Transformation génétique des cellules végétales à l'aide d'ultrasons

La transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT) est une méthode efficace pour infecter des cellules végétales avec des gènes étrangers en utilisant Agrobacterium comme transporteur. La cavitation ultrasonique provoque la sonoporation, qui peut être décrite comme une micro-blessure ciblée du tissu végétal. Grâce à ces micro-blessures créées par les ultrasons, l'ADN et les vecteurs d'ADN peuvent être transportés efficacement dans la matrice cellulaire.

sonoporation – Transformation cellulaire améliorée par les ultrasons

L'Ultrasonicator UP100H est un homogénéisateur de laboratoire souvent utilisé pour la préparation des échantillons des plaques de culture cellulaire.Lorsque des ultrasons à basse fréquence (environ 20 kHz) sont appliqués à des suspensions cellulaires, les effets de la cavitation acoustique provoquent une perméabilisation transitoire de la membrane des tissus cellulaires. Cet effet ultrasonique est connu sous le nom de sonoporation et est utilisé pour le transfert de gènes dans les cellules ou les tissus.
Les avantages de la sonorisation reposent sur son principe de fonctionnement mécanique non thermique, qui rend la sonorisation souvent plus polyvalente et moins dépendante des types de cellules. L'application polyvalente de la sonoporation ouvre la voie à l'utilisation de plantes transgéniques, qui présentent un potentiel important pour la bioproduction de protéines thérapeutiques humaines complexes. Ces bioréacteurs à base de plantes peuvent être facilement manipulés génétiquement, empêchent la contamination potentielle par des agents pathogènes humains, n'endommagent pas les bactéries médiatrices de la transformation (par exemple Agrobacterium) et constituent une méthode de biosynthèse efficace et peu coûteuse.

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La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

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Transformation cellulaire assistée par ultrasons

Les ultrasons de type sonde tels que l'UP200St sont des homogénéisateurs de tissus fiables et largement utilisés pour la préparation d'échantillons en génétique, par exemple pour la transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT).La sonication est une technique qui applique des ondes ultrasonores à basse fréquence pour agiter les particules en solution, pour mélanger les solutions, augmentant ainsi le taux de transfert de masse et de dissolution. Simultanément, la sonication peut éliminer les gaz dissous des liquides. Dans le cas de la transformation des plantes, la sonication provoque la formation de microcirconscriptions sur les tissus végétaux et améliore l'introduction d'ADN nu dans le protoplaste de la plante.

Pour la transformation génétique, la Transformation Assistée par Sonication (SAAT) est la méthode préférée et a une efficacité significativement plus élevée que la sonication utilisée pour transférer l'ADN nu et les vecteurs ADN directement dans le protoplaste. De nombreuses études ont démontré que la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT) peut être utilisée pour induire une perturbation mécanique et la formation de blessures sur les cellules végétales par des ondes ultrasonores et la cavitation acoustique qui en résulte. Un court traitement par ultrasons crée des micro-blessures à la surface des explants. Les cellules blessées permettent la pénétration d'Agrobacterium dans la partie profonde des tissus végétaux, augmentant ainsi la probabilité d'infection des cellules végétales. De plus, les composés phénoliques sécrétés favorisent la transformation. Les micro-blessures générées par les ultrasons facilitent également la pénétration des bactéries dans les explants. SAAT a été utilisé avec succès pour la transformation génétique d'espèces végétales particulièrement considérées comme résistantes à Agrobacterium.
Les principaux avantages de la méthode SAAT sont sa simplicité et son faible coût, ainsi que l'amélioration significative du transfert de gènes médié par Agrobacterium. Outre l'application réussie de la SAAT dans la transformation de Chenopodium rubrum L. et Beta vulgaris L., cette approche a également été appliquée dans la production d'holotoxine thermolabile recombinante de type sauvage d'Escherichia coli et d'adjuvants vaccinaux LT mutants d'Escherichia coli dans Nicotiana tabacum, dans lesquels les titres d'IgG systémiques spécifiques de LT-B les plus élevés ont été détectés chez les oiseaux.
(cf. Laere et al., 2016 ; M. Klimek-Chodacka et R. Baranski, 2014)

Le VialTweeter peut être utilisé pour l'infection d'ADN de cellules de plantes, par exemple en utilisant la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT).

VialTweeter pour la sonication simultanée de plusieurs tubes d'échantillons, par exemple pour la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT).

Procédure générale de transfert de gènes par sonoporation dans des cellules végétales

  1. Préparation du matériel génétique : Commencez par préparer le matériel génétique que vous souhaitez introduire dans les cellules de la plante. Il peut s'agir d'ADN plasmidique, d'ARN ou d'autres acides nucléiques.
  2. Isolement des cellules végétales : Isolez les cellules végétales que vous souhaitez cibler. En fonction de votre expérience, ces cellules peuvent être isolées à partir de tissus végétaux ou de cultures.
  3. Suspension cellulaire : Suspendre les cellules végétales dans un milieu ou un tampon approprié. Cette opération est essentielle pour s'assurer que les cellules sont saines et dans un état propice à l'absorption des gènes.
  4. Configurez votre Sonicator : Préparez votre sonicateur à sonde en réglant les paramètres de sonication tels que l'amplitude, la durée, l'énergie et la température. Plongez la sonde à ultrasons dans la suspension cellulaire.
  5. sonication: Lancez la procédure de sonication. L'oscillation rapide de la pointe de la sonde génère des bulles de cavitation dans le liquide. Ces bulles se dilatent et s'effondrent sous l'effet des ondes ultrasoniques, créant des forces mécaniques et un microstreaming dans la suspension.
  6. Sonoporation : Les forces mécaniques et les micro-écoulements générés par la cavitation créent temporairement des pores et des trous dans les membranes des cellules végétales. Le matériel génétique présent dans la suspension peut pénétrer dans les cellules végétales par ces pores.
  7. Incubation : Après le traitement par sonoporation, incuber les cellules végétales pour leur permettre de récupérer et de stabiliser leurs membranes. Il s'agit d'une étape cruciale pour assurer la survie des cellules et la réussite du transfert de gènes.

Transfert de gènes par Agrobacterium ou Liposomes

Il existe deux formes courantes de transfection des cellules végétales. Elles utilisent soit l'agrobacterium, un genre de bactérie Gram négatif, soit des liposomes comme support du matériel génétique.

  • Sonoporation médiée par Agrobacterium : Agrobacterium tumefaciens est une bactérie couramment utilisée dans le génie génétique des plantes. Dans cette méthode, l'ADN plasmidique contenant le gène souhaité est introduit dans Agrobacterium, qui est ensuite mélangé à des cellules végétales. La suspension cellulaire est soumise à une sonoporation à l'aide d'un sonicateur à sonde. L'énergie ultrasonique favorise le transfert du matériel génétique de l'Agrobacterium vers les cellules végétales. Cette méthode est largement utilisée pour la modification génétique des plantes.
  • Sonoporation médiée par les liposomes : Les liposomes sont des vésicules à base de lipides qui peuvent transporter du matériel génétique. Dans cette méthode, des liposomes chargés d'ADN plasmidique ou d'autres acides nucléiques sont mélangés à des cellules végétales. La sonoporation à l'aide d'un sonicateur à sonde est utilisée pour faciliter l'absorption des liposomes par les cellules végétales. Les ultrasons rompent les bicouches lipidiques des liposomes, libérant ainsi le matériel génétique dans les cellules végétales. Cette approche est utile pour les études d'expression génique transitoire dans les cellules végétales.

Avantages scientifiquement prouvés de la transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT)

La transformation assistée par sonication d'Agrobacterium (SAAT) a été appliquée à de nombreuses espèces végétales. Un traitement ultrasonique court et relativement doux des cultures de cellules végétales provoque une sonoporation, qui permet ensuite une pénétration profonde d'Agrobacterium comme transporteur de gènes. Vous pouvez lire ci-dessous des études exemplaires démontrant les effets bénéfiques de la SAAT.

Sonicator UP200Ht avec micro-pointe pour transfecter des cellules végétales avec des gènes par sonoporation

Sonicator UP200Ht pour la transfection de gènes par sonoporation

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Transformation de l'ashwagandha assistée par ultrasons

Afin d'améliorer l'efficacité de la transformation chez W. somnifera (connu sous le nom d'ashwagandha ou cerise d'hiver), Dehdashti et ses collègues (2016) ont étudié l'utilisation de l'acétosyringone (AS) et de la sonication.
L'acétosyringone (AS) a été ajoutée en trois étapes : Culture liquide d'Agrobacterium, infection par Agrobacterium et coculture d'explants avec Agrobacterium. L'ajout de 75 μM AS à la culture liquide d'Agrobacterium s'est avéré optimal pour l'induction des gènes vir.
L'application supplémentaire de la sonication (SAAT) a donné lieu à l'expression génétique la plus élevée. L'expression du gène gusA dans les racines poilues était meilleure lorsque les feuilles et les extrémités des pousses étaient soniquées pendant 10 et 20 secondes, respectivement. L'efficacité de transformation du protocole amélioré a été enregistrée à 66,5 et 59,5 % dans le cas des explants de feuilles et d'extrémités de pousses, respectivement. En comparaison avec d'autres protocoles, l'efficacité de transformation de ce protocole amélioré s'est avérée 2,5 fois plus élevée pour les feuilles et 3,7 fois plus élevée pour les extrémités des pousses. Les analyses par transfert de Southern ont confirmé la présence de 1-2 copies du transgène gusA dans les lignées W1-W4, tandis que 1-4 copies du transgène ont été détectées dans la lignée W5 générée par le protocole amélioré.

La durée de sonication (temps d'exposition aux ultrasons) affecte la transformation assistée par Agrobacterium (SAAT) sur la transformation de W. somnifera.

Effet de la durée de la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) sur la fréquence de transformation des explants de feuilles (a) et d'extrémités de pousses (b) de W. somnifera.
(étude et graphique : © Dehdashti et al., 2016)

Les sonicateurs tels que l'UP200St sont utilisés pour préparer le matériel génétique tel que l'ADN, l'ARN, le miRNA et la transfection génique ultérieure par sonoporation. La sonoporation permet de transfecter des cellules végétales avec du matériel génétique en utilisant l'agrobacterium.

Homogénéisateur à sonde UP200St pour la sonoporation et la transfection de gènes

Transformation du coton assistée par ultrasons

Hussain et al. (2007) démontrent les effets bénéfiques de la transformation du coton assistée par sonication. La cavitation acoustique causée par les ultrasons à basse fréquence crée des micro-blessures sur et sous la surface du tissu végétal (sonoporation) et permet à Agrobacterium de se déplacer plus profondément et complètement dans le tissu végétal. Cette façon de blesser augmente la probabilité d'infecter les cellules végétales situées plus profondément dans le tissu. Afin d'évaluer l'efficacité de la transformation de SAAT, l'expression du gène GUS a été mesurée. Le système rapporteur GUS est un système de gènes rapporteurs, particulièrement utile en biologie moléculaire végétale et en microbiologie. En ajustant divers paramètres de SAAT, l'expression transitoire du GUS dans le coton en utilisant des embryons matures comme explant a été significativement améliorée. Le GUS a été détecté pour la première fois 24h après l'incubation des explants et à 48h, l'expression du GUS était très intense, ce qui a servi d'indicateur utile de la réussite de la transformation de l'explant de coton après la transformation assistée par sonication et Agrobacterium (SAAT). La comparaison de diverses techniques de transformation (à savoir biolistique, Agro, BAAT, SAAT), la transformation assistée par sonication et médiée par Agrobacterium (SAAT) a montré de loin les meilleurs résultats de transformation.

La transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée par rapport aux autres méthodes d'infection.

Choix de la procédure de transformation sur la base de l'expression transitoire de GUS. La transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée.
(étude et graphique : © Hussain et al., 2007)

 

Ce tutoriel explique quel type de sonicateur est le mieux adapté à vos tâches de préparation d'échantillons telles que la lyse, la désintégration cellulaire, l'isolement des protéines, la fragmentation de l'ADN et de l'ARN dans les laboratoires, l'analyse et la recherche. Choisissez le type de sonicateur idéal pour votre application, votre volume d'échantillon, votre nombre d'échantillons et votre débit. Hielscher Ultrasonics a l'homogénéisateur à ultrasons idéal pour vous !

Comment trouver le sonicateur parfait pour la désintégration des cellules et l'extraction des protéines en science et analyse

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Solutions ultrasoniques de haute performance pour la sonoporation et le SAAT

Hielscher Ultrasonics a une longue expérience dans le développement et la fabrication d'ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les installations de recherche ainsi que la production industrielle à très haut débit. Pour la microbiologie et les sciences de la vie, Hielscher propose diverses solutions pour répondre aux différentes exigences nécessaires pour des tissus spécifiques et leurs traitements. Pour la sonication simultanée de nombreux échantillons, Hielscher propose l'UIP400MTP pour les plaques multipuits, le VialTweeter pour la sonication de 10 flacons (par exemple, des tubes Eppendorf) ou le CupHorn à ultrasons. Les ultrasons de type sonde sont disponibles de 50 à 400 watts comme homogénéisateurs de laboratoire, tandis que les systèmes industriels couvrent la gamme de puissance de 500 watts à 16kW.
N'hésitez pas à nous contacter et à nous faire part des exigences de votre application et de votre procédé. Notre personnel expérimenté se fera un plaisir de vous recommander l'ultrasoniseur le mieux adapté à votre processus biologique.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

lot VolumeDébitAppareils recommandés
plaques multipuits / microtitresn / a.UIP400MTP
jusqu'à 10 flaconsn / a.VialTweeter
jusqu'à 5 flacons/tubes ou 1 grand récipientn / a.Corne de cuivre
1 à 500 ml10 à 200 ml / minUP100H
10 à 2000mL20 à 400 ml / minUP200Ht, UP400St
0.1 20L00,2 à 4L / minUIP2000hdT
10 à 100l2 à 10 L / minUIP4000hdT
n / a.10 à 100 litres / minUIP16000
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Littérature / Références


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