PMCA pour la détection à haut débit des prions à l'aide du sonicateur UIP400MTP

Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP offre une solution puissante pour la préparation d'échantillons à haut débit dans le cadre de l'amplification cyclique du mauvais repliement des protéines (PMCA). En fournissant une distribution uniforme de l'énergie dans plusieurs puits et en maintenant des paramètres de sonication précis, ce système permet le traitement simultané de nombreux échantillons avec une reproductibilité exceptionnelle. Ces capacités sont essentielles pour optimiser la PMCA afin de détecter les prions à de faibles concentrations dans des échantillons biologiques difficiles, tels que la salive, où les inhibiteurs d'essai peuvent obscurcir les résultats.

Les maladies à prions, telles que la maladie du dépérissement chronique (MDC) chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) chez l'homme, sont des troubles neurodégénératifs causés par des protéines prions mal repliées (PrP^Sc). Ces maladies impliquent souvent de faibles niveaux de prions infectieux dans les fluides corporels, tels que la salive, le sang et l'urine, ce qui complique le diagnostic et la recherche. La transmission horizontale de l'encéphalopathie des cervidés par les prions présents dans les matrices environnementales a des implications particulièrement importantes pour la gestion de la faune sauvage et la santé écologique. De même, dans le cas de maladies telles que la maladie de Creutzfeldt-Jakob, l'amplification fiable des protéines prions mal repliées à partir d'échantillons humains est cruciale pour faire progresser le diagnostic et comprendre la progression de la maladie.

L'application d'un protocole PMCA modifié permet de contourner les inhibiteurs courants de l'essai (par exemple, les mucines dans la salive) et d'atteindre une grande sensibilité dans la détection des prions qui seraient autrement indétectables ou ambigus en utilisant des techniques telles que la conversion en temps réel induite par la secousse (RT-QuIC). Ces progrès améliorent la détection des prions pour diverses maladies, ce qui fait de la PMCA un outil indispensable pour la recherche et le diagnostic des prions. Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP facilite la sonification à haut débit de nombreux échantillons dans des microplaques (par exemple des plaques à 6, 24 ou 96 puits) ou dans des flacons dans un rack à tubes.

Protocole d'amplification cyclique du mauvais repliement des protéines (PMCA) à haut débit

Le protocole suivant permet de traiter efficacement un grand nombre d'échantillons dans les mêmes conditions pour obtenir des résultats de recherche fiables.

préparation des échantillons

Matériau de départ :
Préparer les échantillons en :

• Remise en suspension des culots d'extraction de sarkosyl dans le substrat PMCA.
• L'ensemencement direct d'homogénats de cerveau ou d'échantillons de sang avec des graines de prions.

Substrat :

• Utiliser un homogénat de cerveau à 10 % (pt/vol) préparé à partir de souris transgéniques surexprimant la PrP^C (par exemple, les souris Tg).
• Homogénéiser le tissu cérébral en :
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% de Triton X-100.
• Conserver le substrat à -80ºC jusqu'à son utilisation.

Mise en place de l'échantillon en microplaque ou en tube :
Tubes :

• Ajouter 90 μL de substrat d'homogénat de cerveau et ensemencer avec 10 μL d'échantillon (par exemple, sang, homogénat de cerveau ou culot de sarkosyl).
• Placer 3 billes de téflon (1,59 mm ou 2,38 mm de diamètre) dans chaque tube de 0,2 ml.
• Monter les tubes dans un rack compatible avec le sonicateur UIP400MTP.

Microplaque à 6 puits :

• Ajouter 5 ml de substrat d'homogénat de cerveau et ensemencer avec 500 μL d'échantillon par puits.
• Ajouter 3 billes de téflon dans chaque puits.

Procédure PMCA

Placement :
Placer le portoir de tubes ou la microplaque à 6 puits dans le sonicateur UIP400MTP conformément aux instructions du fabricant.

Programme de cyclisme :
Effectuer 144 cycles PMCA comme suit :

• Incubation : 29 minutes et 30 secondes à 37°C.
• Sonication : 30 secondes à 60 % d'amplitude.
• Contrôlez la température : Utilisez le capteur de température enfichable pour surveiller la température de l'échantillon et programmez l'UIP400MTP à une température maximale de 48-50°C.

Tours suivants :
Après avoir effectué la première série de 144 cycles, transférer une partie aliquote du matériel amplifié :

• Diluer 10 fois dans un substrat d'homogénat de cerveau de souris transgénique frais.
• Effectuer 96 cycles PMCA pour les cycles suivants, en conservant les mêmes paramètres de sonication.
• Continuez pendant le nombre de tours souhaité (généralement jusqu'à 5).

Détection de la PrP^Sc

1. Protéinase K Digestion :
   – Traiter les échantillons avec de la protéinase K (50 μg/mL) à 37°C pendant 1 heure.
   – Terminer la digestion en ajoutant un tampon SDS pour échantillons et en faisant bouillir pendant 10 minutes.
2. Analyse Western Blot :
   – Analyser les échantillons digérés en utilisant :
   – 6H4 ou anticorps anti-PrP PRC1.
   – Effectuer un SDS-PAGE et transférer sur des membranes PVDF pour la détection.

 

 

Traiter plus d'échantillons pour des résultats plus robustes

Le sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP améliore considérablement l'efficacité et l'évolutivité de l'amplification cyclique du mauvais repliement des protéines (PMCA), en s'attaquant à la nature traditionnellement chronophage de la procédure. En permettant le traitement simultané de 96 échantillons dans une plaque à 96 puits, le système rationalise les flux de travail PMCA tout en maintenant des conditions de sonication précises et uniformes dans tous les puits. Cette capacité à haut débit minimise les manipulations manuelles, réduit les étapes laborieuses et garantit la reproductibilité, ce qui en fait un outil indispensable pour la recherche sur les prions. Qu'il s'agisse de la maladie du dépérissement chronique ou de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, l'UIP400MTP facilite les études à grande échelle avec une plus grande efficacité, ce qui permet aux chercheurs de répondre aux exigences des applications diagnostiques et scientifiques modernes.

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Littérature / Références

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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