલ સોનિકેટરો જોડીને લગાવી શકાય તેવા તાપમાન સેન્સર અને તાપમાનની દેખરેખ માટેના સોફ્ટવેરથી સજ્જ હોય છે.
- પુનરુત્પાદનક્ષમ: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ માટેની કાર્યવિધિઓ સરળતાથી પુનરુત્પાદિત કરી શકાય છે અને સરળ રેખીય સ્કેલ-અપ દ્વારા નમૂનાના જુદા જુદા મોટા કે નાના કદને અનુરૂપ પણ બનાવી શકાય છે.
- બહુઉપયોગી: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણનો ઉપયોગ બેક્ટેરિયા, યીસ્ટ, ફૂગ, વનસ્પતિ અને સસ્તન પ્રાણીઓના કોષો સહિત વિવિધ પ્રકારના કોષોના નિષ્કર્ષણ માટે કરી શકાય છે. તેનો ઉપયોગ પ્રોટીન, DNA, RNA અને લિપિડ સહિત વિવિધ પ્રકારના અણુઓના નિષ્કર્ષણ માટે પણ કરી શકાય છે.
- અસંખ્ય નમૂનાઓની એકસાથે તૈયારી: Hielscher Ultrasonics બરાબર એકસરખી પ્રક્રિયા પરિસ્થિતિઓમાં અસંખ્ય નમૂનાઓ પર સરળતાથી પ્રક્રિયા કરવા માટે અનેક ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. આથી નમૂનાની તૈયારીમાં લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણનું પગલું અત્યંત કાર્યક્ષમ બને છે અને સમયની બચત થાય છે.
- ઉપયોગમાં સરળ: અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણનાં ઉપકરણો ઉપયોગમાં સરળ છે અને તેમના માટે ખૂબ ઓછી તાલીમની જરૂર પડે છે. આ ઉપકરણો આર્થિક રીતે પણ કિફાયતી છે, કારણ કે તેમાં એક જ વખતનું રોકાણ કરવાનું હોય છે અને એકવાર વાપરીને ફેંકી દેવાની સામગ્રી ફરીથી ખરીદવાની જરૂર પડતી નથી. આથી તે વિવિધ સંશોધકો અને પ્રયોગશાળાઓ માટે આકર્ષક બને છે.
એકંદરે, અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ એ કોષીય ઘટકોના નિષ્કર્ષણ માટેની ઝડપી, કાર્યક્ષમ, ચોકસાઈપૂર્વક નિયંત્રિત કરી શકાય તેવી અને બહુઉપયોગી પદ્ધતિ છે. વૈકલ્પિક પદ્ધતિઓની સરખામણીએ તેના ફાયદાઓ તેને સંશોધન અને ઔદ્યોગિક ઉપયોગોની વિશાળ શ્રેણી માટે આકર્ષક પસંદગી બનાવે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસનો કાર્યસિદ્ધાંત
અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણમાં કોષોનું વિઘટન કરવા અને તેમના ઘટકોનું નિષ્કર્ષણ કરવા માટે ઉચ્ચ આવૃત્તિનાં ધ્વનિતરંગોનો ઉપયોગ થાય છે. ધ્વનિતરંગો આસપાસના પ્રવાહીમાં દબાણના ફેરફારો સર્જે છે, જેના કારણે કેવિટેશન તરીકે ઓળખાતી પ્રક્રિયામાં નાના પરપોટા બને છે અને તૂટી પડે છે. આ પરપોટા સ્થાનિક સ્તરે અત્યંત તીવ્ર યાંત્રિક બળો ઉત્પન્ન કરે છે, જે કોષોને તોડી ખોલી શકે છે અને તેમના ઘટકોને આસપાસના દ્રાવણમાં મુક્ત કરી શકે છે.
અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો ઉપયોગ કરીને કોષ લાયસિસ કરવામાં સામાન્ય રીતે નીચેનાં પગલાં સામેલ હોય છે:
- નમૂનાને પ્રવાહી બફર સાથે ટ્યુબ અથવા પાત્રમાં મૂકવામાં આવે છે.
- નમૂનામાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ દાખલ કરવામાં આવે છે અને આશરે 20–30 kHz આવૃત્તિનાં ધ્વનિતરંગો લાગુ કરવામાં આવે છે.
- અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગો આસપાસના પ્રવાહીમાં દોલન અને કેવિટેશન સર્જે છે, જેનાથી સ્થાનિક બળો ઉત્પન્ન થાય છે અને તે કોષોને તોડી ખોલે છે તથા તેમના ઘટકોને મુક્ત કરે છે.
- કોઈપણ કોષીય અવશેષોને દૂર કરવા માટે નમૂનાનું સેન્ટ્રિફ્યુગેશન અથવા ગાળણ કરવામાં આવે છે અને ત્યારબાદના વિશ્લેષણ માટે નિષ્કર્ષિત ઘટકો એકત્રિત કરવામાં આવે છે.
સામાન્ય લાયસિસ પદ્ધતિઓના ગેરફાયદા
પ્રયોગશાળાઓમાં કામ કરતી વખતે તમે પરંપરાગત યાંત્રિક અથવા રાસાયણિક લાયસિસ કાર્યવિધિઓનો ઉપયોગ કરીને કોષ લાયસિસ કરવાની મુશ્કેલીનો અનુભવ કદાચ પહેલેથી જ કર્યો હશે.
- યાંત્રિક લાયસિસ: યાંત્રિક લાયસિસ પદ્ધતિઓ, જેમ કે ખલ અને મુસળથી પીસવું અથવા ફ્રેન્ચ પ્રેસ, બીડ મિલ કે રોટર-સ્ટેટર સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને સમાનાંગીકરણ કરવું, તેમાં ઘણીવાર ચોક્કસ નિયંત્રણ અને ગોઠવણના વિકલ્પોનો અભાવ હોય છે. આનો અર્થ એ છે કે મિલિંગ અને પીસવાની પ્રક્રિયાથી ઝડપથી ગરમી અને કર્તન બળો ઉત્પન્ન થઈ શકે છે, જે નમૂનાને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે અને પ્રોટીનનું વિકૃતીકરણ કરી શકે છે. આ પદ્ધતિઓમાં સમય પણ વધુ લાગી શકે છે અને પ્રારંભિક સામગ્રીની મોટી માત્રાની જરૂર પડી શકે છે.
- રાસાયણિક લાયસિસ: રાસાયણિક લાયસિસ પદ્ધતિઓ, જેમ કે ડિટર્જન્ટ આધારિત લાયસિસ, લિપિડના દ્વિસ્તરને વિક્ષેપિત કરીને અને પ્રોટીનનું વિકૃતીકરણ કરીને નમૂનાને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે. તેમાં અનેક પગલાંની જરૂર પણ પડી શકે છે અને અવશેષ દૂષકો રહી શકે છે, જે ત્યારબાદના ઉપયોગોમાં ખલેલ પહોંચાડે છે. ડિટર્જન્ટની શ્રેષ્ઠ માત્રા નક્કી કરવી એ વધારાનો પડકાર છે.
- થીજવવા અને પીગળાવવાનાં ચક્રો: થીજવવા અને પીગળાવવાનાં ચક્રોથી કોષપટલો ફાટી શકે છે, પરંતુ વારંવારનાં ચક્રોથી પ્રોટીનનું વિકૃતીકરણ અને વિઘટન પણ થઈ શકે છે. આ પદ્ધતિમાં અનેક ચક્રોની જરૂર પણ પડી શકે છે, જેમાં સમય વધુ લાગી શકે છે અને ઘણીવાર ઓછી ઉપજ મળે છે.
- ઉત્સેચકીય લાયસિસ: ઉત્સેચકીય કોષલયની પદ્ધતિઓ ચોક્કસ પ્રકારના કોષો માટે વિશિષ્ટ હોઈ શકે છે અને તેમાં અનેક પગલાં જરૂરી હોય છે, જેના કારણે તે સમય લેતી હોય છે. તે કચરો પણ ઉત્પન્ન કરે છે અને નમૂનાનું વિઘટન ટાળવા માટે તેમનું કાળજીપૂર્વક અનુકૂલન કરવું જરૂરી હોય છે. ઉત્સેચકીય કોષલયની કિટ ઘણીવાર મોંઘી હોય છે. જો તમારી હાલની ઉત્સેચકીય કોષલયની પ્રક્રિયા અપૂરતાં પરિણામો આપતી હોય, તો કોષ વિક્ષેપને વધુ તીવ્ર બનાવવા માટે સહક્રિયાત્મક પદ્ધતિ તરીકે સોનિકેશન લાગુ કરી શકાય છે.
કોષલયની પરંપરાગત યાંત્રિક અને રાસાયણિક પદ્ધતિઓની સરખામણીમાં, સોનિકેશન કોષ વિઘટન માટેનું ખૂબ જ કાર્યક્ષમ અને વિશ્વસનીય સાધન છે, જે સોનિકેશનનાં પરિમાણો પર સંપૂર્ણ નિયંત્રણ રાખવાની સુવિધા આપે છે. આ પદાર્થોના મુક્ત થવામાં ઉચ્ચ પસંદગીક્ષમતા અને ઉત્પાદનની શુદ્ધતા સુનિશ્ચિત કરે છે. [cf. Balasundaram et al., 2009]
તે તમામ પ્રકારના કોષો માટે યોગ્ય છે અને નાના તેમજ મોટા પાયે સરળતાથી લાગુ કરી શકાય છે – હંમેશાં નિયંત્રિત પરિસ્થિતિઓમાં. અલ્ટ્રાસોનિકેટરોને સાફ કરવાનું સરળ છે. અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરમાં હંમેશાં સ્થાપિત અવસ્થામાં જ સફાઈ (CIP) અને સ્થાપિત અવસ્થામાં જ નિર્જીવીકરણ (SIP) કરવાની સુવિધા હોય છે. સોનોટ્રોડ ઘન ટાઇટેનિયમ હોર્નનો બનેલો હોય છે, જેને લૂછી શકાય છે અથવા પાણી કે દ્રાવકથી ધોઈ શકાય છે (કાર્યકારી માધ્યમના આધારે). અલ્ટ્રાસોનિકેટરોની મજબૂતાઈને કારણે તેમની જાળવણી લગભગ નહિવત્ હોય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક કોષલય અને કોષ વિક્ષેપ
સામાન્ય રીતે, પ્રયોગશાળામાં નમૂનાઓના કોષલયમાં 15 સેકન્ડથી 2 મિનિટ જેટલો સમય લાગે છે. કંપવિસ્તાર અને સોનિકેશનનો સમય ગોઠવીને તેમજ યોગ્ય સાધન પસંદ કરીને સોનિકેશનની તીવ્રતાને ખૂબ જ સરળતાથી સમાયોજિત કરી શકાય છે, તેથી કોષની રચના અને કોષલયના હેતુના આધારે કોષપટલોને ખૂબ જ સૌમ્ય રીતે અથવા ખૂબ જ અચાનક વિક્ષેપિત કરી શકાય છે (દા.ત. DNA નિષ્કર્ષણ માટે વધુ સૌમ્ય સોનિકેશન જરૂરી છે, જ્યારે બેક્ટેરિયામાંથી પ્રોટીનના સંપૂર્ણ નિષ્કર્ષણ માટે વધુ તીવ્ર અલ્ટ્રાસાઉન્ડ ઉપચાર જરૂરી છે). પ્રક્રિયા દરમિયાન તાપમાનનું નિરીક્ષણ એકીકૃત તાપમાન સંવેદક દ્વારા કરી શકાય છે અને શીતલન (બરફનું સ્નાન અથવા શીતલન જેકેટવાળા ફ્લો સેલ) દ્વારા અથવા પલ્સ મોડમાં સોનિકેશન કરીને તેને સરળતાથી નિયંત્રિત કરી શકાય છે. પલ્સ મોડના સોનિકેશન દરમિયાન, 1–15 સેકન્ડના ટૂંકા સોનિકેશન બર્સ્ટ ચક્રો વચ્ચેના વધુ લાંબા વિરામો દરમિયાન ઉષ્મા વિસર્જન અને શીતલન શક્ય બને છે.
અલ્ટ્રાસાઉન્ડથી ચાલતી તમામ પ્રક્રિયાઓ સંપૂર્ણપણે પુનરુત્પાદનક્ષમ છે અને તેમનું પ્રમાણ રેખીય રીતે વધારી શકાય છે.
VialTweeter અસંખ્ય નમૂનાઓની એકસાથે, એકસમાન અને ઝડપી નિર્જીવ તૈયારી માટેનું અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર છે.
- કોષ નિલંબનની તૈયારી: સમાનાંગીકરણ કરીને કોષોના પેલેટને બફર દ્રાવણમાં સંપૂર્ણપણે નિલંબિત કરવા જરૂરી છે (પછીના વિશ્લેષણ, દા.ત. ચોક્કસ ક્રોમેટોગ્રાફી પદ્ધતિ, સાથે સુસંગત હોય તેવું બફર દ્રાવણ પસંદ કરો). જો જરૂરી હોય તો લાઇસોઝાઇમ અને/અથવા અન્ય ઉમેરણો ઉમેરો (તે પણ અલગ કરવાની/શુદ્ધીકરણની પદ્ધતિઓ સાથે સુસંગત હોવાં જરૂરી છે). સંપૂર્ણ નિલંબન પ્રાપ્ત થાય ત્યાં સુધી હળવા સોનિકેશન હેઠળ દ્રાવણને હળવેથી મિશ્રિત કરો/સમાનાંગી બનાવો.
સોનિકેશન સાથે સંયોજિત લાઇસોઝાઇમની સહક્રિયાત્મક અસરો વિશે વધુ વાંચો! - અલ્ટ્રાસોનિક કોષલય: નમૂનાને બરફના સ્નાનમાં મૂકો. કોષ વિક્ષેપ માટે, નિલંબનને 60–90 સેકન્ડના બર્સ્ટમાં સોનિકેટ કરો (તમારા સોનિકેટરના પલ્સ મોડનો ઉપયોગ કરીને).
- અલગીકરણ: લાઇસેટનું અપકેન્દ્રણ કરો (દા.ત. 10,000 x g પર 10 મિનિટ સુધી; 4degC પર). કોષોના પેલેટથી ઉપરનું પ્રવાહી કાળજીપૂર્વક અલગ કરો. ઉપરનું પ્રવાહી એ કુલ કોષ લાઇસેટ છે. ઉપરના પ્રવાહીનું ગાળણ કર્યા પછી, તમને દ્રાવ્ય કોષીય પ્રોટીન ધરાવતું નિર્મળ પ્રવાહી મળે છે.
જીવવિજ્ઞાન અને બાયોટેકનોલોજીમાં અલ્ટ્રાસોનિકેટરોના સૌથી સામાન્ય ઉપયોગો આ પ્રમાણે છે:
- કોષીય અર્કની તૈયારી
- યીસ્ટ, બેક્ટેરિયા, વનસ્પતિ કોષો, નરમ અથવા સખત કોષીય પેશી અને ન્યુક્લિક પદાર્થનો વિક્ષેપ
- પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ
- ઉત્સેચકોની તૈયારી અને અલગીકરણ
- પ્રતિજનોનું ઉત્પાદન
- DNAનું નિષ્કર્ષણ અને/અથવા લક્ષિત ખંડન
- લિપોઝોમની તૈયારી
પ્રોબ પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર દ્વારા કોષ વિક્ષેપ એ નમૂના તૈયાર કરવાની કાર્યક્ષમ પદ્ધતિ છે.
અલ્ટ્રાસાઉન્ડના વિવિધ ઉપયોગો બાયોટેકનોલોજી, બાયોએન્જિનિયરિંગ, સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન, આણ્વિક જીવવિજ્ઞાન, જીવરસાયણશાસ્ત્ર, રોગપ્રતિકારકવિજ્ઞાન, બેક્ટેરિયાવિજ્ઞાન, વિષાણુવિજ્ઞાન, પ્રોટીઓમિક્સ, આનુવંશિકવિજ્ઞાન, શરીરક્રિયાવિજ્ઞાન, કોષજીવવિજ્ઞાન, રુધિરવિજ્ઞાન અને વનસ્પતિશાસ્ત્રનાં ક્ષેત્રોમાં વિસ્તરે છે.
કોષલય: કોષીય રચનાઓને તોડવી
કોષોનું રક્ષણ અર્ધપારગમ્ય પ્લાઝ્મા પટલ દ્વારા થાય છે, જે ફોસ્ફોલિપિડના દ્વિસ્તરનું બનેલું હોય છે (પ્રોટીન–લિપિડ દ્વિસ્તર પણ કહેવાય છે; તેમાં પ્રોટીનના અણુઓ જડાયેલા હોય છે અને તે જલવિરાગી લિપિડ તથા જલસ્નેહી ફોસ્ફરસના અણુઓથી બનેલું હોય છે) અને કોષના આંતરિક ભાગ (કોષરસ) તથા કોષબાહ્ય પર્યાવરણ વચ્ચે અવરોધ ઊભો કરે છે. વનસ્પતિ કોષો અને પ્રોકેરિયોટિક કોષો કોષદીવાલથી ઘેરાયેલા હોય છે. સેલ્યુલોઝના અનેક સ્તરો જેટલી જાડી કોષદીવાલને કારણે પ્રાણી કોષો કરતાં વનસ્પતિ કોષોનું લાયસિસ કરવું વધુ મુશ્કેલ હોય છે. કોષના આંતરિક ઘટકો, જેમ કે કોષાંગો, કોષકેન્દ્ર અને માઇટોકોન્ડ્રિયન, કોષકંકાલ દ્વારા સ્થિર રહે છે.
કોષોનું લાયસિસ કરવાનો હેતુ કોષાંગો, પ્રોટીન, DNA, mRNA અથવા અન્ય જૈવઅણુઓનું નિષ્કર્ષણ અને અલગીકરણ કરવાનો હોય છે.
કોષ લાયસિસની પરંપરાગત પદ્ધતિઓ અને તેમની ખામીઓ
કોષોનું લાયસિસ કરવાની અનેક પદ્ધતિઓ છે, જેને યાંત્રિક અને રાસાયણિક પદ્ધતિઓમાં વહેંચી શકાય છે. તેમાં ડિટર્જન્ટ અથવા દ્રાવકોનો ઉપયોગ, ઊંચા દબાણનો ઉપયોગ અથવા બીડ મિલ કે ફ્રેન્ચ પ્રેસનો ઉપયોગ સામેલ છે. આ પદ્ધતિઓની સૌથી વધુ સમસ્યારૂપ ખામી એ છે કે પ્રક્રિયાના પરિમાણોનું અને તેના પરિણામે થતી અસરનું નિયંત્રણ તથા સમાયોજન મુશ્કેલ હોય છે.
નીચેનું કોષ્ટક સામાન્ય લાયસિસ પદ્ધતિઓની મુખ્ય ખામીઓ દર્શાવે છે:
કોષ્ટક: કોષ લાયસિસની પરંપરાગત પદ્ધતિઓમાં મોટી ખામીઓ છે
લાયસિસની પ્રક્રિયા
લાયસિસ એક સંવેદનશીલ પ્રક્રિયા છે. લાયસિસ દરમિયાન કોષપટલનું રક્ષણ નષ્ટ થાય છે, પરંતુ અશારીરિક પર્યાવરણ (pH મૂલ્યથી વિચલન) દ્વારા નિષ્કર્ષિત પ્રોટીનનું નિષ્ક્રિયકરણ, વિકૃતીકરણ અને અવક્રમણ થતું અટકાવવું આવશ્યક છે. તેથી સામાન્ય રીતે લાયસિસ બફર દ્રાવણમાં કરવામાં આવે છે. મોટાભાગની મુશ્કેલીઓ અનિયંત્રિત કોષવિઘટનથી ઊભી થાય છે, જેના પરિણામે તમામ અંતઃકોષીય સામગ્રી લક્ષ્યવિહીન રીતે મુક્ત થાય છે અથવા/અને લક્ષિત ઉત્પાદનનું વિકૃતીકરણ થાય છે.
સોનિકેશન અને કોષ લાયસિસ વિશે વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નો
- શું સોનિકેશન વડે કોષોનું લાયસિસ કરી શકાય છે? હા, સોનિકેશન ઉચ્ચ આવૃત્તિનાં અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોનો ઉપયોગ કરીને કોષોનું અસરકારક રીતે લાયસિસ કરે છે. આ તરંગો કેવિટેશન ઉત્પન્ન કરે છે, જેમાં કોષોના નિલંબનમાં વરાળના સૂક્ષ્મ પરપોટા બને છે અને પ્રચંડ રીતે ધ્વસ્ત થાય છે. તેનાથી ઉત્પન્ન થતાં યાંત્રિક બળો કોષપટલોનું વિઘટન કરે છે અને અંતઃકોષીય ઘટકોને પ્રવાહીમાં મુક્ત કરવામાં સહાય કરે છે.
- કોષ લાયસિસ માટે સોનિકેટરનો ઉપયોગ કેવી રીતે કરવો? કોષ લાયસિસ માટે સોનિકેટરનો ઉપયોગ કરવામાં સોનિકેટરની પ્રોબને કોષોના નિલંબનમાં ડુબાડવી અને કંપવિસ્તાર તથા પલ્સની અવધિ જેવા પરિમાણોનું સમાયોજન કરવું સામેલ છે. પ્રોટીનનું વિકૃતીકરણ અને ઉત્સેચકોનું નિષ્ક્રિયકરણ ન્યૂનતમ રાખીને કોષવિઘટનને શ્રેષ્ઠ બનાવવા માટે પ્રક્રિયાનું બારીકાઈથી નિરીક્ષણ કરવું જોઈએ.
- કોષ લાયસિસ માટે સોનિકેશનનો સિદ્ધાંત શું છે? સોનિકેશન ધ્વનિક કેવિટેશનના સિદ્ધાંત પર કાર્ય કરે છે. અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા પ્રવાહી માધ્યમમાં પ્રસારિત થાય છે, જેના કારણે દબાણમાં ઝડપી વધઘટ થાય છે અને તેના પરિણામે સૂક્ષ્મ પરપોટા બને છે તથા અંદરની તરફ ધ્વસ્ત થાય છે. આ અંતઃસ્ફોટો તીવ્ર કતરણી બળો અને સ્થાનિક ઊંચાં તાપમાન ઉત્પન્ન કરે છે, જે કોષીય રચનાઓનું વિઘટન કરે છે અને લાયસેટની સમરૂપતા વધારે છે.
- કોષ લાયસિસ માટેના સોનિકેશનમાં કેટલો સમય લાગે છે? કોષ લાયસિસ માટેના સોનિકેશનની અવધિ કોષનો પ્રકાર, કોષઘનતા, સોનિકેટરની શક્તિ અને ઉપયોગમાં લેવાતા ચોક્કસ પ્રોટોકોલ જેવા પરિબળોના આધારે નોંધપાત્ર રીતે બદલાઈ શકે છે. સામાન્ય પ્રક્રિયાઓમાં કેટલીક સેકન્ડથી લઈને થોડી મિનિટો સુધીનો સમય લાગી શકે છે. ગરમીના ઉત્પન્ન થવાનું નિયંત્રણ કરવા અને એકસરખું કોષવિઘટન સુનિશ્ચિત કરવા માટે આ પ્રક્રિયાઓ ઘણીવાર ચક્રોમાં કરવામાં આવે છે.
- પ્રોટીન નિષ્કર્ષણમાં સોનિકેશનનો હેતુ શું છે? પ્રોટીન નિષ્કર્ષણમાં સોનિકેશન કોષપટલોને કાર્યક્ષમ રીતે તોડવાનું અને પ્રોટીનને દ્રાવ્ય બનાવવાનું કાર્ય કરે છે. આ પદ્ધતિ ખાસ કરીને કોષીય ખંડોની અંદરથી પ્રોટીન મુક્ત કરવા માટે ઉપયોગી છે, તેથી જે લાયસેટમાંથી પ્રોટીનનું શુદ્ધીકરણ અથવા વિશ્લેષણ કરવાનું હોય તે લાયસેટ તૈયાર કરવા માટે તે આવશ્યક બને છે.
- નિષ્કર્ષણ માટે સોનિકેશનનો ઉપયોગ શા માટે થાય છે? સોનિકેશનની ઝડપી ક્રિયા અને લક્ષિત ઊર્જા આપવાની ક્ષમતાને કારણે નિષ્કર્ષણ માટે તેને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવે છે. તે કઠોર રાસાયણિક ઉપચારોના ઉપયોગ વિના જૈવસક્રિય અણુઓને મુક્ત કરવા માટે કોષીય રચનાઓને તોડે છે, જેથી નિષ્કર્ષિત સંયોજનોની કાર્યાત્મક અખંડિતતા જળવાઈ રહે છે.
- શું સોનિકેશન પ્રોટીન–પ્રોટીન આંતરક્રિયાઓને વિક્ષેપિત કરે છે? સોનિકેશન કોષપટલોને અસરકારક રીતે વિઘટિત કરી શકે છે, પરંતુ તે પ્રોટીન–પ્રોટીન આંતરક્રિયાઓને પણ વિક્ષેપિત કરી શકે છે. વિક્ષેપનું પ્રમાણ સોનિકેશનની તીવ્રતા અને તેના સંપર્કની અવધિ પર આધાર રાખે છે, જેના કારણે પ્રોટીન સંકુલોનું વિકૃતીકરણ અથવા વિયોજન થઈ શકે છે, જે અનુગામી વિશ્લેષણાત્મક અથવા કાર્યાત્મક અભ્યાસોને અસર કરી શકે છે.
- શું E. coli ના લયન માટે સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરી શકાય છે? Hielscher સોનિકેટરો E. coli જેવા બેક્ટેરિયાના કોષોના લયન માટે ખાસ કરીને અસરકારક છે, જેમની કોષદીવાલો મજબૂત હોય છે. આ તકનીક કોષદીવાલ અને કોષપટલને કતરણ દ્વારા તોડવાની ભૌતિક પદ્ધતિ પૂરી પાડે છે, જેના કારણે તે આણ્વિક જીવવિજ્ઞાન અને જૈવરસાયણશાસ્ત્રની પ્રયોગશાળાઓમાં બેક્ટેરિયલ કોષલયિત દ્રવ્યો તૈયાર કરવા માટેની પસંદગીની પદ્ધતિ બને છે.
- સોનિકેશનના તબક્કા પછી કઈ અનુગામી પ્રક્રિયાઓ કરવામાં આવે છે?
અલ્ટ્રાસોનિક લયન પછીના અનુગામી તબક્કાઓમાં સામાન્ય રીતે કોષલયિત દ્રવ્યનું અંશીકરણ, કોષાંગોનું લક્ષિત અલગીકરણ અને પ્રોટીનનું વધુ નિષ્કર્ષણ અથવા શુદ્ધીકરણ સામેલ હોય છે.
ત્યારબાદ પ્રક્રિયા કરેલા કોષલયિત દ્રવ્યને અલગ કરવામાં આવે છે અને ઉચ્ચ વિભેદનક્ષમતાવાળા પ્રોટીઓમિક્સ, ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અથવા રિસેપ્ટર સાથેના બંધનના અભ્યાસો જેવા વિશ્લેષણાત્મક અથવા કાર્યાત્મક ઉપયોગો માટે તૈયાર કરવામાં આવે છે.
સાહિત્ય/સંદર્ભો
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.