Production de chitine et de chitosan à partir de champignons

L'ultrasonication est une méthode très efficace pour libérer la chitine et le chitosan de sources fongiques telles que les champignons. La chitine et le chitosan doivent être désacétylés lors du traitement en aval afin d'obtenir un biopolymère de haute qualité. La désacétylation assistée par ultrasons est une technique très efficace, simple et rapide, qui permet d'obtenir des chitosanes de haute qualité, avec un poids moléculaire élevé et une biodisponibilité supérieure.

La chitine et le chitosan des champignons

Les champignons comestibles et médicinaux tels que Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ou reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (champignon de Paris), Hericium erinaceus (crinière de lion), Cordyceps sinensis (champignon chenille), Grifola frondosa (poule du bois), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, queue de dindon) et de nombreuses autres espèces de champignons sont largement utilisées comme aliments et pour l'extraction de composés bioactifs. Ces champignons ainsi que les résidus de traitement (déchets de champignons) peuvent être utilisés pour produire du chitosan. Les ultrasons favorisent non seulement la libération de la chitine de la structure de la paroi cellulaire fongique, mais aussi la conversion de la chition en chitosane précieux par dépolymérisation ultrasonique.

La désacétylation de la chitine en chitosane est favorisée par la sonication.

chitineLa chitine, qui est un polymère de N-acétylglucosamine (poly-(β-(1-4)-N-acétyl-D-glucosamine), est un polysaccharide naturel largement présent dans l'exosquelette des invertébrés tels que les crustacés et les insectes, dans le squelette interne des calmars et des seiches ainsi que dans les parois cellulaires des champignons. Intégrée dans la structure des parois cellulaires des champignons, la chitine est responsable de la forme et de la rigidité de la paroi cellulaire des champignons. Pour de nombreuses applications, la chitine est convertie en son dérivé désacétylé, connu sous le nom de chitosan, par un processus de dépolymérisation.
chitosane est le dérivé le plus courant et le plus précieux de la chitine. Il s'agit d'un polysaccharide de poids moléculaire élevé lié par un glycoside b-1,4, composé de N-acétyl-glucosamine et de glucosamine.
Le chitosan peut être dérivé par voie chimique ou enzymatique. n-désacétylation. Dans le processus de désacétylation par voie chimique, le groupe acétyle (R-NHCOCH₃) est clivé par un alcali fort à haute température. Le chitosan peut également être synthétisé par désacétylation enzymatique. Cependant, à l'échelle de la production industrielle, la désacétylation chimique est la technique préférée, car la désacétylation enzymatique est nettement moins efficace en raison du coût élevé des enzymes désacétylases et des faibles rendements en chitosane obtenus. L'ultrasonication est utilisée pour intensifier la dégradation chimique de la liaison (1→4)-/β (dépolymérisation) et effectuer la désacétylation de la chitine pour obtenir un chitosane de haute qualité. Lorsque la sonication est appliquée comme prétraitement pour la désacétylation enzymatique, le rendement et la qualité du chitosan sont également améliorés.

Production industrielle de chitosane à partir de champignons avec des ultrasons

La production commerciale de chitine et de chitosan est principalement basée sur les déchets des industries marines (c'est-à-dire la pêche, la récolte de coquillages, etc.). Les différentes sources de matières premières donnent lieu à des qualités de chitine et de chitosan différentes, ce qui entraîne des fluctuations de production et de qualité dues aux variations saisonnières de la pêche. En outre, le chitosan dérivé de sources fongiques offre des propriétés apparemment supérieures, comme une longueur de polymère homogène et une plus grande solubilité, par rapport au chitosan provenant de sources marines. (cf. Ghormade et al., 2017) Afin de fournir un chitosan uniforme, l'extraction de la chitine à partir d'espèces fongiques est devenue une production alternative stable. La production de chitine et de citiosan à partir de champignons peut être réalisée de manière simple et fiable en utilisant la technologie d'extraction et de désacétylation par ultrasons. La sonication intense perturbe les structures cellulaires pour libérer la chitine et favorise le transfert de masse dans les solvants aqueux pour des rendements supérieurs de chitine et une efficacité d'extraction. La désacétylation ultrasonique ultérieure convertit la chitine en chitosane de valeur. L'extraction de la chitine par ultrasons et la désacétylation du chitosane peuvent être mises à l'échelle de façon linéaire pour tout niveau de production commerciale.

La sonication intensifie la production de chitosane fongique et rend la production plus efficace et économique.
(photo et étude : © Zhu et al., 2019)

Synthèse hautement efficace du chitosane par sonication

Afin de surmonter les inconvénients (faible efficacité, coût énergétique élevé, long temps de traitement, solvants toxiques) de la désacétylation chimique et enzymatique traditionnelle de la chitine, les ultrasons de haute intensité ont été intégrés dans le traitement de la chitine et du chitosane. La sonication à haute intensité et les effets de cavitation acoustique qui en résultent entraînent une scission rapide des chaînes de polymères et réduisent la polydispersité, favorisant ainsi la synthèse du chitosane. De plus, les forces de cisaillement ultrasoniques intensifient le transfert de masse dans la solution de sorte que les réactions chimiques, hydrolytiques ou enzymatiques sont améliorées.

Déacétylation et dépolymérisation chimiques assistées par ultrasons

La chitine étant un biopolymère non réactif et insoluble, elle doit subir les étapes de déminéralisation, déprotéinisation et dépolymérisation/désacétylation afin d'obtenir un chitosane soluble et bioaccessible. Ces étapes impliquent des traitements avec des acides forts tels que HCl et des bases fortes telles que NaOH et KOH. Comme ces étapes conventionnelles du processus sont inefficaces, lentes et demandent beaucoup d'énergie, l'intensification du processus par sonication améliore considérablement la production de chitosane. L'application d'ultrasons puissants augmente les rendements et la qualité du chitosane, réduit le processus de plusieurs jours à quelques heures, permet l'utilisation de solvants plus doux et rend l'ensemble du processus plus économe en énergie.

Déprotéinisation de la chitine améliorée par ultrasons

Vallejo-Dominguez et al. (2021) ont constaté dans leur enquête sur la déprotéinisation de la chitine que "l'application d'ultrasons pour la production de biopolymères a réduit la teneur en protéines ainsi que la taille des particules de chitine. Le chitosane de haut degré de désacétylation et de poids moléculaire moyen a été produit par l'assistance des ultrasons.

Hydrolyse ultrasonique pour la dépolymérisation de la chitine

Pour l'hydrolyse chimique, on utilise soit des acides soit des alcalis pour désacétyler la chitine, mais la désacétylation alcaline (par exemple, l'hydroxyde de sodium NaOH) est plus largement utilisée. L'hydrolyse acide est une méthode alternative à la désacétylation chimique traditionnelle, où des solutions d'acides organiques sont utilisées pour dépolymériser la chitine et le chitosan. La méthode de l'hydrolyse acide est surtout utilisée lorsque le poids moléculaire de la chitine et du chitosan doit être homogène. Ce procédé d'hydrolyse classique est connu pour être lent et gourmand en énergie et en coûts. La nécessité d'utiliser des acides forts, des températures et des pressions élevées sont des facteurs qui font du procédé d'hydrolyse du chitosane une procédure très coûteuse et longue. Les acides utilisés nécessitent des processus en aval tels que la neutralisation et le dessalage.
Grâce à l'intégration d'ultrasons de forte puissance dans le processus d'hydrolyse, les exigences en matière de température et de pression pour le clivage hydrolytique de la chitine et du chitosan peuvent être considérablement réduites. En outre, la sonication permet de réduire les concentrations d'acide ou d'utiliser des acides plus doux. Cela rend le processus plus durable, plus efficace, plus rentable et plus respectueux de l'environnement.

Déacétylation chimique assistée par ultrasons

La désintégration chimique et la désactylation de la chitine et du chitosane sont principalement réalisées en traitant la chitine ou le chitosane avec des acides minéraux (par exemple, l'acide chlorhydrique HCl), le nitrite de sodium (NaNO₂), ou du peroxyde d'hydrogène (H₂la₂). Les ultrasons améliorent la vitesse de désacétylation et raccourcissent ainsi le temps de réaction nécessaire pour obtenir le degré de désacétylation visé. En d'autres termes, la sonication réduit le temps de traitement requis de 12 à 24 heures à quelques heures. En outre, la sonication permet d'obtenir des concentrations chimiques nettement plus faibles, par exemple 40 % (p/p) d'hydroxyde de sodium en utilisant la sonication alors que 65 % (p/p) sont nécessaires sans l'utilisation des ultrasons.

Déacétylation enzymatique par ultrasons

Bien que la désacétylation enzymatique soit une forme de traitement douce et respectueuse de l'environnement, son efficacité et ses coûts ne sont pas rentables. En raison de l'isolement et de la purification complexes, coûteux et nécessitant beaucoup de travail des enzymes du produit final, la désacétylation enzymatique de la chitine n'est pas mise en œuvre dans la production commerciale, mais uniquement dans les laboratoires de recherche scientifique.
Le prétraitement par ultrasons avant la désacétylation enzymatique fragmente les molécules de chitine, élargissant ainsi la surface et rendant plus de surface disponible pour les enzymes. La sonication haute performance permet d'améliorer la désacétylation enzymatique et rend le processus plus économique.

Résultats de recherche pour la désacétylation ultrasonique de la chitine et du chitosan

Zhu et al. (2018) concluent dans leur étude que la désacétylation par ultrasons s'est avérée être une percée cruciale, convertissant la β-chitine en chitosane avec une désacétylation de 83 à 94 % à des températures de réaction réduites. L'image de gauche montre une image SEM de chitosane désacétylé par ultrasons (90 W, 15 min, 20 p/v% NaOH, 1:15 (g : mL). (photo et étude : © Zhu et al., 2018)
Dans leur protocole, une solution de NaOH (20 % p/v) a été préparée en dissolvant des paillettes de NaOH dans de l'eau DI. La solution alcaline a ensuite été ajoutée au sédiment GLSP (0,5 g) à un rapport solide-liquide de 1:20 (g : mL) dans un tube à centrifuger. Le chitosan a été ajouté au NaCl (40 mL, 0,2 M) et à l'acide acétique (0,1 M) dans un rapport volumique de solution 1:1. La suspension a ensuite été soumise à des ultrasons à une température douce de 25°C pendant 60 min à l'aide d'un ultrasoniseur de type sonde (250W, 20kHz). (cf. Zhu et al., 2018)
Pandit et al. (2021) ont constaté que la vitesse de dégradation des solutions de chitosan est rarement affectée par les concentrations d'acide utilisées pour solubiliser le polymère et dépend largement de la température, de l'intensité des ondes ultrasonores et de la force ionique du milieu utilisé pour dissoudre le polymère. (cf. Pandit et al., 2021)

Dans une autre étude, Zhu et al. (2019) ont utilisé des poudres de spores de Ganoderma lucidum comme matière première fongique et ont étudié la désacétylation assistée par ultrasons et les effets des paramètres de traitement tels que le temps de sonication, le rapport solide-liquide, la concentration de NaOH et la puissance d'irradiation sur le degré de désacétylation (DD) du chitosane. La valeur de DD la plus élevée a été obtenue avec les paramètres ultrasoniques suivants : 20 min de sonication à 80W, 10% (g:ml) de NaOH, 1:25 (g:ml). La morphologie de surface, les groupes chimiques, la stabilité thermique et la cristallinité du chitosane obtenu par ultrasons ont été examinés à l'aide du MEB, de l'IRTF, de la TG et de la DRX. L'équipe de recherche rapporte une amélioration significative du degré de désacétylation (DD), de la viscosité dynamique ([η]) et du poids moléculaire (Mv¯) du chitosane produit par ultrasons. Les résultats ont souligné que la technique de désacétylation ultrasonique des champignons est une méthode de production très puissante pour le chitosan, qui convient aux applications biomédicales. (cf. Zhu et al., 2019)

Images MEB de chitines et de chitosans provenant de deux espèces de champignons : a) chitine de L. vellereus ; b) chitine de P. ribis ; c) chitosane de L. vellereus ; d) chitosane de P. ribis.
photo et étude : © Erdoğan et al., 2017

Qualité supérieure du chitosan grâce à la désacétylation par ultrasons

Les processus d'extraction et de dépolymérisation de la chitine et du chitosane par ultrasons sont contrôlables avec précision et les paramètres du processus ultrasonique peuvent être ajustés aux matières premières et à la qualité du produit final visé (par exemple, le poids moléculaire, le degré de désacétylation). Cela permet d'adapter le processus ultrasonique aux facteurs externes et de définir des paramètres optimaux pour un résultat et une efficacité supérieurs.
Le chitosan désacétylé par ultrasons présente une excellente biodisponibilité et biocompatibilité. Lorsque les biopolymères de chitosane préparés par ultrasons sont comparés au chitosane dérivé thermiquement en ce qui concerne les propriétés biomédicales, le chitosane produit par ultrasons présente une viabilité des fibroblastes (cellules L929) nettement améliorée et une activité antibactérienne accrue pour Escherichia coli (E. coli) et Staphylococcus aureus (S. aureus).
(cf. Zhu et al., 2018)

Comment fonctionne l'extraction par ultrasons et la désacétylation de la chitine ?

Lorsque des ondes ultrasonores de puissance sont couplées dans un liquide ou une suspension (par exemple, une suspension constituée de chitine dans un solvant), les ondes ultrasonores se propagent dans le liquide en provoquant des cycles alternés de haute et de basse pression. Pendant les cycles de basse pression, de minuscules bulles de vide (appelées bulles de cavitation) sont créées, qui grossissent sur plusieurs cycles de pression. À une certaine taille, lorsque les bulles ne peuvent plus absorber d'énergie, elles implosent violemment au cours d'un cycle de haute pression. L'implosion des bulles est caractérisée par des forces cavitationnelles (ou sonomécaniques) intenses. Ces conditions sonomécaniques se produisent localement dans le point chaud de la cavitation et sont caractérisées par des températures et des pressions très élevées, pouvant atteindre respectivement 4 000 K et 1 000 atm, ainsi que par des différentiels de température et de pression élevés correspondants. De plus, des micro-turbulences et des courants liquides avec des vitesses allant jusqu'à 100m/s sont générés. L'extraction par ultrasons de la chitine et du chitosane à partir de champignons et de crustacés ainsi que la dépolymérisation et la désacétylation de la chitine sont principalement dues aux effets sonomécaniques : l'agitation et les turbulences perturbent les cellules et favorisent le transfert de masse et peuvent également couper les chaînes de polymère en combinaison avec des solvants acides ou alcalins.
Principe de fonctionnement de l'extraction de la chitine par ultrasons : L'extraction par ultrasons brise efficacement la structure cellulaire des champignons et libère les composés intracellulaires de la paroi et de l'intérieur des cellules (c'est-à-dire les polysaccharides tels que la chitine et le chitosan et d'autres substances phytochimiques bioactives) dans le solvant. L'extraction par ultrasons repose sur le principe de fonctionnement de la cavitation acoustique. Les effets de la cavitation ultrasonique/acoustique sont des forces de cisaillement élevées, des turbulences et des différences de pression intenses. Ces forces sonomécaniques brisent les structures cellulaires telles que les parois cellulaires chitineuses des champignons, favorisent le transfert de masse entre le biomatériau fongique et le solvant et permettent d'obtenir des rendements d'extraction très élevés dans un processus rapide. En outre, la sonication favorise la stérilisation des extraits en tuant les bactéries et les microbes. L'inactivation microbienne par la sonication est le résultat des forces de cavitation destructrices de la membrane cellulaire, de la production de radicaux libres et de l'échauffement localisé.
Principe de fonctionnement de la dépolymérisation et de la désacétylation par ultrasons : Les chaînes de polymère sont prises dans le champ de cisaillement autour d'une bulle et les segments de chaîne de la bobine de polymère proches d'une cavité qui s'effondre se déplacent à une vitesse plus élevée que ceux qui sont plus éloignés. Des contraintes sont alors produites sur la chaîne de polymère en raison du mouvement relatif des segments de polymère et des solvants et celles-ci sont suffisantes pour provoquer un clivage. Le processus est donc similaire à d'autres effets de cisaillement dans les solutions de polymères ~2° et donne des résultats très similaires. (cf. Price et al., 1994)

Équipement ultrasonique haute performance pour le traitement de la chitine et du chitosane fongiques

Images au microscope électronique à balayage (MEB) avec un grossissement de 100× de a) gladius, b) gladius traité par ultrasons, c) β-chitine, d) β-chitine traitée par ultrasons, et e) chitosan (source : Preto et al. 2017)

La fragmentation de la chitine et la décétylation de la chitine en chitosane nécessitent un équipement ultrasonique puissant et fiable, capable de délivrer des amplitudes élevées, d'offrir un contrôle précis des paramètres du processus et de fonctionner 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7 sous forte charge et dans des environnements exigeants. La gamme de produits de Hielscher Ultrasonics répond à ces exigences de manière fiable. En plus d'une performance ultrasonore exceptionnelle, les ultrasons Hielscher sont dotés d'un rendement énergétique élevé, ce qui constitue un avantage économique significatif. – surtout lorsqu'ils sont utilisés pour une production commerciale à grande échelle.
Les ultrasons Hielscher sont des systèmes performants qui peuvent être équipés d'accessoires tels que des sonotrodes, des boosters, des réacteurs ou des cellules d'écoulement afin de répondre de manière optimale aux besoins de votre procédé.L'affichage numérique en couleur, la possibilité de prédéfinir des cycles de sonication, l'enregistrement automatique des données sur une carte SD intégrée, le contrôle à distance par navigateur et bien d'autres fonctions encore garantissent un contrôle optimal du processus et une grande convivialité. Associés à leur robustesse et à leur capacité de charge élevée, les systèmes à ultrasons Hielscher sont des outils de travail fiables pour la production. La fragmentation et la désacétylation de la chitine nécessitent des ultrasons puissants pour obtenir la conversion ciblée et un produit chitosan final de haute qualité. En particulier pour la fragmentation des flocons de chitine et les étapes de dépolymérisation/désacétylation, des amplitudes élevées et des pressions élevées sont cruciales. Les processeurs ultrasoniques industriels de Hielscher Ultrasonics fournissent facilement des amplitudes très élevées. Des amplitudes allant jusqu'à 200 µm peuvent être utilisées en continu, 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7. Pour des amplitudes encore plus élevées, des sonotrodes ultrasoniques personnalisées sont disponibles. La capacité de puissance des systèmes à ultrasons Hielscher permet une désacétylation efficace et rapide dans un processus sûr et convivial.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators: