Formation de fibrilles amyloïdes à l'aide du sonificateur de microplaques UIP400MTP

Les fibrilles amyloïdes, tout comme les cristaux, se forment par un processus de nucléation et de croissance ultérieure. Cependant, en raison de la barrière d'énergie libre élevée de la nucléation, la formation spontanée de fibrilles amyloïdes ne se produit qu'après une phase de latence prolongée. Les ultrasons sont apparus comme un outil puissant pour induire la nucléation de l'amyloïde, accélérant ainsi de manière significative la formation de fibrilles. Associée à un lecteur de microplaques utilisant la fluorescence de la thioflavine T (ThT), l'ultrasonication permet une détection à haut débit des fibrilles amyloïdes dans plusieurs échantillons simultanément.

Formation de fibrilles amyloïdes induite par ultrasons avec le sonificateur de microplaques UIP400MTP

Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP permet de synthétiser rapidement des fibrilles amyloïdes de même qualité et en grande quantité à des fins de recherche. Cette approche efficace permet d'étudier l'amyloïdogénicité des protéines. Cette technique facilite la fibrillation amyloïde rapide et reproductible, comme cela a été démontré avec la β2-microglobuline (β2-m), une protéine amyloïdogène associée à l'amylose liée à la dialyse.

Approche expérimentale simple : Fibrillation amyloïde induite par ultrasons

Pour induire la formation de fibrilles, une microplaque de 96 puits a été placée au centre du sonicateur de plaques multi-puits UIP400MTP, ce qui garantit une exposition uniforme aux ultrasons dans tous les puits. Les conditions expérimentales étaient les suivantes :

1. Chaque puits contenait 0,2 ml de solution de β2-microglobuline (0,3 mg/ml, pH 2,5) complétée par 5 μM ThT.
2. La plaque a été soumise à des cycles d'ultrasons, tels qu'une minute d'ultrasons suivie de 9 minutes de pause.
3. Après la sonication, la fluorescence du ThT a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques.

(cf. So et al., 2011)

Comparaison avec l'agitation conventionnelle

Par rapport aux méthodes d'agitation traditionnelles, l'ultrasonication a considérablement réduit la phase de latence de la formation de fibrilles. Dans les conditions classiques d'agitation des microplaques, seul 1 puits sur 10 présentait une augmentation de la fluorescence du ThT après 20 heures. En revanche, en utilisant une ultrasonication cyclique (15 minutes de sonication suivies de 5 minutes de repos), une augmentation significative de la fluorescence du ThT a été détectée immédiatement après le premier traitement par sonication.

Accélération rapide de la cinétique de la fibrillation

Les résultats obtenus par So et al. (2011) ont démontré que la formation spontanée de fibrilles de β2-microglobuline à pH 2,5 peut être accélérée de plusieurs heures à seulement 10-15 minutes avec l'ultrasonication.
Les images de microscopie à force atomique (AFM) ont confirmé que les fibrilles générées par une ultrasonication de 10 minutes toutes les 15 minutes étaient morphologiquement indiscernables de celles formées par une ultrasonication de 1 minute toutes les 10 minutes. Cela met en évidence la reproductibilité et la robustesse de la fibrillation amyloïde induite par ultrasons.

Images AFM de fibrilles amyloïdes produites par une ultrasonication de 1 min toutes les 10 min (i), par une sonication de 10 min toutes les 15 min (ii), et par la réaction d'ensemencement sans ultrasonication (iii). La barre d'échelle blanche représente 1 μm.
Étude et images : ©So et al., 2011

Fibrillation dans des conditions de pH neutre

Même dans des conditions de pH neutre, la formation de fibrilles a été obtenue après un temps de latence de 1,5 heure, ce qui démontre que l'ultrasonication abaisse considérablement la barrière énergétique à la nucléation et à la croissance. Cela confirme l'hypothèse selon laquelle la fibrillation amyloïde est avant tout une réaction physique, largement limitée par la barrière énergétique de la nucléation, que les ultrasons réduisent efficacement.

Impact sur la recherche sur les maladies liées à l'amyloïde

La formation facile et fiable de fibrilles amyloïdes à l'aide du sonicateur pour microplaques UIP400MTP a des implications significatives pour la recherche sur la maladie d'Alzheimer et d'autres troubles liés à l'amyloïde, tels que la maladie de Parkinson, le diabète de type II et les amyloïdoses systémiques. Dans la maladie d'Alzheimer, l'agrégation de l'amyloïde-β (Aβ) est une caractéristique pathologique clé, mais l'étude de sa cinétique de fibrillation reste difficile en raison des longues phases de latence et de la variabilité des méthodes conventionnelles. La formation de fibrilles par ultrasons accélère la nucléation, garantissant une reproductibilité élevée et une variabilité réduite, ce qui est crucial pour le criblage d'inhibiteurs potentiels et la compréhension des mécanismes amyloïdogènes. En outre, la capacité à haut débit de l'UIP400MTP permet des recherches à grande échelle sur le mauvais repliement et l'agrégation des protéines, ce qui facilite la découverte d'agents thérapeutiques capables de moduler la formation de fibrilles et d'atténuer potentiellement la progression de la maladie neurodégénérative.

Cette étude établit que l'ultrasonication à l'aide du sonicateur UIP400MTP pour plaques multi-puits est une méthode très efficace pour accélérer la formation de fibrilles amyloïdes. Les principaux avantages de cette approche sont les suivants :

• Réduction spectaculaire du temps de latence de la fibrillation.
• Exposition uniforme aux ultrasons dans tous les puits, permettant une formation reproductible des fibrilles.
• Capacité de criblage à haut débit, ce qui le rend adapté à la recherche de l'amyloïdogénicité des protéines à l'échelle du génome.

En intégrant l'ultrasonication à la détection de la fluorescence ThT, cette méthode fournit une plateforme rapide, évolutive et fiable pour étudier la fibrillation amyloïde. Compte tenu de son efficacité et de son potentiel à haut débit, cette approche pourrait faciliter la synthèse de fibrilles amyloïdes pour la recherche biophysique et pharmaceutique, offrant ainsi un outil prometteur pour les études liées à l'amyloïde et le criblage de médicaments.