Transformation génétique des cellules végétales par ultrasons

La transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) est une méthode efficace pour infecter les cellules végétales avec des gènes étrangers en utilisant Agrobacterium comme transporteur. La cavitation ultrasonore provoque la sonoporation, qui peut être décrite comme une micro-lésion ciblée du tissu végétal. Grâce à ces micro-lésions créées par ultrasons, l’ADN et les vecteurs d’ADN peuvent être transportés efficacement dans la matrice cellulaire.

Sonoporation – Transformation cellulaire améliorée par ultrasons

Lorsqu’un ultrason de basse fréquence (environ 20kHz) est appliqué à des suspensions cellulaires, les effets de la cavitation acoustique provoquent une perméabilisation transitoire de la membrane des tissus cellulaires. Cet effet ultrasonore est connu sous le nom de sonoporation et est utilisé pour le transfert de gènes dans les cellules ou les tissus.
Les avantages de l’ultrasonication reposent sur son principe de fonctionnement mécanique non thermique, ce qui rend la sonication souvent plus polyvalente et moins dépendante des types de cellules. L’application polyvalente de la sonoporation ouvre la possibilité d’utiliser des plantes transgéniques, qui présentent un potentiel significatif dans la bioproduction de protéines thérapeutiques humaines complexes. De tels bioréacteurs à base de plantes peuvent être facilement manipulés génétiquement, préviennent la contamination potentielle par des agents pathogènes humains, n’endommagent pas les bactéries médiatrices de la transformation (p. ex. Agrobacterium) et constituent une méthode de biosynthèse peu coûteuse et efficace.

Transformation cellulaire assistée par ultrasons

La sonication est une technique qui applique des ondes ultrasonores de basse fréquence pour agiter les particules en solution, pour mélanger les solutions, augmentant ainsi la vitesse de transfert de masse et de dissolution. Simultanément, la sonication peut éliminer les gaz dissous des liquides. Dans la transformation des plantes, la sonication provoque la formation de micro-lésions sur le tissu végétal et améliore l’acheminement de l’ADN nu dans le protoplaste végétal.

Pour la transformation génétique, la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) est la méthode préférée et présente une efficacité nettement supérieure à la sonication utilisée pour transférer directement l’ADN nu et les vecteurs d’ADN dans le protoplaste. De nombreuses études ont démontré que la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) peut être utilisée pour induire une rupture mécanique et la formation de lésions sur les cellules végétales par les ondes ultrasonores et la cavitation acoustique qui en résulte. Un bref traitement par ultrasons crée des micro-lésions à la surface des explants. Comme les cellules lésées permettront la pénétration d’Agrobacterium dans la partie plus profonde des tissus végétaux, augmentant ainsi la probabilité que les cellules végétales soient infectées. De plus, les composés phénoliques sécrétés améliorent la transformation. Les micro-lésions générées par ultrasons rendent également plus réalisable la pénétration des explants par les bactéries. La SAAT a été utilisée avec succès pour la transformation génétique dans des espèces végétales particulièrement considérées comme résistantes à Agrobacterium.
Le fait d’être une méthode très simple et peu coûteuse, ainsi que l’amélioration significative du transfert de gènes médié par Agrobacterium, sont les principaux avantages de la SAAT. Outre l’application réussie de la SAAT dans la transformation de Chenopodium rubrum L. et Beta vulgaris L., cette approche a également été appliquée à la production d’holotoxine thermolabile de type sauvage recombinante d’Escherichia coli et d’adjuvants vaccinaux LT mutants d’Escherichia coli dans Nicotiana tabacum, dans lesquels les titres d’IgG spécifiques de LT-B systémiques les plus élevés ont été détectés chez des oiseaux.
(cf. Laere et al., 2016 ; M. Klimek-Chodacka et R. Baranski, 2014)

Procédure générale de transfert de gènes par sonoporation dans les cellules végétales

1. Préparation du matériel génétique : Commencez par préparer le matériel génétique que vous souhaitez introduire dans les cellules végétales. Il peut s’agir d’ADN plasmidique, d’ARN ou d’autres acides nucléiques.
2. Isolement des cellules végétales : Isolez les cellules végétales que vous souhaitez cibler. Selon votre expérience, ces cellules peuvent être isolées à partir de tissus végétaux ou de cultures.
3. Suspension cellulaire : Mettez les cellules végétales en suspension dans un milieu ou un tampon approprié. Ceci est essentiel pour garantir que les cellules sont saines et dans un état propice à l’absorption des gènes.
4. Configurez votre sonicateur : Préparez votre sonicateur à sonde en préréglant les paramètres de sonication tels que l’amplitude, le temps, l’énergie et la température. Immergez la sonde ultrasonore dans la suspension cellulaire.
5. Sonication : Démarrez la procédure de sonication. L’oscillation rapide de la pointe de la sonde génère des bulles de cavitation dans le liquide. Ces bulles se dilatent et s’effondrent sous l’effet des ondes ultrasonores, créant des forces mécaniques et un micro-courant dans la suspension.
6. Sonoporation : Les forces mécaniques et le micro-courant générés par la cavitation créent temporairement des pores et des trous dans les membranes des cellules végétales. Le matériel génétique présent dans la suspension peut pénétrer dans les cellules végétales par ces pores.
7. Incubation : Après le traitement de sonoporation, incubez les cellules végétales pour leur permettre de récupérer et de stabiliser leurs membranes. Il s’agit d’une étape cruciale pour garantir la survie des cellules et la réussite du transfert de gènes.

Transfert de gènes via Agrobacterium ou liposomes

Il existe deux formes courantes pour transfecter les cellules végétales. Elles utilisent soit agrobacterium, un genre de bactéries à Gram négatif, soit des liposomes comme vecteur du matériel génétique.

• Sonoporation médiée par Agrobacterium : Agrobacterium tumefaciens est une bactérie couramment utilisée dans le génie génétique végétal. Dans cette méthode, l’ADN plasmidique contenant le gène souhaité est introduit dans Agrobacterium, qui est ensuite mélangé avec des cellules végétales. La suspension cellulaire est soumise à une sonoporation à l’aide d’un sonicateur à sonde. L’énergie ultrasonore améliore le transfert du matériel génétique d’Agrobacterium vers les cellules végétales. Cette méthode est largement utilisée pour la modification génétique des plantes.
• Sonoporation médiée par liposomes : Les liposomes sont des vésicules à base de lipides qui peuvent transporter du matériel génétique. Dans cette méthode, des liposomes chargés d’ADN plasmidique ou d’autres acides nucléiques sont mélangés avec des cellules végétales. La sonoporation à l’aide d’un sonicateur à sonde est utilisée pour faciliter l’absorption des liposomes par les cellules végétales. Les ultrasons rompent les bicouches lipidiques des liposomes, libérant le matériel génétique dans les cellules végétales. Cette approche est utile pour les études d’expression génique transitoire dans les cellules végétales.

Avantages scientifiquement prouvés de la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT)

La transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) a été appliquée à de nombreuses espèces végétales. Un traitement par ultrasons court et relativement doux des cultures de cellules végétales provoque la sonoporation, qui permet ensuite une pénétration profonde d’Agrobacterium comme transporteur de gènes. Ci-dessous, vous pouvez lire des études exemplaires démontrant les effets bénéfiques de la SAAT.

Transformation de l’ashwagandha assistée par ultrasons

Afin d’améliorer l’efficacité de la transformation chez W. somnifera (connue sous le nom d’ashwagandha ou de cerise d’hiver), Dehdashti et ses collègues (2016) ont étudié l’utilisation de l’acétosyringone (AS) et de la sonication.
L’acétosyringone (AS) a été ajoutée en trois étapes : culture liquide d’Agrobacterium, infection par Agrobacterium et co-culture des explants avec Agrobacterium. L’ajout de 75 μM d’AS à la culture liquide d’Agrobacterium s’est avéré optimal pour l’induction des gènes vir.
L’application supplémentaire de sonication (SAAT) a entraîné la plus forte expression génique. L’expression du gène gusA dans les racines chevelues s’est avérée optimale lorsque les feuilles et les apex caulinaires étaient soniqués pendant 10 et 20s, respectivement. L’efficacité de transformation du protocole amélioré a été enregistrée à 66,5 et 59,5 % dans le cas des explants de feuilles et d’apex caulinaires, respectivement. Comparée à d’autres protocoles, l’efficacité de transformation de ce protocole amélioré s’est avérée 2,5 fois plus élevée pour les feuilles et 3,7 fois plus importante pour les apex caulinaires. Les analyses par Southern blot ont confirmé 1–2 copies du transgène gusA dans les lignées W1-W4, tandis que 1–4 copies du transgène ont été détectées dans la lignée W5 générée par le protocole amélioré.

Effet de la durée de la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) sur la fréquence de transformation des explants de feuilles (a) et d’apex caulinaires (b) de W. somnifera
(étude et graphique : © Dehdashti et al., 2016)

Transformation du coton assistée par ultrasons

Hussain et al. (2007) démontrent les effets bénéfiques de la transformation du coton assistée par sonication. La cavitation acoustique provoquée par les ultrasons de basse fréquence crée des micro-lésions à la surface et sous la surface du tissu végétal (sonoporation) et permet à Agrobacterium de voyager plus profondément et complètement à travers tout le tissu végétal. Ce mode de lésion augmente la probabilité d’infecter les cellules végétales situées plus profondément dans le tissu. Afin d’évaluer l’efficacité de transformation de la SAAT, l’expression du gène GUS a été mesurée. Le système rapporteur GUS est un système de gène rapporteur, particulièrement utile en biologie moléculaire végétale et en microbiologie. En ajustant divers paramètres de la SAAT, l’expression transitoire de GUS dans le coton en utilisant des embryons matures comme explant a été significativement améliorée. GUS a été détecté pour la première fois 24h après l’incubation des explants et, au bout de 48h, l’expression de GUS était très intense, ce qui a servi d’indicateur utile de la réussite de la transformation de l’explant de coton à la suite de la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT). La comparaison de diverses techniques de transformation (à savoir biolistique, Agro, BAAT, SAAT), la transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) a montré de loin les meilleurs résultats de transformation.

Choix de la procédure de transformation sur la base de l’expression transitoire de GUS. La transformation médiée par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée.
(étude et graphique : © Hussain et al., 2007)

Solutions ultrasonores haute performance pour la sonoporation et la SAAT

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