Transformation génétique des cellules végétales à l'aide d'ultrasons

La transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT) est une méthode efficace pour infecter des cellules végétales avec des gènes étrangers en utilisant Agrobacterium comme transporteur. La cavitation ultrasonique provoque la sonoporation, qui peut être décrite comme une micro-blessure ciblée du tissu végétal. Grâce à ces micro-blessures créées par les ultrasons, l'ADN et les vecteurs d'ADN peuvent être transportés efficacement dans la matrice cellulaire.

sonoporation – Transformation cellulaire améliorée par les ultrasons

L'Ultrasonicator UP100H est un homogénéisateur de laboratoire souvent utilisé pour la préparation des échantillons des plaques de culture cellulaire.Lorsque des ultrasons à basse fréquence (environ 20 kHz) sont appliqués à des suspensions cellulaires, les effets de la cavitation acoustique provoquent une perméabilisation transitoire de la membrane des tissus cellulaires. Cet effet ultrasonique est connu sous le nom de sonoporation et est utilisé pour le transfert de gènes dans les cellules ou les tissus.
Les avantages de la sonorisation reposent sur son principe de fonctionnement mécanique non thermique, qui rend la sonorisation souvent plus polyvalente et moins dépendante des types de cellules. L'application polyvalente de la sonoporation ouvre la voie à l'utilisation de plantes transgéniques, qui présentent un potentiel important pour la bioproduction de protéines thérapeutiques humaines complexes. Ces bioréacteurs à base de plantes peuvent être facilement manipulés génétiquement, empêchent la contamination potentielle par des agents pathogènes humains, n'endommagent pas les bactéries médiatrices de la transformation (par exemple Agrobacterium) et constituent une méthode de biosynthèse efficace et peu coûteuse.

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Ultrasonicator UP200St, un ultrasoniseur puissant de 200 watts de type sonde pour la génétique, la microbiologie et la transformation cellulaire.

Ultrasonator UP200St (200W, 26kHz) avec capotage sonore

La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

Transformation cellulaire assistée par ultrasons

Les ultrasons de type sonde tels que l'UP200St sont des homogénéisateurs de tissus fiables et largement utilisés pour la préparation d'échantillons en génétique, par exemple pour la transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT).La sonication est une technique qui applique des ondes ultrasonores à basse fréquence pour agiter les particules en solution, pour mélanger les solutions, augmentant ainsi le taux de transfert de masse et de dissolution. Simultanément, la sonication peut éliminer les gaz dissous des liquides. Dans le cas de la transformation des plantes, la sonication provoque la formation de microcirconscriptions sur les tissus végétaux et améliore l'introduction d'ADN nu dans le protoplaste de la plante.

Pour la transformation génétique, la Transformation Assistée par Sonication (SAAT) est la méthode préférée et a une efficacité significativement plus élevée que la sonication utilisée pour transférer l'ADN nu et les vecteurs ADN directement dans le protoplaste. De nombreuses études ont démontré que la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT) peut être utilisée pour induire une perturbation mécanique et la formation de blessures sur les cellules végétales par des ondes ultrasonores et la cavitation acoustique qui en résulte. Un court traitement par ultrasons crée des micro-blessures à la surface des explants. Les cellules blessées permettent la pénétration d'Agrobacterium dans la partie profonde des tissus végétaux, augmentant ainsi la probabilité d'infection des cellules végétales. De plus, les composés phénoliques sécrétés favorisent la transformation. Les micro-blessures générées par les ultrasons facilitent également la pénétration des bactéries dans les explants. SAAT a été utilisé avec succès pour la transformation génétique d'espèces végétales particulièrement considérées comme résistantes à Agrobacterium.
Les principaux avantages de la méthode SAAT sont sa simplicité et son faible coût, ainsi que l'amélioration significative du transfert de gènes médié par Agrobacterium. Outre l'application réussie de la SAAT dans la transformation de Chenopodium rubrum L. et Beta vulgaris L., cette approche a également été appliquée dans la production d'holotoxine thermolabile recombinante de type sauvage d'Escherichia coli et d'adjuvants vaccinaux LT mutants d'Escherichia coli dans Nicotiana tabacum, dans lesquels les titres d'IgG systémiques spécifiques de LT-B les plus élevés ont été détectés chez les oiseaux.
(cf. Laere et al., 2016 ; M. Klimek-Chodacka et R. Baranski, 2014)

Le VialTweeter peut être utilisé pour l'infection d'ADN de cellules de plantes, par exemple en utilisant la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT).

VialTweeter pour la sonication simultanée de plusieurs tubes d'échantillons, par exemple pour la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT).

Avantages scientifiquement prouvés de la transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT)

La transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT) a été appliquée à de nombreuses espèces végétales. Un traitement ultrasonique court et relativement doux des cultures de cellules végétales provoque une sonoporation, qui permet ensuite une pénétration profonde d'Agrobacterium comme transporteur de gènes. Vous pouvez lire ci-dessous des études exemplaires démontrant les effets bénéfiques de la SAAT.

Transformation de l'ashwagandha assistée par ultrasons

Afin d'améliorer l'efficacité de la transformation chez W. somnifera (connu sous le nom d'ashwagandha ou cerise d'hiver), Dehdashti et ses collègues (2016) ont étudié l'utilisation de l'acétosyringone (AS) et de la sonication.
L'acétosyringone (AS) a été ajoutée en trois étapes : Culture liquide d'Agrobacterium, infection par Agrobacterium et coculture d'explants avec Agrobacterium. L'ajout de 75 μM AS à la culture liquide d'Agrobacterium s'est avéré optimal pour l'induction des gènes vir.
L'application supplémentaire de la sonication (SAAT) a donné lieu à l'expression génétique la plus élevée. L'expression du gène gusA dans les racines poilues était meilleure lorsque les feuilles et les extrémités des pousses étaient soniquées pendant 10 et 20 secondes, respectivement. L'efficacité de transformation du protocole amélioré a été enregistrée à 66,5 et 59,5 % dans le cas des explants de feuilles et d'extrémités de pousses, respectivement. En comparaison avec d'autres protocoles, l'efficacité de transformation de ce protocole amélioré s'est avérée 2,5 fois plus élevée pour les feuilles et 3,7 fois plus élevée pour les extrémités des pousses. Les analyses par transfert de Southern ont confirmé la présence de 1-2 copies du transgène gusA dans les lignées W1-W4, tandis que 1-4 copies du transgène ont été détectées dans la lignée W5 générée par le protocole amélioré.

La durée de sonication (temps d'exposition aux ultrasons) affecte la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT) sur la transformation de W. somnifera.

Effet de la durée de la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) sur la fréquence de transformation des explants de feuilles (a) et d'extrémités de pousses (b) de W. somnifera.
(étude et graphique : © Dehdashti et al., 2016)

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Transformation du coton assistée par ultrasons

Hussain et al. (2007) démontrent les effets bénéfiques de la transformation du coton assistée par sonication. La cavitation acoustique causée par les ultrasons à basse fréquence crée des micro-blessures sur et sous la surface du tissu végétal (sonoporation) et permet à Agrobacterium de se déplacer plus profondément et complètement dans le tissu végétal. Cette façon de blesser augmente la probabilité d'infecter les cellules végétales situées plus profondément dans le tissu. Afin d'évaluer l'efficacité de la transformation de SAAT, l'expression du gène GUS a été mesurée. Le système rapporteur GUS est un système de gènes rapporteurs, particulièrement utile en biologie moléculaire végétale et en microbiologie. En ajustant divers paramètres de SAAT, l'expression transitoire du GUS dans le coton en utilisant des embryons matures comme explant a été significativement améliorée. Le GUS a été détecté pour la première fois 24h après l'incubation des explants et à 48h, l'expression du GUS était très intense, ce qui a servi d'indicateur utile de la réussite de la transformation de l'explant de coton après la transformation assistée par sonication et Agrobacterium (SAAT). La comparaison de diverses techniques de transformation (à savoir biolistique, Agro, BAAT, SAAT), la transformation assistée par sonication et médiée par Agrobacterium (SAAT) a montré de loin les meilleurs résultats de transformation.

La transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée par rapport aux autres méthodes d'infection.

Choix de la procédure de transformation sur la base de l'expression transitoire de GUS. La transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée.
(étude et graphique : © Hussain et al., 2007)

Solutions ultrasoniques de haute performance pour la sonoporation et le SAAT

Hielscher Ultrasonics a une longue expérience dans le développement et la fabrication d'ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les installations de recherche ainsi que la production industrielle à très haut débit. Pour la microbiologie et les sciences de la vie, Hielscher propose diverses solutions pour répondre aux différentes exigences nécessaires pour des tissus spécifiques et leurs traitements. Pour la sonication simultanée de nombreux échantillons, Hielscher propose l'UIP400MTP pour les plaques multipuits, le VialTweeter pour la sonication de 10 flacons (par exemple, des tubes Eppendorf) ou le CupHorn à ultrasons. Les ultrasons de type sonde sont disponibles de 50 à 400 watts comme homogénéisateurs de laboratoire, tandis que les systèmes industriels couvrent la gamme de puissance de 500 watts à 16kW.
N'hésitez pas à nous contacter et à nous faire part des exigences de votre application et de votre procédé. Notre personnel expérimenté se fera un plaisir de vous recommander l'ultrasoniseur le mieux adapté à votre processus biologique.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

lot Volume Débit Appareils recommandés
plaques multipuits / microtitres n / a. UIP400MTP
jusqu'à 10 flacons n / a. VialTweeter
jusqu'à 5 flacons/tubes ou 1 grand récipient n / a. Corne de cuivre
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 20L 00,2 à 4L / min UIP2000hdT
10 à 100l 2 à 10 L / min UIP4000hdT
n / a. 10 à 100 litres / min UIP16000
n / a. plus grand groupe de UIP16000

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Les homogénéisateurs ultrasoniques à haut cisaillement sont utilisés en laboratoire, sur table, dans le cadre de projets pilotes et dans l'industrie.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs ultrasoniques à haute performance pour des applications de mélange, de dispersion, d'émulsification et d'extraction à l'échelle du laboratoire, du pilote et de l'industrie.



Littérature / Références


Des ultrasons de haute performance ! La gamme de produits Hielscher couvre l'ensemble du spectre, depuis les ultrasons compacts de laboratoire jusqu'aux systèmes ultrasoniques industriels complets, en passant par les unités de paillasse.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance à partir d'une technologie de pointe. laboratoires à taille industrielle.