PMCA pour la détection à haut débit des prions à l’aide du sonicateur UIP400MTP

Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP offre une solution puissante pour la préparation d’échantillons à haut débit dans l’amplification cyclique des protéines mal repliées (PMCA). En assurant une distribution uniforme de l’énergie sur de multiples puits et en maintenant des paramètres de sonication précis, ce système permet le traitement simultané de nombreux échantillons avec une reproductibilité exceptionnelle. Ces capacités sont essentielles pour optimiser la PMCA afin de détecter les prions à de faibles concentrations dans des échantillons biologiques complexes, tels que la salive, où les inhibiteurs de dosage peuvent masquer les résultats.

Les maladies à prions, telles que la maladie du dépérissement chronique (CWD) chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob (CJD) chez l’humain, sont des troubles neurodégénératifs causés par des protéines prioniques mal repliées (PrP^Sc). Ces maladies impliquent souvent de faibles niveaux de prions infectieux dans les fluides corporels, tels que la salive, le sang et l’urine, ce qui complique le diagnostic et la recherche. La transmission horizontale de la CWD par des prions disséminés dans les matrices environnementales a des implications particulièrement importantes pour la gestion de la faune sauvage et la santé écologique. De même, dans des maladies comme la maladie de Creutzfeldt-Jakob, l’amplification fiable des protéines prioniques mal repliées à partir d’échantillons humains est cruciale pour faire progresser les diagnostics et comprendre la progression de la maladie.

L’application d’un protocole PMCA modifié permet de contourner les inhibiteurs de dosage courants (p. ex. les mucines dans la salive) et d’atteindre une sensibilité élevée dans la détection de prions qui seraient autrement indétectables ou ambigus avec des techniques telles que la conversion induite par agitation en temps réel (RT-QuIC). Ces avancées améliorent la détection des prions pour diverses maladies, faisant de la PMCA un outil indispensable pour la recherche et le diagnostic des prions. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP facilite la PMCA à haut débit en soniquant de nombreux échantillons dans des microplaques (p. ex. plaques à 6, 24 ou 96 puits) ou des flacons dans un portoir.

Protocole pour l’amplification cyclique des protéines mal repliées (PMCA) à haut débit

Le protocole suivant permet le traitement efficace d’un grand nombre d’échantillons dans des conditions exactement identiques pour des résultats de recherche robustes.

Préparation des échantillons

Matériel de départ :
Préparez les échantillons en :

• Remettant en suspension les culots d’extraction au sarkosyl dans le substrat PMCA.
• Ensemençant directement les homogénats de cerveau ou les échantillons de sang avec des germes de prions.

Substrat :

• Utilisez un homogénat de cerveau à 10 % (p/v) préparé à partir de souris transgéniques surexprimant PrP^C (p. ex. souris Tg).
• Homogénéisez le tissu cérébral dans :
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1 % Triton X-100.
• Conservez le substrat à -80 ºC jusqu’à utilisation.

Mise en place des échantillons en microplaque ou en tubes :
Tubes :

• Ajoutez 90 μL de substrat d’homogénat de cerveau et ensemencez avec 10 μL d’échantillon (p. ex. sang, homogénat de cerveau ou culot au sarkosyl).
• Placez 3 billes de Téflon (1,59 mm ou 2,38 mm de diamètre) dans chaque tube de 0,2 mL.
• Montez les tubes dans un portoir compatible avec le sonicateur UIP400MTP.

Microplaque à 6 puits :

• Ajoutez 5 mL de substrat d’homogénat de cerveau et ensemencez avec 500 μL d’échantillon par puits.
• Ajoutez 3 billes de Téflon dans chaque puits.

Procédure PMCA

Mise en place :
Placez le portoir à tubes ou la microplaque à 6 puits dans le sonicateur UIP400MTP conformément aux instructions du fabricant.

Programme de cycles :
Effectuez 144 cycles PMCA comme suit :

• Incubation : 29 minutes et 30 secondes à 37 °C.
• Sonication : 30 secondes à 60 % d’amplitude.
• Surveillez la température : utilisez la sonde de température enfichable pour surveiller la température de l’échantillon et programmez le UIP400MTP à une température maximale de 48–50 °C.

Séries suivantes :
Après avoir terminé la première série de 144 cycles, transférez une aliquote du matériel amplifié :

• Diluez 10 fois dans du substrat frais d’homogénat de cerveau de souris transgénique.
• Effectuez 96 cycles PMCA pour les séries suivantes, en conservant les mêmes paramètres de sonication.
• Poursuivez pour le nombre de séries souhaité (généralement jusqu’à 5).

Détection de PrP^Sc

1. Digestion à la protéinase K :
   – Traitez les échantillons avec de la protéinase K (50 μg/mL) à 37 °C pendant 1 heure.
   – Arrêtez la digestion en ajoutant du tampon d’échantillon SDS et en faisant bouillir pendant 10 minutes.
2. Analyse par Western blot :
   – Analysez les échantillons digérés à l’aide de :
   – anticorps anti-PrP 6H4 ou PRC1.
   – Réalisez une SDS-PAGE et transférez sur des membranes PVDF pour la détection.

 

Le Hielscher UIP400MTP est le sonicateur le plus polyvalent pour vos plaques multipuits, plaques PCR ou tubes d’échantillons. Avec une puissance de sonication continue de 400 watts, il est conçu pour des applications telles que la lyse cellulaire, l’émulsification, l’extraction des protéines, la fragmentation de l’ADN / ARN, la désagglomération, l’extraction à partir d’échantillons FFPE, le détachement des cellules et des biofilms ou l’émulsification. Le UIP400MTP n’est pas un bain à ultrasons. Il s’agit d’une sonotrode en coupelle de haute intensité pour une sonication focalisée. Ce puissant sonicateur sans contact assure une sonication uniforme dans tous les puits de votre plaque multipuits standard. Vous contrôlez précisément l’amplitude, la puissance et le fonctionnement pulsé. Une minuterie intégrée et une sonde de température garantissent des résultats constants. Le sonicateur pour plaques UIP400MTP refroidit les échantillons au moyen d’un bain d’eau (refroidisseur externe en option).

 

Traitez plus d’échantillons pour des résultats plus robustes

Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP améliore considérablement l’efficacité et l’évolutivité de l’amplification cyclique des protéines mal repliées (PMCA), répondant à la nature traditionnellement chronophage de la procédure. En permettant le traitement simultané de jusqu’à 96 échantillons dans une plaque à 96 puits, le système rationalise les flux de travail PMCA tout en maintenant des conditions de sonication précises et uniformes sur l’ensemble des puits. Cette capacité à haut débit minimise la manipulation manuelle, réduit les étapes laborieuses et garantit la reproductibilité, ce qui en fait un outil indispensable pour la recherche sur les prions. Qu’il s’agisse d’étudier la maladie du dépérissement chronique ou la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le UIP400MTP facilite les études à grande échelle avec une plus grande efficacité, permettant aux chercheurs de répondre aux exigences des applications diagnostiques et scientifiques modernes.

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Bibliographie / Références

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