Kitiinin deasetylointi kitosaaniksi ultraäänellä
Kitosaanin tuotanto ultraäänellä
Kitosaania saadaan kitiinin N-deasetyloinnilla. Tavanomaisessa deasetyloinnissa kitiiniä liotetaan emäksisissä vesiliuoksissa (tyypillisesti 40–50 % (w/w) NaOH). Liotusprosessi vaatii korkeita, 100–120 ºC:n lämpötiloja ja vie erittäin paljon aikaa, ja kustakin liotusvaiheesta saatavan kitosaanin saanto on pieni. Suuritehoisen ultraäänen käyttö tehostaa kitiinin deasetylointiprosessia merkittävästi ja tuottaa suuren saannon pienimolekyylistä kitosaania nopealla käsittelyllä alhaisemmassa lämpötilassa. Ultraäänideasetylointi tuottaa huippulaatuista kitosaania, jota käytetään elintarvikkeiden ja lääkkeiden ainesosana, lannoitteena ja monissa muissa teollisissa sovelluksissa.
Ultraäänikäsittely saa aikaan poikkeuksellisen asetylointiasteen (DA) alentamalla kitiinin asetylointiasteen tasolta DA≥90 kitosaaniksi, jonka DA≤10.
Monet tutkimukset vahvistavat ultraäänen tehokkuuden kitiinin deasetyloinnissa kitosaaniksi. Weiss J. ym. (2008) havaitsivat, että ultraäänikäsittely parantaa kitiinin muuntumista kitosaaniksi huomattavasti. Kitiinin ultraäänikäsittely säästää merkittävästi aikaa lyhentämällä tarvittavan prosessiajan 12–24 tunnista muutamaan tuntiin. Lisäksi täydellisen muuntumisen saavuttamiseen tarvitaan vähemmän liuotinta, mikä vähentää käytetyn tai reagoimattoman liuottimen eli väkevän NaOH:n poistamisesta ja hävittämisestä aiheutuvia ympäristövaikutuksia.
Ultraäänikäsittely edistää kitiinin deasetylointia kitosaaniksi
UIP4000hdT – 4 kW:n ultraäänijärjestelmä
Kitosaanin ultraäänikäsittelyn toimintaperiaate
Suuritehoinen, matalataajuinen ultraäänikäsittely (∼20–26 kHz) synnyttää akustista kavitaatiota nesteissä ja lietteissä. Suuritehoinen ultraääni edistää kitiinin muuntumista kitosaaniksi, kun liuotin (esim. NaOH) pilkkoo kiinteitä kitiinihiukkasia ja tunkeutuu niihin, mikä kasvattaa pinta-alaa ja parantaa aineensiirtoa kiinteän ja nestemäisen faasin välillä. Lisäksi ultraäänikavitaation suuret leikkausvoimat synnyttävät vapaita radikaaleja, jotka lisäävät reagenssin (eli NaOH:n) reaktiivisuutta hydrolyysin aikana. Ei-termisenä käsittelymenetelmänä ultraäänikäsittely estää lämpöhajoamisen ja tuottaa korkealaatuista kitosaania. Ultraääni lyhentää kitiinin erottamiseen äyriäisistä tarvittavia käsittelyaikoja ja tuottaa puhtaampaa kitiiniä (ja siten myöhemmin myös kitosaania) kuin perinteiset käsittelyolosuhteet. Kitiinin ja kitosaanin tuotannossa ultraääni voi siten alentaa tuotantokustannuksia, lyhentää käsittelyaikaa, mahdollistaa tuotantoprosessin paremman hallinnan ja vähentää prosessijätteen ympäristövaikutuksia.
- Suurempi kitosaanisaanto
- Huippulaatu
- Lyhyempi käsittelyaika
- Alhaisempi prosessilämpötila
- Parempi tehokkuus
- Helppo ja turvallinen käyttö
- Ympäristöystävällinen
Kitiinin deasetylointi kitosaaniksi ultraäänellä – menetelmäohje
1) Valmistele kitiini:
Kun lähtömateriaalina käytetään ravunkuoria, kuoret tulee pestä perusteellisesti kaikkien liukoisten orgaanisten aineiden ja niihin tarttuneiden epäpuhtauksien, kuten maa-aineksen ja proteiinin, poistamiseksi. Tämän jälkeen kuorimateriaali on kuivattava kokonaan (esim. uunissa 60 ºC:ssa 24 h). Kuivatut kuoret jauhetaan (esim. vasaramyllyllä), niistä poistetaan proteiinit emäksisessä väliaineessa (esim. NaOH, jonka pitoisuus on 0,125–5,0 M) ja mineraalit hapossa (esim. laimeassa suolahapossa).
2) Ultraäänideasetylointi
Tyypillistä ultraäänideasetylointireaktiota varten beeta-kitiinihiukkaset (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspendoidaan 40 %:n (w/w) NaOH-vesiliuokseen siten, että beeta-kitiinin ja NaOH-vesiliuoksen suhde on 1/10(g mL-1), suspensio siirretään kaksiseinäiseen lasiseen dekantterilasiin ja käsitellään ultraäänellä Hielscherin UP400St ultraäänihomogenisaattorilla. Seuraavat parametrit (vrt. Fiamingo ym. 2016) pidetään vakioina kitiinin ultraäänideasetylointireaktion aikana: (i) ultraäänianturi (sonotrodi Hielscher S24d22D, kärjen halkaisija = 22 mm); (ii) ultraäänikäsittelyn pulssitila (IP = 0,5 s); (iii) ultraäänen pintaintensiteetti
(I = 52,6 W cm-2), (iv) reaktiolämpötila (60 ºC ±1 ºC), (v) reaktioaika (50 min), (vi) beeta-kitiinin massan ja 40 %:n (w/w) natriumhydroksidivesiliuoksen tilavuuden suhde (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) beeta-kitiinisuspension tilavuus (50 mL).
Ensimmäinen reaktio etenee 50 min jatkuvassa magneettisekoituksessa, minkä jälkeen se keskeytetään jäähdyttämällä suspensio nopeasti 0 ºC:seen. Tämän jälkeen lisätään laimeaa suolahappoa pH-arvon 8,5 saavuttamiseksi, ja näyte CHs1 erotetaan suodattamalla, pestään huolellisesti deionisoidulla vedellä ja kuivataan ympäristön olosuhteissa. Kun sama ultraäänideasetylointi toistetaan toisena vaiheena CHs1:lle, saadaan näyte CHs2.
Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvat (SEM) 100× suurennoksella: a) gladius, b) ultraäänikäsitelty gladius, c) β-kitiini, d) ultraäänikäsitelty β-kitiini ja e) kitosaani (lähde: Preto ym. 2017)
Fiamingo ym. havaitsivat, että beeta-kitiinin ultraäänideasetylointi tuottaa tehokkaasti suurimolekyylistä kitosaania, jonka asetylointiaste on alhainen, ilman lisäaineita, inerttiä kaasukehää tai pitkiä reaktioaikoja. Vaikka ultraäänideasetylointireaktio suoritetaan lievemmissä olosuhteissa – eli alhaisessa reaktiolämpötilassa useimpiin termokemiallisiin deasetylointeihin verrattuna. Beeta-kitiinin ultraäänideasetylointi mahdollistaa satunnaisesti deasetyloidun kitosaanin valmistamisen siten, että sen asetylointiaste vaihtelee (4 % ≤ DA ≤ 37 %), massakeskimääräinen molekyylimassa on suuri (900 000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1 200 000 g mol-1 ) ja dispersiteetti on alhainen (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4), suorittamalla kolme peräkkäistä reaktiota (50 min/vaihe) 60 ºC:ssa.
Suuritehoiset ultraääniprosessorit laboratorio-, pilotti- ja teollisuusmittakaavaan.
Suorituskykyiset ultraäänijärjestelmät kitosaanin tuotantoon
Kitiinin pilkkominen ja deasetylointi kitosaaniksi edellyttävät tehokkaita ja luotettavia ultraäänilaitteita, jotka tuottavat suuria amplitudeja, mahdollistavat prosessiparametrien tarkan säädön ja joita voidaan käyttää 24/7 suurella kuormituksella ja vaativissa ympäristöissä. Hielscher Ultrasonicsin tuotevalikoima vastaa sinun ja prosessisi tarpeisiin. Hielscherin ultraäänilaitteet ovat suorituskykyisiä järjestelmiä, jotka voidaan varustaa lisävarusteilla, kuten sonotrodeilla, amplitudivahvistimilla, reaktoreilla tai virtauskennoilla, jotta ne vastaavat prosessisi tarpeisiin optimaalisesti.
Digitaalinen värinäyttö, mahdollisuus määrittää ultraäänikäsittelyajot etukäteen, automaattinen tietojen tallennus sisäiselle SD-kortille, etäohjaus selaimella ja monet muut ominaisuudet takaavat korkeimman prosessinhallinnan ja käyttäjäystävällisyyden tason. Vankan rakenteensa ja suuren kuormituskestävyytensä ansiosta Hielscherin ultraäänijärjestelmät ovat luotettava työjuhtasi tuotannossa.
Kitiinin pilkkominen ja deasetylointi edellyttävät voimakasta ultraääntä tavoitellun muuntumisen ja korkealaatuisen lopullisen kitosaanituotteen saavuttamiseksi. Erityisesti kitiinihiutaleiden pilkkomisessa suuret amplitudit ja kohotetut paineet ovat ratkaisevia. Hielscher Ultrasonicsin teolliset ultraääniprosessorit tuottavat helposti erittäin suuria amplitudeja. Jopa 200 µm:n amplitudeja voidaan käyttää jatkuvasti 24/7. Vielä suurempia amplitudeja varten on saatavilla räätälöityjä ultraäänisonotrodeja. Hielscherin ultraäänijärjestelmien tehokapasiteetti mahdollistaa tehokkaan ja nopean deasetyloinnin turvallisessa ja käyttäjäystävällisessä prosessissa.
Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:
| Erätilavuus | Tilavuusvirta | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| 1–500 mL | 10–200 mL/min | UP100H |
| 10–2 000 mL | 20–400 mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20 L | 0,2–4 L/min | UIP2000hdT |
| 10–100 L | 2–10 L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10–100 L/min | UIP16000 |
| n.a. | suurempi | laiteryhmä: UIP16000 |
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Kirjallisuus ja lähteet
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Emulsiotekniikalla valmistetut kitosaanipohjaiset bionanokomposiittikalvot elintarvikkeiden säilyttämiseen. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Laajasti deasetyloitu suurimolekyylinen kitosaani beeta-kitiinin monivaiheisesta ultraääniavusteisesta deasetyloinnista. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Kitiinin sonokemiallisesti avustettu muuntaminen kitosaaniksi, USDA:n kansallisen tutkimusaloitteen päätutkijoiden kokous, New Orleans, LA, June 28th.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Lämpötilan vaikutus kitiinin deasetyloinnissa kitosaaniksi, kun esikäsittelynä käytetään suuri-intensiteettistä ultraääntä, Institute of Food Technologists -järjestön vuosikokous, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Suuri-intensiteettisen ultraäänen vaikutus kitiinin kitosaaniksi muuntumisen nopeuttamiseen, Institute of Food Technologists -järjestön vuosikokous, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladius ja sen johdannaiset laivadieselöljyn mahdollisina biosorbentteina. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22932–22939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): Menetelmä kitosaaninanohiukkasten ja -nanokuitujen valmistamiseen suurempaa materiaalia pilkkomalla. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Kitosaanin molekyylimassan tehokas pienentäminen suuri-intensiteettisellä ultraäänellä: taustalla oleva mekanismi ja käsittelyparametrien vaikutus. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112–5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Kala- ja äyriäisjäte: raaka-ainelähde kaupallisesti hyödynnettävien kitiini- ja kitosaanimateriaalien valmistamiseen. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Hyödyllistä tietoa
Miten kitiinin ultraäänideasetylointi toimii?
Kun suuritehoista, matalataajuista ultraääntä (esim. 20–26 kHz) kytketään nesteeseen tai lietteeseen, nesteeseen kohdistuu vuorottelevia korkean ja matalan paineen jaksoja, jotka aiheuttavat puristumista ja harvenemista. Näiden vuorottelevien korkean ja matalan paineen jaksojen aikana syntyy pieniä tyhjiökuplia, jotka kasvavat useiden painejaksojen kuluessa. Kun tyhjiökuplat eivät enää pysty absorboimaan lisää energiaa, ne luhistuvat rajusti. Kuplan luhistuessa syntyy paikallisesti erittäin voimakkaita olosuhteita: korkeita, jopa 5 000 K:n lämpötiloja, jopa 2 000 atm:n paineita, erittäin suuria kuumenemis- ja jäähtymisnopeuksia sekä paine-eroja. Koska kuplan luhistumisdynamiikka on nopeampaa kuin aineen- ja lämmönsiirto, luhistuvan ontelon energia rajoittuu hyvin pienelle alueelle, jota kutsutaan myös ”kuumaksi pisteeksi”. Kavitaatiokuplan luhistuminen aiheuttaa myös mikroturbulenssia, jopa 280 m/s:n nopeudella liikkuvia nestesuihkuja ja niistä johtuvia leikkausvoimia. Tätä ilmiötä kutsutaan ultraäänikavitaatioksi tai akustiseksi kavitaatioksi.
Nämä kavitaatiovoimat kohdistuvat ultraäänikäsitellyn nesteen pisaroihin ja hiukkasiin, ja kun kiihtyneet hiukkaset törmäävät toisiinsa, ne pirstoutuvat hiukkasten välisissä törmäyksissä. Akustinen kavitaatio on ultraäänijauhatuksen, dispergoinnin, emulgoinnin ja sonokemian toimintaperiaate.
Kitiinin deasetyloinnissa suuri-intensiteettinen ultraääni kasvattaa pinta-alaa aktivoimalla pintaa ja edistämällä aineensiirtoa hiukkasten ja reagenssin välillä.
Kitosaani
Kitosaani on muokattu, kationinen ja myrkytön hiilihydraattipolymeeri, jonka monimutkainen kemiallinen rakenne muodostuu pääkomponenttina olevista β-(1,4)-glukosamiiniyksiköistä (>80 %) ja N-asetyyliglukosamiiniyksiköistä (<20 %), jotka jakautuvat satunnaisesti pitkin ketjua. Kitosaania valmistetaan kitiinistä kemiallisella tai entsymaattisella deasetyloinnilla. Deasetylointiaste (DA) määrää rakenteen vapaiden aminoryhmien pitoisuuden, ja sitä käytetään kitiinin ja kitosaanin erottamiseen toisistaan. Kitosaani liukenee hyvin mietoihin liuottimiin, kuten laimennettuun etikkahappoon, ja siinä on useita vapaita amiiniryhmiä aktiivisina kohtina. Tämä antaa kitosaanille etuja kitiiniin nähden monissa kemiallisissa reaktioissa.
Kitosaania arvostetaan sen erinomaisen bioyhteensopivuuden ja biohajoavuuden, myrkyttömyyden, hyvän antimikrobisen aktiivisuuden (bakteereja ja sieniä vastaan), hapen läpäisemättömyyden ja kalvonmuodostusominaisuuksien vuoksi. Kitiiniin verrattuna kitosaanin etuna on vesiliukoisuus, mikä helpottaa sen käsittelyä ja käyttöä koostumuksissa.
Kitiini on selluloosan jälkeen toiseksi yleisin polysakkaridi, ja sen valtava saatavuus tekee siitä edullisen ja kestävän raaka-aineen.
Kitosaanin tuotanto
Kitosaania tuotetaan kaksivaiheisessa prosessissa. Ensimmäisessä vaiheessa raaka-aineesta, kuten äyriäisten kuorista (eli katkarapujen, rapujen ja hummerien kuorista), poistetaan proteiinit ja mineraalit ja se puhdistetaan kitiinin saamiseksi. Toisessa vaiheessa kitiiniä käsitellään vahvalla emäksellä (esim. NaOH) asetyylisivuketjujen poistamiseksi ja kitosaanin saamiseksi. Tavanomaisen kitosaanin tuotantoprosessin tiedetään olevan erittäin aikaa vievä ja kallis.
Kitiini
Kitiini (C8H13O5N)n on β-1,4-N-asetyyliglukosamiinin suoraketjuinen polymeeri, joka luokitellaan α-, β- ja γ-kitiiniksi. Glukoosin johdannaisena kitiini on niveljalkaisten, kuten äyriäisten ja hyönteisten, ulkoisten tukirankojen, nilviäisten raastinkielten, pääjalkaisten nokkien sekä kalojen ja lissamphibia-ryhmän sammakkoeläinten suomujen pääkomponentti, ja sitä esiintyy myös sienten soluseinissä. Kitiinin rakenne on verrattavissa selluloosaan, ja se muodostaa kiteisiä nanofibrillejä tai viiksikiteitä. Selluloosa on maailman yleisin polysakkaridi, ja kitiini on toiseksi yleisin.
Glukosamiini
Glukosamiini (C6H13NO5) on aminosokeri ja tärkeä lähtöaine glykosyloitujen proteiinien ja lipidien biokemiallisessa synteesissä. Glukosamiini on luonnossa runsaana esiintyvä yhdiste, joka kuuluu molempien polysakkaridien, kitosaanin ja kitiinin, rakenteeseen, mikä tekee glukosamiinista yhden yleisimmistä monosakkarideista. Suurin osa kaupallisesti saatavilla olevasta glukosamiinista tuotetaan hydrolysoimalla äyriäisten ulkoisia tukirankoja eli rapujen ja hummerien kuoria.
Glukosamiinia käytetään pääasiassa ravintolisänä glukosamiinisulfaatin, glukosamiinihydrokloridin tai N-asetyyliglukosamiinin muodossa. Glukosamiinisulfaattiravintolisiä annetaan suun kautta ruston tulehduksen, hajoamisen ja lopulta häviämisen aiheuttaman kivuliaan sairauden (nivelrikon) hoitoon.