Transformation génétique de cellules végétales à l'aide d'ultrasons

La transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) est une méthode efficace pour infecter les cellules végétales avec des gènes étrangers en utilisant Agrobacterium comme transporteur. La cavitation ultrasonique provoque une sonoporation, qui peut être décrite comme une micro-blessure ciblée du tissu végétal. Grâce à ces microplaies créées par ultrasons, l'ADN et les vecteurs d'ADN peuvent être efficacement transportés dans la matrice cellulaire.

Sonoporation – Transformation cellulaire améliorée par ultrasons

Lorsque des ultrasons à basse fréquence (environ 20 kHz) sont appliqués à des suspensions cellulaires, les effets de la cavitation acoustique provoquent une perméabilisation transitoire de la membrane des tissus cellulaires. Cet effet ultrasonique est connu sous le nom de sonoporation et est utilisé pour le transfert de gènes dans les cellules ou les tissus.
Les avantages de la sonoporation reposent sur son principe de fonctionnement mécanique non thermique, qui rend la sonoporation souvent plus polyvalente et moins dépendante des types de cellules. L'application polyvalente de la sonoporation ouvre la possibilité d'utiliser des plantes transgéniques, qui ont un potentiel significatif dans la bioproduction de protéines thérapeutiques humaines complexes. Ces bioréacteurs à base de plantes peuvent être facilement manipulés génétiquement, empêchent la contamination potentielle par des agents pathogènes humains, n'endommagent pas les bactéries médiatrices de la transformation (par exemple Agrobacterium) et constituent une méthode peu coûteuse et efficace de biosynthèse.

Transformation cellulaire assistée par ultrasons

La sonication est une technique qui applique des ondes ultrasonores à basse fréquence pour agiter les particules en solution, pour mélanger les solutions, augmentant ainsi le taux de transfert de masse et de dissolution. Simultanément, la sonication peut éliminer les gaz dissous dans les liquides. Dans le cadre de la transformation des plantes, la sonication entraîne la formation de micro-ondes sur le tissu végétal et améliore la diffusion de l'ADN nu dans le protoplaste de la plante.

Pour la transformation génétique, la transformation assistée par sonication et médiée par Agrobacterium (SAAT) est la méthode préférée et a une efficacité significativement plus élevée que la sonication utilisée pour transférer de l'ADN nu et des vecteurs d'ADN directement dans le protoplaste. De nombreuses études ont démontré que la transformation assistée par sonication de l'Agrobacterium (SAAT) peut être utilisée pour induire une perturbation mécanique et la formation de blessures sur les cellules végétales par des ondes ultrasonores et la cavitation acoustique qui en résulte. Un traitement ultrasonique de courte durée crée des microplaies à la surface des explants. Les cellules blessées permettent la pénétration d'Agrobacterium dans la partie profonde des tissus végétaux, augmentant ainsi la probabilité d'infection des cellules végétales. En outre, les composés phénoliques sécrétés favorisent la transformation. Les microplaies générées par les ultrasons facilitent également la pénétration des bactéries dans les explants. Le SAAT a été utilisé avec succès pour la transformation génétique d'espèces végétales considérées comme particulièrement résistantes à Agrobacterium.
Le SAAT est une méthode très simple et peu coûteuse, qui améliore considérablement le transfert de gènes par Agrobacterium. Outre l'application réussie du SAAT à la transformation de Chenopodium rubrum L. et de Beta vulgaris L., cette approche a également été appliquée à la production d'holotoxine recombinante thermolabile de type sauvage d'Escherichia coli et d'adjuvants vaccinaux LT mutants d'Escherichia coli dans Nicotiana tabacum, dans lesquels les titres d'IgG systémiques spécifiques LT-B les plus élevés ont été détectés chez les oiseaux.
(cf. Laere et al., 2016 ; M. Klimek-Chodacka et R. Baranski, 2014)

Procédure générale de transfert de gènes par sonoporation dans des cellules végétales

1. Préparation du matériel génétique : Commencez par préparer le matériel génétique que vous souhaitez introduire dans les cellules de la plante. Il peut s'agir d'ADN plasmidique, d'ARN ou d'autres acides nucléiques.
2. Isolement des cellules végétales : Isolez les cellules végétales que vous souhaitez cibler. En fonction de votre expérience, ces cellules peuvent être isolées à partir de tissus végétaux ou de cultures.
3. Suspension cellulaire : Suspendre les cellules végétales dans un milieu ou un tampon approprié. Cette opération est essentielle pour s'assurer que les cellules sont saines et dans un état propice à l'absorption des gènes.
4. Configurez votre Sonicator : Préparez votre sonicateur à sonde en réglant les paramètres de sonication tels que l'amplitude, la durée, l'énergie et la température. Plongez la sonde à ultrasons dans la suspension cellulaire.
5. Sonication : Lancez la procédure de sonication. L'oscillation rapide de la pointe de la sonde génère des bulles de cavitation dans le liquide. Ces bulles se dilatent et s'effondrent sous l'effet des ondes ultrasoniques, créant des forces mécaniques et un microstreaming dans la suspension.
6. Sonoporation : Les forces mécaniques et les micro-écoulements générés par la cavitation créent temporairement des pores et des trous dans les membranes des cellules végétales. Le matériel génétique présent dans la suspension peut pénétrer dans les cellules végétales par ces pores.
7. Incubation : Après le traitement par sonoporation, incuber les cellules végétales pour leur permettre de récupérer et de stabiliser leurs membranes. Il s'agit d'une étape cruciale pour assurer la survie des cellules et la réussite du transfert de gènes.

Transfert de gènes par Agrobacterium ou Liposomes

Il existe deux formes courantes de transfection des cellules végétales. Elles utilisent soit l'agrobacterium, un genre de bactérie Gram négatif, soit des liposomes comme support du matériel génétique.

• Sonoporation médiée par Agrobacterium : Agrobacterium tumefaciens est une bactérie couramment utilisée dans le génie génétique des plantes. Dans cette méthode, l'ADN plasmidique contenant le gène souhaité est introduit dans Agrobacterium, qui est ensuite mélangé à des cellules végétales. La suspension cellulaire est soumise à une sonoporation à l'aide d'un sonicateur à sonde. L'énergie ultrasonique favorise le transfert du matériel génétique de l'Agrobacterium vers les cellules végétales. Cette méthode est largement utilisée pour la modification génétique des plantes.
• Sonoporation médiée par les liposomes : Les liposomes sont des vésicules à base de lipides qui peuvent transporter du matériel génétique. Dans cette méthode, des liposomes chargés d'ADN plasmidique ou d'autres acides nucléiques sont mélangés à des cellules végétales. La sonoporation à l'aide d'un sonicateur à sonde est utilisée pour faciliter l'absorption des liposomes par les cellules végétales. Les ultrasons rompent les bicouches lipidiques des liposomes, libérant ainsi le matériel génétique dans les cellules végétales. Cette approche est utile pour les études d'expression génique transitoire dans les cellules végétales.

Avantages scientifiquement prouvés de la transformation assistée par sonication de l'Agrobacterium (SAAT)

La transformation assistée par sonication de l'Agrobacterium (SAAT) a été appliquée à de nombreuses espèces végétales. Un traitement ultrasonique court et relativement doux des cultures de cellules végétales provoque une sonoporation, qui permet ensuite une pénétration profonde d'Agrobacterium en tant que transporteur de gènes. Vous trouverez ci-dessous des études exemplaires démontrant les effets bénéfiques de la SAAT.

Transformation de l'ashwagandha assistée par ultrasons

Afin d'améliorer l'efficacité de la transformation de W. somnifera (connue sous le nom d'ashwagandha ou de cerise d'hiver), Dehdashti et ses collègues (2016) ont étudié l'utilisation de l'acétosyringone (AS) et de la sonication.
L'acétosyringone (AS) a été ajoutée en trois étapes : Culture liquide d'Agrobacterium, infection par Agrobacterium et coculture d'explants avec Agrobacterium. L'ajout de 75 μM AS à la culture liquide d'Agrobacterium s'est avéré optimal pour l'induction des gènes vir.
L'application supplémentaire de la sonication (SAAT) a permis d'obtenir l'expression génétique la plus élevée. L'expression du gène gusA dans les racines chevelues s'est avérée meilleure lorsque les feuilles et les extrémités des pousses ont été soniquées pendant 10 et 20 secondes, respectivement. L'efficacité de transformation du protocole amélioré a été enregistrée à 66,5 et 59,5 % dans le cas des explants de feuilles et de pointes de pousses, respectivement. En comparaison avec d'autres protocoles, l'efficacité de transformation de ce protocole amélioré s'est avérée 2,5 fois plus élevée pour les feuilles et 3,7 fois plus élevée pour les extrémités des pousses. Les analyses par Southern blot ont confirmé 1 à 2 copies du transgène gusA dans les lignées W1-W4, alors que 1 à 4 copies du transgène ont été détectées dans la lignée W5 générée par le protocole amélioré.

Effet de la durée de la transformation par sonication assistée par Agrobacterium (SAAT) sur la fréquence de transformation des explants de feuilles (a) et de pointes de pousses (b) de W. somnifera(étude et graphique : © Dehdashti et al., 2016)

Transformation du coton assistée par ultrasons

Hussain et al. (2007) démontrent les effets bénéfiques de la transformation du coton assistée par sonication. La cavitation acoustique provoquée par des ultrasons à basse fréquence crée des microplaies à la surface et sous la surface des tissus végétaux (sonoporation) et permet à Agrobacterium de se déplacer plus profondément et complètement dans les tissus végétaux. Ce mode de blessure augmente la probabilité d'infecter les cellules végétales situées plus profondément dans le tissu. Afin d'évaluer l'efficacité de la transformation de SAAT, l'expression du gène GUS a été mesurée. Le système GUS est un système de gène rapporteur, particulièrement utile en biologie moléculaire végétale et en microbiologie. En ajustant les différents paramètres du SAAT, l'expression transitoire du GUS dans le coton en utilisant des embryons matures comme explants a été significativement améliorée. Le GUS a été détecté pour la première fois 24 heures après l'incubation des explants et à 48 heures, l'expression du GUS était très intense, ce qui a servi d'indicateur utile de la transformation réussie de l'explant de coton après la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT). La comparaison de diverses techniques de transformation (à savoir biolistique, Agro, BAAT, SAAT), la transformation par Agrobacterium assistée par sonication (SAAT) a montré de loin les meilleurs résultats de transformation.

Choix de la procédure de transformation sur la base de l'expression transitoire de GUS. La transformation par sonication assistée par Agrobacterium (SAAT) montre une expression transitoire significativement plus élevée.(étude et graphique : © Hussain et al., 2007)

Solutions ultrasoniques de haute performance pour la sonoporation et le SAAT

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